Summary
Denne protokol beskriver kvantificeringen af volumetriske cerebrale hæmodynamiske variationer i musehjernen ved hjælp af funktionel ultralyd (fUS). Procedurer for 3D funktionel aktivering kort efter sensorisk stimulation samt hvile-tilstand funktionel forbindelse leveres som illustrative eksempler, i bedøvede og vågne mus.
Abstract
Funktionel ultralyd (fUS) billeddannelse er en ny hjerne imaging modalitet, der er afhængig af den høje følsomhed måling af cerebral blod volumen opnået ved ultrahurtig doppler angiografi. Da hjerneperfusion er stærkt forbundet med lokal neuronal aktivitet, tillader denne teknik hele hjernens 3D-kortlægning af opgaveinduceret regional aktivering samt hviletilstand funktionel forbindelse, ikke-invasivt, med uovertruffen spatio-temporal opløsning og operationel enkelhed. Sammenlignet med fMRI (funktionel magnetisk resonansbilleddannelse) består en af de største fordele ved fUS-billeddannelse i at muliggøre en fuldstændig kompatibilitet med vågen og opfører dyreforsøg. Desuden er fMRI hjernekortlægning hos mus, den mest anvendte prækliniske model i Neuroscience, fortsat teknisk udfordrende på grund af hjernens lille størrelse og vanskeligheden ved at opretholde stabile fysiologiske forhold. Her præsenterer vi en enkel, pålidelig og robust protokol for helhjerne fUS-billeddannelse i bedøvede og vågne mus ved hjælp af et off-the-shelf kommercielt fUS-system med en motoriseret lineær transducer, der giver betydelig kortikal aktivering efter sensorisk stimulering samt reproducerbar 3D funktionel forbindelsesmønster til netværksidentifikation.
Introduction
I løbet af de sidste to årtier er neuroimaging blevet et vigtigt redskab til at studere hjernefunktion og organisation, hvilket gør det muligt for forskere at gøre vigtige opdagelser inden for neurovidenskab. I dag er funktionel magnetisk resonansbilleddannelse (fMRI) blevet guldstandard klinisk neuroimaging teknik til at vurdere opgave eller lægemiddel-fremkaldt hjerne aktivering og til at kortlægge funktionelle tilslutningsmuligheder i hvile. Mens human fMRI har høj pålidelighed og sensibilitet, mus fMRI forbliver teknisk udfordrende af mange grunde1. For det første har fMRI en dårlig rumlig og tidsmæssig opløsning. Den lille størrelse af musehjernen kræver brug af stærke magnetfelter ved hjælp af dyre scannere for at opnå en rimelig rumlig opløsning. For det andet er det meget vanskeligt at opretholde stabile fysiologiske parametre inden for det smalle område, der muliggør effektiv neuro-vaskulær kobling hos bedøvede mus. Endelig har det iltafhængige signal (BOLD) i blodet, som fMRI-undersøgelser er afhængige af, relativt dårlig følsomhed, hvilket fører til lavt signal-til-støj-forhold, når det påføres mus og kræver ofte gentagen stimuluspræsentation over lang erhvervelse for at opdage små variationer. Musen er den mest udbredte dyremodel i biomedicinsk præklinisk forskning, disse begrænsninger er delvis ansvarlige for det translationelle hul i neuropsykiatri, hvilket hindrer nye lovende terapeutiske mål på bænken, der skal omsættes til effektive behandlinger på sengen.
Funktionel ultralyd (fUS) er en nyligt udviklet neuroimaging teknik baseret på ultrahurtig doppler2. Ved direkte at prøve cerebral blodvolumen tillader denne teknik sondering af hjerneaktivitet i realtid gennem neurovaskulær kobling. Sammenlignet med andre neuroimaging teknikker, fUS giver en rumlig opløsning på 100 μm og en tidsmæssig opløsning i snesevis af millisekunder. Denne teknik tillader hel-hjerne billeddannelse af komplette koronar dele af musen hjernen, helt ikke-invasivt. Desuden er det fuldt kompatibelt med bevidste og opfører dyr3,4,5. En af de vigtigste nuværende begrænsninger ved fUS er dens 2D-funktion, der gør det muligt at optage et enkelt koronarfly på samme tid. Mens volumetriske 3D fUS ved hjælp af 2D matrix array transducere allerede er blevet påvist med succes hos rotter6 og bekræftet i mus7, kræver dens nuværende mangel på følsomhed en fuld kraniotomi samt i gennemsnit et stort antal forsøg for at opdage en lille ændring af aktiviteten. Alternativt kan lineære transducere trædes på tværs af flere positioner og udføre funktionel billeddannelsesplan for plan for at dække hele hjernen. Denne teknik kræver dog mange eksperimentelle paradigmegentagelser og som sådan lange erhvervelsestider (3-4 timer for musehjernen)8,9.
