Summary
Dit protocol beschrijft de kwantificering van volumetrische cerebrale hemodynamische variaties in het muizenbrein met behulp van functionele echografie (fUS). Procedures voor 3D functionele activeringskaart na sensorische stimulatie en functionele connectiviteit in rusttoestand worden gegeven als illustratieve voorbeelden, bij verdoofde en wakkere muizen.
Abstract
Functionele echografie (fUS) beeldvorming is een nieuwe beeldvormingsmodaliteit van de hersenen die afhankelijk is van de hoogsensitiviteitsmaat van het cerebrale bloedvolume dat wordt bereikt door ultrasnelle dopplerangiografie. Omdat hersenperfusie sterk verbonden is met lokale neuronale activiteit, maakt deze techniek het mogelijk om de hele hersenen 3D-mapping van taakgeïnduceerde regionale activering en functionele connectiviteit in rusttoestand, niet-invasief, met ongeëvenaarde spatio-temporele resolutie en operationele eenvoud. In vergelijking met fMRI (functional magnetic resonance imaging) bestaat een belangrijk voordeel van fUS imaging uit het mogelijk maken van een volledige compatibiliteit met wakkere en zich gedragende dierproeven. Bovendien blijft fMRI brain mapping bij muizen, het meest gebruikte preklinische model in de neurowetenschappen, technisch uitdagend vanwege de kleine omvang van de hersenen en de moeilijkheid om stabiele fysiologische omstandigheden te behouden. Hier presenteren we een eenvoudig, betrouwbaar en robuust protocol voor fUS-beeldvorming van de hele hersenen bij verdoofde en wakkere muizen met behulp van een kant-en-klaar commercieel fUS-systeem met een gemotoriseerde lineaire transducer, wat aanzienlijke corticale activering oplevert na sensorische stimulatie en reproduceerbaar 3D functioneel connectiviteitspatroon voor netwerkidentificatie.
Introduction
In de afgelopen twee decennia is neuroimaging een belangrijk hulpmiddel geworden voor het bestuderen van hersenfunctie en -organisatie, waardoor onderzoekers belangrijke ontdekkingen kunnen doen op het gebied van neurowetenschappen. Tegenwoordig is functionele magnetische resonantie beeldvorming (fMRI) de gouden standaard klinische neuroimaging-techniek geworden om taak- of geneesmiddel-opgeroepen hersenactivatie te beoordelen en functionele connectiviteit in rust in kaart te brengen. Hoewel menselijke fMRI een hoge betrouwbaarheid en gevoeligheid heeft, blijft muis fMRI om verschillende redenen technisch uitdagend1. Ten eerste heeft fMRI een slechte ruimtelijke en temporele resolutie. De kleine omvang van het muizenbrein vereist het gebruik van sterke magnetische velden met behulp van dure scanners om een redelijke ruimtelijke resolutie te bereiken. Ten tweede is het handhaven van stabiele fysiologische parameters binnen het smalle bereik waardoor efficiënte neuro-vasculaire koppeling mogelijk is, erg moeilijk bij verdoofde muizen. Ten slotte heeft het bloedzuurstofniveauafhankelijke (BOLD) signaal waarop fMRI-studies vertrouwen een relatief slechte gevoeligheid, wat leidt tot een lage signaal-ruisverhouding wanneer toegepast op muizen en vaak herhaalde stimuluspresentatie gedurende lange acquisitie vereist om kleine variaties te detecteren. Omdat de muis het meest gebruikte diermodel is in biomedisch preklinisch onderzoek, zijn deze beperkingen deels verantwoordelijk voor de translationele kloof in de neuropsychiatrie, waardoor nieuwe veelbelovende therapeutische doelen op de bank kunnen worden omgezet in effectieve behandelingen aan het bed.
Functionele echografie (fUS) is een recent ontwikkelde neuroimaging techniek op basis van ultrasnelle doppler2. Door direct het cerebrale bloedvolume te bemonsteren, maakt deze techniek het mogelijk om hersenactiviteit in realtime te onderzoeken via de neurovasculaire koppeling. In vergelijking met andere neuroimaging-technieken levert fUS een ruimtelijke resolutie op van 100 μm en een temporele resolutie in de tientallen milliseconden. Deze techniek maakt beeldvorming van de hele hersenen mogelijk van volledige coronale delen van het muizenbrein, volledig niet-invasief. Bovendien is het volledig compatibel met bewuste en zich gedragende dieren3,4,5. Een van de belangrijkste huidige beperkingen van fUS is de 2D-functie, waardoor tegelijkertijd een enkel coronaal vlak kan worden opgenomen. Hoewel volumetrische 3D fUS met behulp van 2D matrix array transducers al met succes is aangetoond bij ratten6 en bevestigd bij muizen7,vereist het huidige gebrek aan gevoeligheid een volledige craniotomie en een gemiddeld aantal onderzoeken om een lichte verandering van activiteit te detecteren. Als alternatief kunnen lineaire transducers over meerdere posities worden getrapt en functionele beeldvorming vlak voor vliegtuig uitvoeren om de hele hersenen te bedekken. Deze techniek vereist echter tal van experimentele paradigmaherhalingen en als zodanig lange acquisitietijden (3-4 uur voor het muizenbrein)8,9.