I dette arbejde beskriver vi en robust eksperimentel platform, herunder en kommercielt tilgængelig funktionel ultralydsscanner og en hurtig planskift lineær transducer med procedurer for at erhverve 3D fUS-data i bedøvede og vågne mus, hvilket giver volumetrisk og transkraniel funktionel kortlægning af musehjernen, ikke-invasivt, uden kontrastmiddel og inden for korte erhvervelsestider. Vi illustrerer denne funktion ved at kortlægge somatosensorisk cortex aktivering efter whisker stimulation samt hvile-tilstand funktionel forbindelse. Bortset fra dyreforberedelse og dataindsamling beskriver vi også proceduren for visualisering, atlasregistrering og analyse af realtids fUS-signaler.
Protocol
Alle de procedurer, der præsenteres her, er blevet gennemført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs Råds direktiv af 22. september 2010 (010/63/UE) og vores lokale etiske komité (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', projekt #2017-23). Voksne mus (han C57BL/6 Rj, alder 2-3 måneder, 20-30 g, fra Janvier Labs, Frankrig) blev opstaldet 4 pr bur med en 12h lys / mørk cyklus, konstant temperatur ved 22 ° C og mad og vand ad libitum. Før begyndelsen af forsøgene får dyrene en minimumsperiode på mindst en uge til boligforholdene.
1. Animalsk forberedelse til bedøvet fUS-billeddannelse
- Anæstesi
- Vej musen.
- Der fremstilles en blanding af ketamin og xylazin ved henholdsvis 10 mg/mL og 2 mg/mL i steril saltvand. 0,2 mL af ketamin/xylazinopløsningen intraperitonealt ved hjælp af en 26 gauge nål og 1 mL engangssprøjte. Efter et par minutter skal dyret placeres på den stereotaxiske ramme og sørge for, at hovedet er fladt.
- Giv et andet volumen bedøvelsesmiddel for at nå en samlet dosis på 100 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin (under hensyntagen til den første dosis).
BEMÆRK: Anæstesi skal vare i 1 time. For at opretholde en stabil sedation i længere tid skal 0,05 mL af ketamin/xylazinblandingen injiceres hvert 30. minut intraperitonealt.
-
Forberedelse af dyr til bedøvet billeddannelse
- Påfør noget øjensalt (f.eks. Ocry-Gel) på museøjnene for at undgå grå stærdannelse under billeddannelsen. Barber musehovedet ved hjælp af en trimmer. Påfør nogle depilatory creme og skyl efter et par minutter. Gentag indtil håret er helt fjernet.
- Sæt subkutane stifter i lemmerne til elekdiogram (EKG) optagelse. Placer centrifugeret ultralydgel (1500 omdr./min., 5 min) på hovedet.
- Monitor dybden af anæstesi under den komplette varighed af eksperimenterne (anæstesi induktion inkluderet). Dyrenes temperatur skal holdes ved 37 °C ved hjælp af et varmetæppe, der er koblet til en rektalsonde.
- Overvåg følgende fysiologiske parametre, som er indirekte indikatorer for anæstesidybden: Puls (220-250 slag i minuttet - overvåget gennem elektrokardiogrammet tynde elektroder implanteret subkutant) og åndedrætsfrekvens (130-140 vejrtrækninger i minuttet - overvåget ved hjælp af et spirometer tilsluttet EKG-anskaffelsessystemet).
BEMÆRK: En beskrivelse af forsøgsopsætningen er afbildet i figur 1.