In het huidige werk beschrijven we een robuust experimenteel platform, waaronder een commercieel beschikbare functionele ultrasone scanner en een snelle vlak-schakelende lineaire transducer met procedures om 3D fUS-gegevens te verkrijgen in verdoofde en wakkere muizen, waardoor volumetrische en transcraniële functionele mapping van de muizenhersenen mogelijk is, niet-invasief, zonder contrastmiddel en binnen korte acquisitietijden. We illustreren deze functie door somatosensorische cortexactivatie na snorrestimulatie en functionele connectiviteit in rusttoestand in kaart te brengen. Naast diervoorbereiding en gegevensverzameling beschrijven we ook de procedure voor visualisatie, atlasregistratie en analyse van real-time fUS-signalen.
Protocol
Alle hier gepresenteerde procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap van 22 september 2010 (010/63/UE) en onze lokale ethische commissie (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale nummer 59, 'Paris Centre et Sud', project #2017-23). Volwassen muizen (mannetje C57BL/6 Rj, leeftijd 2-3 maanden, 20-30 g, uit Janvier Labs, Frankrijk) werden gehuisvest 4 per kooi met een 12u licht/donker cyclus, constante temperatuur bij 22 °C en voedsel en water ad libitum. Vóór het begin van de experimenten krijgen dieren een minimale acclimatisatieperiode van een week aan de huisvestingsomstandigheden.
1. Diervoorbereiding voor verdoofde fUS-beeldvorming
- Anesthesie
- Weeg de muis.
- Bereid een mengsel van ketamine en xylazine met respectievelijk 10 mg / ml en 2 mg / ml in steriele zoutoplossing. Dien 0,2 ml ketamine/xylazine-oplossing intraperitoneaal toe met een naald van 26 gauge en een wegwerpspuit van 1 ml. Plaats het dier na een paar minuten op het stereotaxische frame en zorg ervoor dat het hoofd plat is.
- Dien een tweede volume anesthetica toe om een totale dosis van 100 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine te bereiken (rekening houdend met de aanvangsdosis).
OPMERKING: Anesthesie moet 1 uur duren. Om een stabiele sedatie gedurende langere tijd te behouden, injecteert u elke 30 minuten intraperitoneaal 0,05 ml van het ketamine/xylazinemengsel.
-
Diervoorbereiding voor verdoofde beeldvormingssessie
- Breng wat oogzalf (bijv. Ocry-Gel) aan op de ogen van de muis om cataractvorming tijdens de beeldvormingssessie te voorkomen. Scheer de muizenkop met een trimmer. Breng wat ontharingscrème aan en spoel na een paar minuten af. Herhaal dit totdat het haar volledig is verwijderd.
- Plaats subcutane pinnen in de ledematen voor opname van elektrocardiogram (ECG). Plaats gecentrifugeerde ultrasone gel (1500 rpm, 5 min) op het hoofd.
- Controleer de diepte van de anesthesie tijdens de volledige duur van de experimenten (inclusief anesthesie-inductie). Houd de temperatuur van de dieren op 37 °C door gebruik te maken van een verwarmingsdeken gekoppeld aan een rectale sonde.
- Controleer de volgende fysiologische parameters die indirecte indicatoren zijn van de diepte van de anesthesie: hartslag (220-250 slagen per minuut - bewaakt door het elektrocardiogram dunne elektroden die subcutaan zijn geïmplanteerd) en ademhalingsfrequentie (130-140 ademhalingen per minuut - bewaakt met behulp van een spirometer die is aangesloten op het ECG-acquisitiesysteem).