Figur 1: Eksperimentel opsætning af bedøvede fUS-eksperimenter. Beskrivelse af forsøgsopsætningen, der viser alt det videnskabelige udstyr, der er nødvendigt under et bedøvet forsøg. 1. Fysiologisk overvågning : levende visning af både åndedræts- og hjertefrekvenser. 2. Fireakset motormodul (tre oversættelser og en rotation), der overvåges af Iconeus One-systemet (9), og som gør det muligt at udføre transkraniale 3D-tomografiske scanninger eller 4D-erhvervelser. 3a. Servo-Motor, der driver whiskerstimulatoren (3b.) Servomotoren styres af et arduino uno-kort, der er grænsefladet med Iconeus One-systemet (9) for at synkronisere stimuleringsmønstre med billedsekvenser. 4.a. Sprøjtepumpe controller. 4.b. Sprøjteholder. 5.a. Temperaturplademonitor, der styrer varmepladen. 5.b. Varmeplade og rektaltermometer, der er grænsefladet med temperaturplademonitoren (5.a.). 6. Ultralydsgel placeret mellem dyrets hoved og ultralydsonden, hvilket giver akustisk kobling mellem dem. 7. 15 MHz ultralydsonde. 8. Sondeholder, der forbinder sonden (7) med motormodulet (2). 9. Iconeus Et udstyr og software, der gør det muligt at programmere forskellige billedsekvenser og styre motormodulet (2), der driver sonden (7). Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Dyreforberedelse til vågen hoved-fast mus eksperimenter
- Hovedpladekirurgi
- Bedøvet dyr (trin 1.1-1.2) placeres i den stereotaxiske ramme på en varmepude (37 °C). Påfør beskyttende gel til øjnene og giv lidokain s.c. (0,2 mL, 2 %) under hovedbunden huden ved hjælp af en 26-gauge nål og vent et par minutter.
BEMÆRK: Overvåg anæstesi niveau hver 10-30 min ved svar (fravær af) til en fast tå knivspids. - Udfør et snit efter sagittal sutur bag occipital knoglen til begyndelsen af næsebenet. Ved hjælp af kirurgisk saks, punktafgifter huden over begge halvkugler.
- Rengør kraniet med 1% jodopløsning og fjern eventuelle resterende periosteum. Brug hovedpladen som skabelon til at bore to huller (1 mm i diameter) i kraniet for at placere forankringsskruerne.
FORSIGTIG: Pas på ikke at bore helt gennem kraniet for at undgå hjerneskader eller durabetændelse - Placer forpladen med skruerne. Brug tandcement til at fastgøre skruerne og hovedpladen foran og bag i rammen for at bevare godt greb om implantatet.
FORSIGTIG: Pas på ikke at anvende cement inde i rammevinduet, da det i høj grad mindsker signalkvaliteten. Dæk kraniet med et tyndt lag kirurgisk lim for at beskytte knoglen og forsegle sårene på siden af billedvinduet. - Fjern dyret fra den stereotaksiske ramme, når cementen er tør, og vend anæstesi ved en subkutan injektion af atipamezole ved 1 mg/kg. En profylaktisk administration af meloxicam (5 mg/kg/dag, s.c.) administreres for postoperative smerter.
- Anbring dyret i et bjærgningsbur på en varmepude (37 °C). Musen kan returnere sit hjemmebur med littermates inden for få timer. Placer et magnetisk 3D-printet hætte (polyaktisk syremateriale med magnetindsatser) over hovedpladen for beskyttelse (Figur 2A). Lad musen komme sig i 4 til 6 dage før begyndelsen af habituationen til det mobile hjemmebur (MHC).
BEMÆRK: Hætten og hovedpladens samlede vægt er 2,8 g.
- Bedøvet dyr (trin 1.1-1.2) placeres i den stereotaxiske ramme på en varmepude (37 °C). Påfør beskyttende gel til øjnene og giv lidokain s.c. (0,2 mL, 2 %) under hovedbunden huden ved hjælp af en 26-gauge nål og vent et par minutter.
- Håndtering og tilvænning
- På dag 1 efter opsving (PR), forsigtigt holde musen i hånden i 5-10 min flere gange om dagen.
- På dag 2 PR gentages håndteringen som i dag 1 og lad dyret stå i 5-10 minutter på at udforske frit MHC.
BEMÆRK: At afspille noget baggrundsmusik i rummet kan hjælpe med at reducere dyrets stress. - På dag 3 PR, lad dyret frit udforske MHC i 5-10 min. Derefter skal du forsigtigt gribe hovedpladen og forsigtigt placere den i klemmen og manuelt flytte kulburet til at ledsage musen. Habituate dyret i hoved-fast position i 5-10 min. Rengør MHC mellem træningssessioner med 70% ethanolopløsning og skyl med postevand.
BEMÆRK: Sørg for, at MHC modtager en tilstrækkelig luftstrøm som anbefalet af producenten. Hovedklemmens højde skal justeres manuelt for at give en behagelig position. - På dag 4 og 5 PR skal du gentagne gange klemme musen MHC og gradvist øge den hovedfaste tid, startende fra 5 min og op til 30 min. Påfør nogle saltvand og ultralyd gel på billeddannelse vinduet for at habituate.
- På dag 6 PR gentages protokollen fra dag 4/5 PR, og sonden placeres over dyrets hoved efter trin 3.1.
- På dagen for eksperimentet, fortsæt som beskrevet ovenfor. Derefter befugte billeddannelsesvinduet med saltvand og anvende nogle ultralyd gel. Start sporingen af dyret og fortsæt til sonden positionering (se nedenfor).
BEMÆRK: Fastspænding i MHC kan også gøres ved at pakke musen ind i en klud. I så fald skal mus vænnes til indpakningsproceduren før hovedfiksering. En beskrivelse af en komplet eksperimentel opsætning for vågen billeddannelse findes i figur 2B.
Figur 2: Eksperimentel opsætning for vågne fUS-eksperimenter. En. Skematisk illustration af det magnetiske dæksel med hovedpladen, der beskytter billedvinduet (oprettet med BioRender.com). Under billeddannelse sessioner (venstre), dækslet fjernes for at scanne hjernen i den store blænde, der tilbydes af hovedpladen. B. Fotografi af den eksperimentelle opsætning for transkranial vågen billeddannelse i hovedfaste frit opførende mus. 1. Iconeus Et system og software, der gør det muligt at oprette forskellige billedsekvenser og styre motormodulet. 2. Fireakset motormodul (tre oversættelser og en rotation), der overvåges af Iconeus One-systemet (1), og tillader 3D-tomografiske scanninger eller 4D-erhvervelser. 3. Luftudsentningsbord. 4. Mobile Home Cage (MHC). 5a,5b. Fotografier, der viser et nærmere syn på dyrets miljø inde i MHC. 6. Hovedfikseringssystem fastspænding af hovedpladen. 7. Sondeholder, der forbinder sonden med motormodulet (2). 8. 15 MHz ultralydsonde. 9. Ultralydsgel placeret mellem musehovedet og ultralydsonden, hvilket giver akustisk kobling mellem dem. 10. Servo-Motor kører whisker stimulator. Servo-Motor styres af et Arduino Uno-kort, som er forbundet med Iconeus One-systemet via TTL-signal (1) for at synkronisere stimuleringsmønstre med billedsekvenser. C. Illustration af de forskellige rumlige prøvetagningsmuligheder (skabt med BioRender.com): I hvert enkelt tilfælde er sonden trådt fra den første position til den sidste, og et Doppler-billede registreres på hver position for at rekonstruere den stablede volumen. Denne proces gentages løbende i hele anskaffelsestiden. Tæt scanning (venstre): Trinnet mellem udsnit skal være lille nok (typisk 400 μm, hvilket svarer til elevationsopløsningen) til at tillade volumetrisk billeddannelse. Sparsom scanning (højre): Hvis fjerne funktionelle områder er rettet mod (mod forskellige positioner), er det også muligt at reducere rumlig prøveudtagning til billede forskellige udsnit, der skærer disse regioner uden at gå på kompromis med den tidsmæssige prøvetagning. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Sonde positionering
- Start softwaren (f.eks. IcoScan), og opret en eksperimentsession. Gå til menuen Flyt sonde for at justere placeringen af ultralydsonden ved hjælp af navigationstastaturet.
BEMÆRK: Sonden skal placeres ca. 1 mm over dyrets hoved. Det er afgørende at sikre, at sonden er i kontakt med ultralydgel, før du starter en billedsekvens. - Start Live View erhvervelse og justere sonde position, hvis det er nødvendigt via realtid billeddannelse af dyret CBV (cerebral blod volumen). Juster hjernen i midten af billedet. Optimer billedparametrene for at registrere det højeste signal-til-støj-forhold.
BEMÆRK: I vågen mus eksperimenter, blænde størrelse skal reduceres for at undgå artefakter induceret af laterale muskler sammentrækning.
4. Angiografisk scanning og atlasregistrering
- Åbn Angio 3D-indstillingen i anskaffelsessoftwaren. Juster scanningsparametrene (første udsnit, sidste udsnit og trinstørrelse) på det forudindstillede panel for at scanne hele hjernen (Figur 3A, B) og starte anskaffelsen.
BEMÆRK: Når scanningsparametrene konfigureres, skal du sørge for, at scanningen dækker den bageste del af hjernen - Lad anskaffelsessoftwaren være åben, og start softwaren til dataanalyse og visualisering (f.eks. IcoStudio), og lad angio 3D-scanningen indlæses. Naviger gennem anskaffelsesvolumen ved hjælp af panelet med 3 visninger, og vælg Coronal Scan Direction: antero-posterior eller postero-anterior.