OPMERKING: Een beschrijving van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1: Experimentele opstelling voor verdoofde fUS-experimenten. Beschrijving van de experimentele opstelling met alle wetenschappelijke apparatuur die nodig is tijdens een verdoofd experiment. 1. Fysiologische monitoring: live weergave van zowel ademhalings- als hartfrequenties. 2. Vierassige motormodule (drie vertalingen en één rotatie) bewaakt door Iconeus One-systeem (9) en maakt het mogelijk om transcraniële 3D-tomografische scans of 4D-acquisities uit te voeren. 3 bis. Servomotor die de whisker stimulator (3b.) Aandrijft De servomotor wordt bestuurd door een arduino uno-kaart die is gekoppeld aan het Iconeus One-systeem (9) om stimulatiepatronen te synchroniseren met beeldvormingssequenties. 4.a. Spuitpomp controller. 4.b. Spuithouder. 5.a. Temperatuurplaatmonitor die de verwarmingsplaat regelt. 5.b. Verwarmingsplaat en rectale thermometer gekoppeld aan de temperatuurplaatmonitor(5.a.). 6. Ultrasone gel geplaatst tussen het hoofd van het dier en de ultrasone sonde, waardoor akoestische koppeling tussen hen wordt geboden. 7. 15 MHz ultrasone sonde. 8. Sondehouder die de sonde(7)verbindt met de motormodule(2). 9. Iconeus One apparatuur en software, waardoor verschillende beeldvormingssequenties kunnen worden programmeren en de motormodule(2)de sonde kan worden aansturen(7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Diervoorbereiding voor experimenten met wakkere muizen met het hoofd
- Hoofdplaat chirurgie
- Plaats het verdoofde dier (stappen 1.1-1.2) in het stereotaxische frame op een verwarmingskussen (37 °C). Breng beschermende gel aan voor de ogen en dien lidocaïne s.c. (0,2 ml, 2%) toe onder de hoofdhuid met behulp van een naald van 26 gauge en wacht een paar minuten.
OPMERKING: Controleer het anesthesieniveau elke 10-30 minuten door reactie (afwezigheid van) op een stevige teenknijp. - Voer een incisie uit na de sagittale hechting van achter het achterhoofdsbeen naar het begin van het neusbeen. Snijd met behulp van een chirurgische schaar de huid over beide hemisferen.
- Reinig de schedel met 1% jodiumoplossing en verwijder eventueel achtergebleven botvlies. Gebruik de kopplaat als sjabloon en boor twee gaten (1 mm diameter) in de schedel om de verankeringsschroeven te positioneren.
LET OP: Zorg ervoor dat u niet volledig door de schedel boort om hersenbeschadiging of dura-ontsteking te voorkomen - Plaats de kopplaat met de schroeven. Gebruik tandcement om de schroeven en de kopplaat aan de voorkant en achterkant van het frame te bevestigen om een goede grip op het implantaat te behouden.
LET OP: Pas op dat u geen cement in het kozijnraam aanbrengt, omdat dit de signaalkwaliteit sterk vermindert. Bedek de schedel met een dunne laag chirurgische lijm om het bot te beschermen en de wonden aan de zijkant van het beeldvormingsvenster af te sluiten. - Verwijder het dier uit het stereotaxische frame nadat het cement droog is en draai de anesthesie om door een subcutane injectie van atipamezol bij 1 mg / kg. Een profylactische toediening van meloxicam (5 mg/kg/dag, s.c.) wordt toegediend voor postoperatieve pijn.
- Plaats het dier in een herstelkooi op een verwarmingskussen (37 °C). De muis kan zijn thuiskooi met nestgenoten binnen een paar uur teruggeven. Plaats een magnetische 3D-geprinte dop (polyactic acid materiaal met magneetinzetstukken) over de kopplaat ter bescherming(Figuur 2A). Laat de muis 4 tot 6 dagen herstellen voor het begin van de gewenning aan de stacaravankooi (MHC).
OPMERKING: Het totale gewicht van de dop en de kopplaat is 2,8 g.
- Plaats het verdoofde dier (stappen 1.1-1.2) in het stereotaxische frame op een verwarmingskussen (37 °C). Breng beschermende gel aan voor de ogen en dien lidocaïne s.c. (0,2 ml, 2%) toe onder de hoofdhuid met behulp van een naald van 26 gauge en wacht een paar minuten.
- Hanteren en gewenning
- Houd op dag 1 na herstel (PR) de muis meerdere keren per dag 5-10 minuten voorzichtig in de hand.
- Herhaal op dag 2 PR de behandeling zoals op dag 1 en laat het dier 5-10 minuten vrij MHC verkennen.
OPMERKING: Het afspelen van wat achtergrondmuziek in de kamer kan helpen de stress van dieren te verminderen. - Laat het dier op dag 3 PR de MHC 5-10 minuten vrij verkennen. Pak daarna voorzichtig de kopplaat vast en plaats deze voorzichtig in de klem, waarbij u handmatig de koolstofkooi beweegt om de muis te begeleiden. Wen het dier gedurende 5-10 minuten in de hoofdfixeerde positie. Reinig de MHC tussen de trainingssessies door met 70% ethanoloplossing en spoel af met kraanwater.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de MHC een voldoende luchtstroom krijgt zoals aanbevolen door de fabrikant. De hoogte van de kopklem moet handmatig worden aangepast om een comfortabele positie te bieden. - Op dag 4 en 5 PR, klem de muis MHC herhaaldelijk vast en verhoog geleidelijk de hoofd-vaste tijd, beginnend van 5 min en tot 30 min. Breng wat zoutoplossing en ultrasone gel aan op het beeldvormingsvenster om te wennen.