- Gå til brain registration panel. Indlæs den musereferenceskabelon, der skal bruges til registreringsprocessen. Registrer scanningen på Allen Mouse Common Coordinates Framework ved hjælp af de fuldautomatiske eller manuelle registreringstilstande (Figur 3C).
- Kontroller resultatet ved at se på angio 3D-scanningens og referenceskabelonens superposition eller ved at se på scanningens superposition og Allen-referenceatlaset ved hjælp af Atlas Manager-panelet (Figur 3D). Gem registreringen som en .bps-fil.
BEMÆRK: Registreringsfilen kan genbruges til enhver anden anskaffelse, der udføres under den samme eksperimentsession.
5. Hjernen Positionering System (BPS)
- I IcoStudio-softwaren skal du kontrollere, at den angiografiske scanning og dens .bps-fil (genereret i trin 4.4)indlæses.
- Gå til brain navigation panel. Naviger gennem muse-hjerneatlaset med navigatoren af forældre/barnetræ i Atlas Manager-panelet. Find de anatomiske målrettede områder, og vælg dem for at overlejre dem til din scanning i 3-visninger.
- Visualiser de målrettede områder i 3-visningspanelet, og vælg et billedplan, der overlapper de målrettede områder for eksperimentet. Det gør du ved manuelt at indstille to markører på den koronarposition, der omfatter de interesseområder.
- Klik på Brain Positioning System (BPS) for at udtrække de resulterende motorkoordinater. Disse koordinater svarer til sondepositionen, som gør det muligt at afbilde det målrettede plan. Kontroller forhåndsvisningen af det billede, der beregnes ud fra angioscanningen.
- Angiv sondepositionspanelet i IcoScan-softwaren, og klik på Indtast BPS-koordinater. Anvende de koordinater, der er angivet i trin 5.4. Sonden bevæger sig og justerer på det målrettede billedplan.
- Udfør en live view-anskaffelse, og kontroller, at det aktuelle billedplan svarer til den forudsigelse, der blev givet i trin 5.4.
BEMÆRK: Det er også muligt at vælge parasagittal/non orthogonal fly.
Figur 3: Hurtig transkranial angiografisk scanning og hjerneregistrering for præcis sondepositionering. En. Skematisk repræsentation af musehjernen, der scannes transcranially af ultralydsonden fra den første koronar skive (grøn) til den sidste koronar skive (blå) under en hurtig angiografisk scanning. Den aktuelle afbildede skive (repræsenteret i rødt) bevæger sig trin for trin fra bagsiden (grøn) til den forreste (blå) af hjernen. Oprettet med BioRender.com B. Skærmbillede af IcoScan erhvervelse software i Angio 3D-panelet. De forudindstillede parametre til højre konfigurerer hurtigscanningen. Positionerne i mm af den første skive, den sidste skive og trinstørrelsen skal være velvalgte til at scanne lineært hele hjernen. C. Skærmbillede af IcoStudio-behandlingssoftwaren. Den hurtige Angio 3D-scanning registreres automatisk til en referenceskabelon for musehjernen. De tre-visninger (venstre) viser superpositionen af vaskulaturen og musehjernen Allen atlas i koronar, sagittal og aksiale synspunkter. D. Lineær lay-out (montage) af 16 skiver (ud af 31) fra 3D angio scanning, med den registrerede Allen reference atlas overlejret på vaskulaturen. E. Skærmbillede af Brain Navigation panel viser den forudsagte billedbehandling plan svarende til motoren koordinater beregnet af softwaren takket være de to markører placeret i midten af venstre og højre primære somatosensoriske cortex, tønde felter region. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Opgave-fremkaldt eksperiment: whisker stimulation
- Prædefine stimulation sekvens, herunder tidspunktet for stimulering, inter-stimulation tid og antallet af gentagelser.
- Kør en 3D fUS-sekvens ved at definere det samlede anskaffelsestidspunkt, antallet af positioner samt dødtid mellem positioner. I tilfælde af automatisk stimulering synkroniseret med anskaffelsessystemet via TTL-input skal du vælge Trig-IN-indstillingen, før anskaffelsen påbegyndes.
BEMÆRK: For de resultater, der præsenteres i dette arbejde, blev stimulering leveret ved hjælp af vatpind placeret, således at afbøjning af de fleste af whiskers i ryg/ventral retning. Det blev fastgjort på en servo-motor drevet af en Arduino UNO kort, knyttet til Iconeus One system for at sikre synkronisering. De anbefalede parametre for stimulering er 30 s ON, 30 s OFF, amplitude på 20° og 4 Hz frekvens. Alternativt kan stimuleringen også leveres manuelt ved at aflede whiskers på de definerede tidspunkter under erhvervelsen. - Åbn anskaffelsen i IcoStudio-software, og angiv menuen Aktiveringskort. Udfyld feltet aktiveringsmønster med start- og sluttidspunkter, og beregn aktiveringsoversigten. Juster visningsparametrene til visualisering. Eksporter aktiveringstilknytningen som en .h5-fil til offlineanalyse.
BEMÆRK: Aktivering estimeres ved hjælp af en generel GLM-tilgang (Linear Model) med stimulusen, der er indviklet af en standardmushæmodynamisk respons (HRF). Alternativt kan aktivering visualiseres direkte ved at estimere Pearson korrelationen mellem stimuleringsmønsteret og det hæmodynamiske signal fra hver voxel.
7. 4D-funktionsforbindelse
- Kør en 3D fUS-sekvens ved at definere det samlede anskaffelsestidspunkt, antallet af billedplanpositioner samt dødtid mellem positioner.
BEMÆRK: For 4D-funktionsforbindelse anbefaler vi anskaffelsestid mellem hver volumen < 2,5 s (prøveudtagningsfrekvens på mindst 0,4 Hz) og en samlet anskaffelsestid på mindst 10 min (antal tidspunkter > 180). - Gem købet og læg det i IcoStudio-softwaren. Hvis det er nødvendigt, skal du indlæse .bps-filen og Allen-musens hjernekoordinatramme. Vælg områder i atlasset i Atlas managersom interesseområder .
- Angiv menuen Funktionel forbindelse, og vælg de ønskede områder i ROI Manager. Visualiser resultaterne som forbindelsesmatrix (overvåget analyse) eller frøbaseret korrelationskort (uden opsyn). Vælg og juster båndbreddefiltrene efter ønske, og eksporter korrelationsresultater til statistisk analyse.
BEMÆRK: I 3D fUS-billedtilstand indstilles de relative sondepositioner manuelt. Derfor er to typer scanninger mulige og kan vælges afhængigt af den funktionelle applikation: tætte scanninger versus sparsomme scanninger (Figur 2C).
Representative Results
Denne protokol beskriver 3D kvantificering af cerebral hæmodynamiske variationer transcranially i musehjernen, i hvile eller som reaktion på sensorisk stimulation. Whisker stimulation, et standardparadigme til at kortlægge hjernens funktionelle aktivering hos gnavere, er blevet valgt som et eksempel på sensorisk stimulation-fremkaldt respons. Figur 4 viser et repræsentativt aktiveringskort som reaktion på mekanisk whiskerstimulering i en bedøvet mus, der er opnået ved hjælp af transkranial fUS-billeddannelse. Den samlede prøveperiode var 760 s, med en 60 s baseline (før og efter stimulering), en 80 s stimulation og en 60 s restitutionstid, gentages 5x. Signifikant aktivering blev bestemt med opløsningen af en generel lineær model (GLM) ved hjælp af en standardmushæmodynamisk responsfunktion (HRF). De aktiverede områder (Z-scorer med p-værdi >0,0000006 efter streng Bonferroni-korrektion til flere sammenligninger) vises som farvekodede værdier, der er overlejret på den fælles Allen-koordinatstrukturskabelon. Voxel-klog tidsforløb af den kontralaterale primære somatosensoriske cortex, tønde felt region (S1BF) afslørede en 15-20% stigning i CBV i forhold til baseline.