- Herhaal op dag 6 PR het protocol vanaf dag 4/5 PR en plaats de sonde boven het hoofd van het dier na stap 3.1.
- Ga op de dag van het experiment verder zoals hierboven beschreven. Bevochtig vervolgens het beeldvormingsvenster met zoutoplossing en breng wat ultrasone gel aan. Start het volgen van het dier en ga verder met de sondepositionering (zie hieronder).
OPMERKING: Het klemmen van de MHC kan ook worden gedaan door de muis in een doek te wikkelen. In dat geval moeten muizen gewend zijn aan de verpakkingsprocedure vóór hoofdfixatie. Een beschrijving van een volledige experimentele opstelling voor wakkere beeldvorming is te vinden in figuur 2B.
Figuur 2: Experimentele opstelling voor wakkere fUS-experimenten. Een. Schematische illustratie van de magnetische afdekking van de kopplaat die het beeldvenster beschermt (gemaakt met BioRender.com). Tijdens beeldvormingssessies (links) wordt de hoes verwijderd om de hersenen te scannen in het grote diafragma dat de hoofdplaat biedt. B. Foto van de experimentele opstelling voor transcraniële wakkere beeldvorming in hoofd-gefixeerde vrij gedragende muizen. 1. Iconeus One-systeem en software, waardoor verschillende beeldsequenties kunnen worden ingesteld en de motormodule kan worden bestuurd. 2. Vierassige motorenmodule (drie vertalingen en één rotatie) bewaakt door Iconeus One-systeem (1) en maakt 3D-tomografische scans of 4D-acquisities mogelijk. 3. Lucht doseertafel. 4. Stacaravan Kooi (MHC). 5a,5b. Foto's die een beter zicht geven op de omgeving van het dier in de MHC. 6. Hoofdfixatiesysteem dat de kopplaat klemt. 7. Sondehouder die de sonde verbindt met de motormodule (2). 8. 15 MHz ultrasone sonde. 9. Ultrasone gel geplaatst tussen de muiskop en de ultrasone sonde, waardoor akoestische koppeling tussen hen. 10. Servomotor die de snorharenstimulator aandrijft. De servomotor wordt bestuurd door een Arduino Uno-kaart die via het TTL-signaal (1) is gekoppeld aan het Iconeus One-systeem om stimulatiepatronen te synchroniseren met beeldsequenties. C. Illustratie van de verschillende ruimtelijke bemonsteringsmogelijkheden (gemaakt met BioRender.com): in elk geval wordt de sonde van de eerste naar de laatste positie getrapt en wordt op elke positie een Doppler-beeld opgenomen om het gestapelde volume te reconstrueren. Dit proces wordt gedurende de gehele acquisitietijd continu herhaald. Dichte scan (links): de stap tussen de segmenten moet klein genoeg zijn (meestal 400 μm, wat overeenkomt met de elevatieresolutie) om volumetrische beeldvorming mogelijk te maken. Sparse Scan (rechts): als verre functionele gebieden worden getarget (op verschillende posities), is het ook mogelijk om ruimtelijke bemonstering te verminderen om verschillende segmenten in beeld te brengen die deze gebieden kruisen zonder afbreuk te doen aan de temporele bemonstering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Sonde positionering
- Start de software (bijv. IcoScan) en maak een experimentsessie. Ga naar het menu Probe verplaatsen om de positie van de ultrasone sonde aan te passen met behulp van het navigatietoetsenbord.
OPMERKING: De sonde moet ongeveer 1 mm boven het hoofd van het dier worden geplaatst. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de sonde in contact komt met ultrasone gel voordat u een beeldsequentie start. - Start de Live View-acquisitie en pas indien nodig de positie van de sonde aan via real-time beeldvorming van het dierlijke CBV (cerebraal bloedvolume). Lijn de hersenen uit in het midden van het beeld. Optimaliseer de beeldparameters om de hoogste signaal-ruisverhouding vast te leggen.
OPMERKING: In experimenten met wakkere muizen moet de diafragmagrootte worden verkleind om artefacten veroorzaakt door laterale spiercontractie te voorkomen.
4. Angiografische scan en atlasregistratie
- Open de Angio 3D-optie in de acquisitiesoftware. Pas op het vooraf ingestelde paneel de scanparameters (eerste segment, laatste segment en stapgrootte) aan om de hele hersenen te scannen(figuur 3A,B)en start de acquisitie.
OPMERKING: Zorg er bij het instellen van de scanparameters voor dat de scan het achterste deel van de hersenen bedekt - Laat de acquisitiesoftware open en start de software voor data-analyse en visualisatie (bijv. IcoStudio) en laad de angio 3D-scan. Navigeer door het acquisitievolume met behulp van het paneel met 3 weergaven en selecteer de coronale scanrichting:antero-posterior of postero-anterior.
- Ga naar het Brain Registration Panel. Laad de muisverwijzingssjabloon die nodig is voor het registratieproces. Registreer de scan op het Allen Mouse Common Coordinates Framework met behulp van de volautomatische of handmatige registratiemodi(Figuur 3C).
- Controleer het resultaat door te kijken naar de superpositie van de angio 3D-scan en de referentiesjabloon of door te kijken naar de superpositie van de scan en de Allen-referentieatlas met behulp van het Atlas Manager-paneel (Figuur 3D). Sla de registratie op als een BPS-bestand.
OPMERKING: Het registratiebestand kan opnieuw worden gebruikt voor elke andere acquisitie die tijdens dezelfde experimentsessie wordt uitgevoerd.
5. Brain Positioning System (BPS)
- Controleer in de IcoStudio-software of de angiografische scan en het BPS-bestand (gegenereerd in stap 4.4)zijn geladen.
- Ga naar het hersennavigatiepaneel. Navigeer in het deelvenster Atlas Manager door de allen-hersenatlas van de muis met de bovenliggende/onderliggende boomnavigator. Zoek de anatomische doelgebieden en selecteer ze om ze in de 3 weergaven op uw scan te richten.
- Visualiseer de doelgebieden in het deelvenster met 3 weergaven en kies een afbeeldingsvlak dat de doelgebieden voor het experiment overlapt. Om dit te doen, stelt u handmatig twee markeringen in op de coronale positie die de interessegebieden bevat.
- Klik op Brain Positioning System (BPS) om de resulterende motorische coördinaten te extraheren. Deze coördinaten komen overeen met de positie van de sonde die het mogelijk maakt om het beoogde vlak in beeld te brengen. Controleer het voorbeeld van de afbeelding die is berekend op basis van de angio-scan.
- Ga in de IcoScan-software naar het paneel Probe-positionering en klik op BPS-coördinaten invoeren. Pas de coördinaten toe die in stap 5.4 zijn opgegeven. De sonde beweegt en lijnt uit op het beoogde beeldvormingsvlak.
- Voer een live view acquisitie uit en controleer of het huidige beeldvlak overeenkomt met de voorspelling in stap 5.4.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om parasagittale/niet-orthogonale vlakken te selecteren.
Figuur 3: Snelle transcraniële angiografische scan en hersenregistratie voor nauwkeurige sondepositionering. Een. Schematische weergave van het muizenbrein dat transraniaal wordt gescand door de ultrasone sonde van de eerste coronale plak (groen) tot de laatste coronale plak (blauw) tijdens een snelle angiografische scan. Het huidige afgebeelde plakje (weergegeven in rood) beweegt stap voor stap van de achterkant (groen) naar de voorkant (blauw) van de hersenen. Gemaakt met BioRender.com B. Screenshot van IcoScan acquisitie software in het Angio 3D paneel. De vooraf ingestelde parameters aan de rechterkant configureren de snelle scan. De posities in mm van de eerste plak, de laatste plak en de stapgrootte moeten goed worden gekozen om lineair de hele hersenen te scannen. C. Screenshot van de IcoStudio-verwerkingssoftware. De snelle Angio 3D-scan wordt automatisch geregistreerd op een referentiesjabloon van het muizenbrein. De drie-weergaven (links) tonen de superpositie van de vasculatuur en het muizenbrein Allen atlas in de coronale, sagittale en axiale weergaven. D. Lineaire lay-out (montage) van 16 plakjes (van de 31) uit de 3D-angioscan, met de geregistreerde Allen-referentieatlas bovenop de vasculatuur. E. Screenshot van het Brain Navigation-paneel met het voorspelde beeldvormingsvlak dat overeenkomt met de motorcoördinaten die door de software zijn berekend dankzij de twee markers die in het midden van de linker en rechter primaire somatosensorische cortex zijn geplaatst, het gebied van de loopvelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Taak-opgeroepen experiment: snorharenstimulatie
- Bepaal vooraf de stimulatievolgorde, inclusief de tijd van stimulatie, interstimulatietijd en het aantal herhalingen.
- Voer een 3D fUS-reeks uit door de totale tijd van acquisitie, het aantal posities en de dode tijd tussen posities te definiëren. In het geval van automatische stimulatie gesynchroniseerd met het acquisitiesysteem via TTL-ingang, selecteert u de Trig-IN-optie voordat u met de acquisitie begint.