Figur 4: Transkranial aktivering Kort og rCBV-tidsforløb efter whiskers stimulation i ketamin/xylazin anæstesimus. En. Aktiveringskort, der viser signifikant aktiverede voxels efter mekanisk stimulering af de rigtige whiskers (80 s ON, 60 s OFF, 5x) under ketamin / xylazine anæstesi. Kort blev opnået ved computing Z-scores baseret på generel lineær model analyse (GLM) med Bonferroni korrektion for flere sammenligning. Z-scores (farvekodet) er overlejret på Allen hjernen 3D skabelon (efter registrering med hjernen positionering system) og vises i tre-visninger: koronar (venstre), sagittal (midten) og aksial (højre). Anatomiske områder fra Allen mus hjernen fælles koordinat rammer vises til reference. Aktiverede voxels er godt placeret inde i venstre S1BF cortex. Vægtstang: 1 mm. Hvert prøvevolumen blev scannet over 2,8 mm (svarende til 7 skiver i højderetningen) i 3,85 s, hvilket gjorde det muligt at registrere 20 volumiske prøver under hvert funktionelt respons. B. 3D rendering af whisker stimulation-fremkaldt relativ cerebral blod volumen (rCBV) stigning i forhold til baseline niveau. Den anatomiske afgrænsning af S1BF er angivet med blåt. C. Tidsforløb af CBV variationer i venstre S1BF (blå) og den tilsvarende stimulus anvendes (rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Det samme paradigme er blevet anvendt i en hoved-fast opfører mus i den mobile homecage ved hjælp af vågen forudindstillet af IcoScan. Figur 5 præsenterer aktiveringskortet efter et multipelstimuleringseksperiment ved hjælp af den eksperimentelle opsætning, der er beskrevet i figur 2. Et par bageste og kaukasiske knurhår blev stimuleret med følgende mønster: 30 s baseline efterfulgt af fem på hinanden følgende forsøg på 30 s ON (4 Hz) og 30 s OFF (Figur 5C). Stimulation blev leveret ved hjælp af en servo-motor drevet af en Arduino UNO kort udløser billedet erhvervelse sekvens til synkronisering. Signifikant aktivering blev bestemt med opløsningen af en generel lineær model (GLM) ved hjælp af en standardmushæmodynamisk responsfunktion (HRF). Der blev udført flere sammenligningskorrektioner med Bonferroni-metoden. Konventionelt alfaniveau på 0,05 blev normaliseret med det samlede antal voxels i anskaffelsesvolumen, hvilket resulterede i en endelig streng tærskel på 0,000003.
Figur 5: Aktiveringskort og rCBV-tidsforløb efter whiskers stimulation i vågen adfærdsmus. En. Aktiveringskort, der viser signifikant aktiverede voxels efter mekanisk stimulering af de rigtige whiskers (30 s ON, 30 s OFF, 5x) i en vågen mus i den mobile homecage. Kort blev opnået ved computing Z-scores baseret på generel lineær model analyse (GLM) med Bonferroni korrektion for flere sammenligning (normalisering med det samlede antal voxels). Z-scores (farvekodet) er overlejret på Allen hjernen 3D skabelon (efter registrering med Brain Positioning System) og vises i tre-visninger: koronar (venstre), sagittal (midten) og aksial (højre). Anatomiske områder fra Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework vises som reference. Aktiverede voxels er godt placeret inde i venstre S1BF cortex. Vægtstænger, 1 mm. Hvert prøvevolumen blev scannet over 1,6 mm (svarende til 3 skiver i højderetningen) i 3,85 s, hvilket gjorde det muligt at registrere 17 volumiske prøver under hvert funktionelt respons. B. 3D rendering af whisker stimulation-fremkaldt relative Cerebral Blood Volume (rCBV) stigning i forhold til baseline niveau. Den anatomiske afgrænsning af S1BF er angivet med blåt. C. Illustration af musen i mobile homecage under højre whisker stimulation eksperiment, hvor fem 30 s forsøg blev udført for en samlet erhvervelse tid på 330 s. D. Øjeblikkelig relativ CBV-tidskurs udvundet inde i det aktiverede område (blå), med den tilsvarende stimulus overlejret (rød). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 viser de tidsmæssige korrelationer af normaliseret lavfrekvent (<0,2 Hz) spontane CBV-udsving mellem 3D-hjerneområder (identificeret fra registrering til Allen fælles koordinatramme) i en ketamin-xylazin anæstesificeret mus. Den samlede anskaffelsestid var 20 min. (1200 s). Atlas-overvåget analyse afslørede stærke interhemisfæriske konnektivitetsmønstre med deraf følgende korrelationskoefficientværdier op til 0,8. Frøbaseret analyse i den dorsale hippocampus afslørede en betydelig interhemisfærisk forbindelse mellem højre og venstre hippocampus samt dybe retro-hippocampale regioner og piriform cortices. Et frøområde udvalgt i S1BF resulterede også i et symmetrisk (kortiko-kortikale) korrelationsmønster, som tidligere beskrevet.