OPMERKING: Voor de resultaten die in dit werk werden gepresenteerd, werd stimulatie toegediend met behulp van wattenstaafje dat zo was geplaatst dat de meeste snorharen in de dorsale / ventrale richting werden afgebuigd. Het werd bevestigd op een servomotor aangedreven door een Arduino UNO-kaart, gekoppeld aan het Iconeus One-systeem om synchronisatie te garanderen. De aanbevolen parameters voor stimulatie zijn 30 s AAN, 30 s UIT, amplitude van 20° en 4 Hz frequentie. Als alternatief kan de stimulatie ook handmatig worden toegediend door de snorharen op de gedefinieerde tijden tijdens de acquisitie af te buigen. - Open de acquisitie in IcoStudio-software en ga naar het menu Activeringskaart. Vul het veld met activeringspatroon met begin- en eindtijden en bereken de activeringskaart. Pas de weergaveparameters voor visualisatie aan. Exporteer de activeringstoewijzing als een .h5-bestand voor off-line analyse.
OPMERKING: Activering wordt geschat met behulp van een gegeneraliseerde lineaire model (GLM) benadering met de stimulus geconvolveerd door een standaard muis hemodynamische respons (HRF). Als alternatief kan activering direct worden gevisualiseerd door de Pearson-correlatie tussen het stimulatiepatroon en het hemodynamische signaal van elke voxel te schatten.
7. 4D functionele connectiviteit
- Voer een 3D fUS-reeks uit door de totale tijd van acquisitie, het aantal posities van het beeldvlak en de dode tijd tussen posities te definiëren.
OPMERKING: Voor functionele 4D-connectiviteit raden we acquisitietijd aan tussen elk volume < 2,5 s (bemonsteringsfrequentie van ten minste 0,4 Hz) en een totale acquisitietijd van ten minste 10 minuten (aantal tijdstippen > 180). - Sla de acquisitie op en laad deze in de IcoStudio-software. Laad indien nodig het .bps-bestand en het allenmuisbreincoördinaatraamwerk. Selecteer in de Atlasmanagerregio's van de atlas als regio's van belang (ROI).
- Ga naar het menu Functionele connectiviteit en selecteer de gewenste regio's in de ROI-manager. Visualiseer de resultaten als connectiviteitsmatrix (supervised analysis) of seed-based correlation map (unsupervised). Selecteer en pas de bandbreedtefilters naar wens aan en exporteer correlatieresultaten voor statistische analyse.
OPMERKING: In de 3D fUS-beeldvormingsmodus worden de relatieve tasterposities handmatig ingesteld. Daarom zijn er twee soorten scans mogelijk en kunnen ze worden gekozen afhankelijk van de functionele toepassing: dichte scans versus schaarse scans(figuur 2C).
Representative Results
Dit protocol beschrijft de 3D-kwantificering van cerebrale hemodynamische variaties transcaraniaal in het muizenbrein, in rust of als reactie op sensorische stimulatie. Whisker-stimulatie, een standaardparadigma om functionele activering van de hersenen bij knaagdieren in kaart te brengen, is geselecteerd als een voorbeeld van sensorische stimulatie-opgeroepen respons. Figuur 4 toont een representatieve activeringskaart als reactie op mechanische snorharstimulatie in een verdoofde muis verkregen met behulp van transcraniële fUS-beeldvorming. De totale proeftijd was 760 s, met een baseline van 60 s (voor en na de stimulatie), een stimulatie van 80 s en een hersteltijd van 60 s, 5x herhaald. Significante activering werd bepaald met de resolutie van een algemeen lineair model (GLM) met behulp van een standaard muis hemodynamische responsfunctie (HRF). De geactiveerde gebieden (Z-scores met p-waarde >0,0000006 na strenge Bonferroni-correctie voor meervoudige vergelijking) worden weergegeven als kleurgecodeerde waarden die over de Allen common coordinate framework-sjabloon zijn gelegd. Voxel-wise tijdsverloop van de contralaterale primaire somatosensorische cortex, barrel field region (S1BF) onthulde een toename van 15-20% van de CBV in vergelijking met baseline.
Figuur 4: Transcraniële activering Kaarten en rCBV-tijdsverloop na snorharenstimulatie in ketamine/xylazine verdoofde muis. Een. Activeringskaart met significant geactiveerde voxels na mechanische stimulatie van de juiste snorharen (80 s AAN, 60 s UIT, 5x) onder ketamine/xylazine-anesthesie. Kaarten werden verkregen door Z-scores te berekenen op basis van algemene lineaire modelanalyse (GLM) met Bonferroni-correctie voor meervoudige vergelijking. Z-scores (kleurgecodeerd) worden over de Allen brain 3D-sjabloon gelegd (na registratie met het hersenpositioneringssysteem) en weergegeven in drie weergaven: coronaal (links), sagittale (midden) en axiale (rechts). Anatomische gebieden uit het gemeenschappelijke coördinatenkader van de hersenen van de Allen-muis worden ter referentie weergegeven. Geactiveerde voxels bevinden zich goed in de linker S1BF-cortex. Schaalbalk: 1 mm. Elk monstervolume werd gescand over 2,8 mm (overeenkomend met 7 plakjes in de elevatierichting) in 3,85 s, waardoor 20 volumische monsters tijdens elke functionele respons konden worden geregistreerd. B. 3D-weergave van whiskerstimulatie-opgeroepen relatieve cerebrale bloedvolume (rCBV) toename in vergelijking met het uitgangsniveau. De anatomische afbakening van de S1BF wordt in blauw aangegeven. C. Tijdsloop van CBV-variaties in de linker S1BF (blauw) en de bijbehorende toegepaste stimulus (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hetzelfde paradigma is toegepast in een hoofd-gefixeerde muis in de stacaravancage met behulp van de wakkere preset van IcoScan. Figuur 5 toont de activeringskaart na een multipel snorharenstimulatie-experiment met behulp van de experimentele opstelling beschreven in figuur 2. Enkele achterste en caudale snorharen werden gestimuleerd met het volgende patroon: 30 s baseline gevolgd door vijf opeenvolgende proeven van 30 s ON (4 Hz) en 30 s OFF(Figuur 5C). Stimulatie werd geleverd met behulp van een servomotor aangedreven door een Arduino UNO-kaart die de beeldacquisitievolgorde voor synchronisatie triggerde. Significante activering werd bepaald met de resolutie van een algemeen lineair model (GLM) met behulp van een standaard muis hemodynamische responsfunctie (HRF). Meervoudige vergelijkingscorrectie werd uitgevoerd met de Bonferroni-methode. Conventioneel alfaniveau van 0,05 werd genormaliseerd door het totale aantal voxels in het acquisitievolume, wat resulteerde in een uiteindelijke strenge drempel van 0,000003.
Figuur 5: Activatiekaarten en rCBV-tijdsverloop na snorharenstimulatie bij wakker gedragende muis. Een. Activeringskaart met aanzienlijk geactiveerde voxels na mechanische stimulatie van de juiste snorharen (30 s AAN, 30 s UIT, 5x) in een wakkere muis in de stacaravancaire. Kaarten werden verkregen door Z-scores te berekenen op basis van algemene lineaire modelanalyse (GLM) met Bonferroni-correctie voor meervoudige vergelijking (normalisatie door het totale aantal voxels). Z-scores (kleurgecodeerd) worden over de Allen brain 3D-sjabloon gelegd (na registratie met het Brain Positioning System) en weergegeven in drie weergaven: coronaal (links), sagittale (midden) en axiale (rechts). Anatomische gebieden uit het Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework worden ter referentie weergegeven. Geactiveerde voxels bevinden zich goed in de linker S1BF-cortex. Schubtstaven, 1 mm. Elk monstervolume werd gescand over 1,6 mm (overeenkomend met 3 plakjes in de elevatierichting) in 3,85 s, waardoor 17 volumische monsters tijdens elke functionele respons konden worden geregistreerd. B. 3D-weergave van snorharenstimulatie-opgeroepen relatieve cerebrale bloedvolume (rCBV) toename in vergelijking met het uitgangsniveau. De anatomische afbakening van de S1BF wordt in blauw aangegeven. C. Illustratie van de muis in de stacaravan tijdens het juiste snorharenstimulatie-experiment, waarbij vijf 30 s-proeven werden uitgevoerd voor een totale acquisitietijd van 330 s. D. Ogenblikkelijke relatieve CBV-tijdsverloop geëxtraheerd binnen het geactiveerde gebied (blauw), met de bijbehorende stimulus bovenop elkaar (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 toont de temporele correlaties van genormaliseerde laagfrequente (<0,2 Hz) spontane CBV-fluctuaties tussen 3D-hersengebieden (geïdentificeerd uit registratie tot het Allen common coordinate framework) in een ketamine-xylazine verdoofde muis. De totale acquisitietijd was 20 min (1200 s). Atlas-supervised analyse onthulde sterke interhemisferische connectiviteitspatronen, met resulterende correlatiecoëfficiëntwaarden tot 0,8. Zaadgebaseerde analyse in de dorsale hippocampus onthulde een significante interhemisferische connectiviteit tussen de rechter- en linker hippocampus, evenals diepe retro-hippocampusgebieden en piriforme cortices. Een zaadgebied geselecteerd in de S1BF resulteerde ook in een symmetrisch (corticocorticaal) correlatiepatroon, zoals eerder beschreven.