Figur 6: Transkranial volumetrisk hviletilstand funktionel forbindelse af musehjernen under ketamin/xylazine anæstesi vurderet på en 20 min 3D fUS erhvervelse. En. Korrelationsmatrix baseret på 3D-regioner i Allens fælles koordinatramme, der er registreret på den transkranielle funktionelle erhvervelse. Matrixen opnås ved at beregne den normaliserede Pearsons korrelation af spontane lavfrekvente udsving (<0,1 Hz) af de gennemsnitlige tidssignaler fra alle voxels inkluderet i hver identificeret ROI efter skive timing korrektion. Hver prøvevolumen blev scannet over 1,6 mm i højderetningen (svarende til 4 skiver), der blev anskaffet over 2,2 s. B. Frøbaseret analyse projiceret på en 3D-skabelon. Frøet blev valgt inden for højre dorsale hippocampus ved β - 2,1 mm. Korrelation kort opnås ved beregning af Pearson Korrelation koefficient mellem de tidsmæssige signaler af frøet og hver voxel af hele erhvervelsen efter skive timing korrektion. C. 3D korrelationskort baseret på frøbaseret analyse med frøområde valgt inden for S1BF ved β - 2,1 mm. Skalalinjer: 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Hele hjernebilleddannelsesmetoder er afgørende værktøjer til bedre at forstå hjernens fysiologi og patologi. Den metode, der er beskrevet her, muliggør præcis kvantificering af hæmodynamiske signaler i den levende hjerne direkte på bænken. Den uovertruffen følsomhed og spatio-tidsmæssige opløsning af funktionel ultralyd er særligt velegnet til musens fysiologi. Funktionelle reaktioner og hvile-state netværk kan kortlægges inden for korte erhvervelse gange, langsgående og uden at skulle gennemsnitlige forsøg eller forsøgspersoner for at opnå en pålidelig foranstaltning. Den relevante kombination af høj følsomhed ultralyd lineære sonder og hurtigt motoriserede opsætninger gør det muligt at udføre transkranial volumetrisk fUS imaging i mus inden for rimelige erhvervelsestider. Denne protokol kan udføres enten på bedøvede eller vågne mus ved hjælp af et mobilt bur.
Whisker stimulation, den sensoriske stimulus, der bruges som et illustrerende eksempel i dette manuskript, er et standard funktionelt aktiveringsparadigme hos gnavere og en pålidelig udlæsning til undersøgelse af sensorisk behandling, neurovaskulær kobling og deres ændringer5,6,10,11. Mens grov manuel børstning af whiskers kan foretrækkes for sin brugervenlighed, mangler denne metode rumlig og tidsmæssig præcision. Brugen af en automatisk stimulator, som den, der er beskrevet her udløst med fUS-billedscanneren, giver mulighed for en bedre kontrol af flere parametre, herunder tidspunktet for debut, amplitudforskydningen, frekvensen samt vinklen på Q-tip / kammen, hvilket resulterer i en bedre reproducerbarhed mellem dyr. Derudover muliggør en mere præcis stimuleringstidspunkt modellering af den hæmodynamiske responsfunktion (HRF) ved at bestemme tiden til debut og tid til at toppe parametre12,13. For at sikre bedre præcision på antallet af whiskers afbøjet under stimuleringen (og dermed området i det aktiverede område), kan mere sofistikerede stimulatorer tilpasses denne protokol. Mange andre stimuli såsom lys8, lyd14 eller lugt præsentation15 kan implementeres ved hjælp af den samme protokol.
Kompatibiliteten af funktionel ultralyd med vågen og opfører dyr er en vigtig fordel i forhold til andre neuroimaging teknikker, muliggør funktionel aktivering kortlægning uden anæstesi bias. Brug af en luft-løftet mobile homecage er et godt alternativ til andre eksisterende hoved-fast apparat såsom lineære eller sfæriske løbebånd. Mens den er fast hovedfast, giver bevægelsen af homecage musen illusionen til at navigere i miljøet, så en bred vifte af adfærdsmæssige test kan kobles til fUS-billeddannelse16. Imidlertid udgør bosætningsproceduren til hovedfastsættelse et vigtigt skridt til at mindske stress, især for eksperimenter, hvor det kan betragtes som en forvirrende faktor. Proceduren beskrevet her (6-dages håndtering og habituation til hovedfiksering) giver robuste resultater for sensorisk stimulation og hviletilstand funktionel forbindelse. Det kan dog være nødvendigt at forlænge habituationsperioden for mere raffinerede adfærdstest17.
Disclosures
Jeremy Ferrier og Bruno-Félix Osmanski er ansatte i Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski og Mickael Tanter er medstiftere og aktionærer i Iconeus.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, Det Nationale Agentur for Forskningsmidler »Pinch« (ANR-18-CE37-005), Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, ElfUS' tekniske kerne i IPNP, Inserm U1266, det europæiske forskningsprogram FUSIMICE of the Human Brain Project og EMBO Short-Term Fellowship 8439 til Andrea Kliewer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M.
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