Figuur 6: Transcraniële volumetrische rusttoestand functionele connectiviteit van het muizenbrein onder ketamine/xylazine-anesthesie beoordeeld op een 20 min 3D fUS acquisitie. Een. Correlatiematrix op basis van 3D-regio's van het Allen common coordinate framework geregistreerd op de transcraniële functionele acquisitie. De matrix wordt verkregen door de genormaliseerde Pearson-correlatie van spontane laagfrequente fluctuaties (<0,1 Hz) van de gemiddelde tijdsignalen van alle voxels die zijn opgenomen in elke geïdentificeerde ROI na slice timingcorrectie te berekenen. Elk bemonsterd volume werd gescand over 1,6 mm in de hoogterichting (overeenkomend met 4 plakjes) verkregen over 2,2 s. B. Op zaden gebaseerde analyse geprojecteerd op een 3D-sjabloon. Het zaad werd geselecteerd in de rechter dorsale hippocampus op β - 2,1 mm. Correlatiekaart wordt verkregen door de Pearson Correlation-coëfficiënt te berekenen tussen de temporele signalen van het zaad en elke voxel van de hele acquisitie na correctie van de slice timing. C. 3D-correlatiekaart op basis van zaadgebaseerde analyse met zaadgebied geselecteerd binnen de S1BF op β - 2,1 mm. Schaalbalken: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Beeldvormingsmethoden voor de hele hersenen zijn cruciale hulpmiddelen om de hersenfysiologie en pathologie beter te begrijpen. De hier beschreven methode maakt de nauwkeurige kwantificering van hemodynamische signalen in het levende brein direct op de bank mogelijk. De ongeëvenaarde gevoeligheid en spatio-temporele resolutie van functionele echografie is bijzonder geschikt voor de fysiologie van de muis. Functionele responsen en rusttoestandnetwerken kunnen binnen korte acquisitietijden in kaart worden gebracht, longitudinaal en zonder dat er gemiddeld proeven of proefpersonen hoeven te worden uitgevoerd om een betrouwbare meting te verkrijgen. De relevante combinatie van ultrasoon lineaire sondes met hoge gevoeligheid en snelle gemotoriseerde opstellingen stelt iemand in staat om transcraniële volumetrische fUS-beeldvorming bij muizen uit te voeren binnen redelijke acquisitietijden. Dit protocol kan worden uitgevoerd op verdoofde of wakkere muizen met behulp van een kooi voor stacaravans.
Whisker-stimulatie, de sensorische stimulus die in dit manuscript als illustratief voorbeeld wordt gebruikt, is een standaard functioneel activeringsparadigma bij knaagdieren en een betrouwbare uitlezing om sensorische verwerking, neurovasculaire koppeling en hun veranderingen5,6,10,11te bestuderen. Hoewel grof handmatig borstelen van de snorharen de voorkeur kan hebben vanwege het gebruiksgemak, mist deze methode ruimtelijke en temporele precisie. Het gebruik van een automatische stimulator, zoals die hier wordt beschreven, geactiveerd met de fUS-beeldvormingsscanner, zorgt voor een betere controle van verschillende parameters, waaronder het tijdstip van aanvang, de amplitudeverplaatsing, de frequentie en de hoek van de Q-tip / kam, wat resulteert in een betere reproduceerbaarheid tussen dieren. Bovendien maakt een nauwkeurigere timing van stimulatie de modellering van de hemodynamische responsfunctie (HRF) mogelijk door de tijd tot aanvang en de tijd tot piekparameters te bepalen12,13. Om een betere precisie te garanderen op het aantal snorharen dat tijdens de stimulatie wordt afgebogen (en dus het gebied van het geactiveerde gebied), kunnen meer geavanceerde stimulatoren aan dit protocol worden aangepast. Veel andere stimuli zoals licht8,geluid14 of geurpresentatie15 kunnen met hetzelfde protocol worden geïmplementeerd.
De compatibiliteit van functionele echografie met wakkere en zich gedragende dieren is een belangrijk voordeel in vergelijking met andere neuroimaging-technieken, waardoor functionele activeringskartering mogelijk is zonder de anesthesiebias. Het gebruik van een luchtgelifte stacaravan is een goed alternatief voor andere bestaande hoofdvaste apparaten zoals lineaire of bolvormige loopbanden. Hoewel de beweging van de homecage stevig op het hoofd is, geeft het de muis de illusie om door de omgeving te navigeren, waardoor een breed scala aan gedragstests kan worden gekoppeld aan fUS-beeldvorming16. De gewenningsprocedure voor hoofdfixatie is echter een belangrijke stap om stress te verminderen, vooral voor experimenten waarbij het als een verstorende factor kan worden beschouwd. De hier beschreven procedure (6 dagen hanteren en gewenning aan hoofdfixatie) geeft robuuste resultaten voor sensorische stimulatie en functionele connectiviteit in rusttoestand. Het kan echter nodig zijn om de gewenningsperiode te verlengen voor meer verfijnde gedragstests17.
Disclosures
Jeremy Ferrier en Bruno-Félix Osmanski zijn medewerkers van Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski en Mickael Tanter zijn medeoprichters en aandeelhouders van Iconeus.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de European Research Council (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, het National Agency for Research funding 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), de Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, de ElfUS technische kern van de IPNP, Inserm U1266, het Europese onderzoeksprogramma FUSIMICE van het Human Brain Project en EMBO Short-Term Fellowship 8439 aan Andrea Kliewer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M.
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
