Prøveforberedelse til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er en betydelig flaskehals i strukturbestemmelsesarbejdsgangen for denne metode. Her giver vi detaljerede metoder til brug af en brugervenlig, tredimensionelt trykt blok til fremstilling af støttefilm for at stabilisere prøver til transmission EM-undersøgelser.
Strukturbestemmelse ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er hurtigt vokset i det sidste årti; Prøveforberedelsen er dog fortsat en betydelig flaskehals. Makromolekylære prøver er ideelt afbildet direkte fra tilfældige retninger i et tyndt lag glasagtig is. Men mange prøver er ildfaste til dette, og protein denaturering på luft-vand interface er et fælles problem. For at overvinde sådanne problemer, støtte film-herunder amorf kulstof, grafen, og grafenoxid-kan anvendes til nettet for at give en overflade, som prøver kan befolke, hvilket reducerer sandsynligheden for partikler oplever de skadelige virkninger af luft-vand interface. Anvendelsen af disse sarte understøtninger på gitre kræver imidlertid omhyggelig håndtering for at forhindre brud, luftbåren forurening eller omfattende vaske- og rengøringstrin. En nylig rapport beskriver udviklingen af en brugervenlig flydeblok, der letter befrugtet overførsel af støttefilm direkte til prøven. Brugen af blokken minimerer antallet af manuelle håndteringstrin, der kræves, bevarer støttefilmens fysiske integritet og den tid, hvor hydrofob forurening kan opsamles, hvilket sikrer, at der stadig kan genereres en tynd isfilm. Dette papir giver trin-for-trin protokoller til fremstilling af kulstof, grafen, og grafenoxid understøtter em-undersøgelser.
I løbet af det seneste årti har gennembrud, hovedsagelig inden for detektorteknologi, men også på andre tekniske områder, lettet en række betydelige stigninger i opløsningen, hvor biologisk relevante systemer kan afbildes ved transmissionselektronmikroskopi (TEM)1,2. På trods af at cryo-EM allerede tillader opløsning af strukturer med høj opløsning fra så lidt som 50 μg protein gennem enkeltpartikelanalyse (SPA), forbliver kryo-EM-prøve og gitterforberedelse store flaskehalse3,4,5. SPA prøver består af makromolekyler fordelt ca tilfældigt inden for et lag af glasagtig is. Isen skal være så tynd som muligt for at maksimere kontrastforskellen mellem partiklerne og opløsningsmidlet. Biologiske makromolekyler er mere stabile (dvs. mindre tilbøjelige til at miste deres oprindelige struktur) i tykkere is, fordi de forbliver bedre opløst. Desuden er partikler ofte viser sig at være meget bedre fordelt over synsfeltet i is meget tykkere end partikelstørrelse6 og ofte ikke kan findes inden for huller i kulstoffilm på alle.
Derudover reducerer tykkere lag af is sandsynligheden for, at molekyler er tæt på luft-vand-grænsefladen på grund af det høje overflade-til-volumen-forhold, og det er blevet anslået, at brug af standard plunge-freezing metoder til cryo-EM-undersøgelser resulterer i adsorption af ~ 90% af partikler til luft-vand interface7. Tykkere is resulterer i uønsket høj baggrund på grund af øgede spredningshændelser i opløsningsmidlet og samtidig dæmpning af signalet6,7. Det er derfor nødvendigt at opnå så tyndt et lag glasøs is som muligt; ideelt set ville laget kun være lidt tykkere end partiklen. Udfordringen for forskeren, som skal overvindes for hver anden prøve, der påføres et gitter, er at forberede prøver, der er tynde nok til billeddannelse med høj kontrast, samtidig med at partiklernes strukturelle integritet i deres prøve bevares. Protein adsorption til luft-vand interface er ledsaget af flere, normalt skadelige, effekter.
For det første fremkalder binding af proteiner til denne hydrofobiske grænseflade ofte denaturering af proteinet, som fortsætter hurtigt og typisk er irreversibelt8,9. En undersøgelse foretaget ved hjælp af gær fedtsyre synthase viste, at op til 90% af adsorberet partikler er denatureret10. For det andet viste beviser fra en undersøgelse, der sammenlignede orienteringsfordelingen af 80S ribosomdatasæt indsamlet enten på amorf kulstof11 eller uden støtte12, at luftvandsgrænsefladen kan forårsage alvorlig præferenceorientering, der kompromitterer 3D-rekonstruktionen af volumen13. Metoder til at reducere partikelinteraktion med luft-vand-grænsefladen omfatter tilskud af frysebufferen med overfladeaktive stoffer (såsom vaskemidler), brug af støttefilm, affinitetsoptagelse eller stilladser af substrater og accelererede kastetider. Brugen af overfladeaktive stoffer er forbundet med sine egne problemer, da nogle proteinprøver kan opføre sig ikke-ideelt i deres tilstedeværelse, mens affinitetsfangende og stilladssubstrater generelt kræver tekniske skræddersyede gitteroverflader og fangststrategier. Endelig, selv om der er en masse forskning i udviklingen af hurtig-kaster enheder14,15,16, disse kræver apparater, der generelt ikke er bredt tilgængelige.
Selv om standard TEM-nettet for biologisk cryo-EM allerede har en perforeret amorf carbonfolie17, er der en række protokoller til rådighed for generering af yderligere støttefilm og deres overførsel til TEM-net. Anvendelsen af disse film er en veletableret metode til prøvestabilisering18. Amorfe kulstofstøtter genereres ved fordampning og aflejring på krystallinske glimmerplader19, hvorfra lagene kan flyde på gitre, med nytten af flydestøtter som nyttige værktøjer etableret i tidligere rapporter20. Grafenoxid flager, typisk udarbejdet ved hjælp af en modificeret version af Hummers metode21, er blevet brugt som en foretrukken støtte struktur til amorfe kulstof for deres nedsat baggrundssignal samt evnen til at immobilisere og stabilisere makromolekyler22. For nylig har der været en stigende interesse i brugen af grafen som TEM-støttefilm på grund af dens mekaniske stabilitet, høje ledningsevne, ekstremt lavt bidrag til baggrundsstøj23 samt fremkomsten af reproducerbare metoder til generering af makroskopisk store områder af monolayergrafen24 og overførsel til TEM-net25 . Sammenlignet med amorf kulstof, som gennemgår stråle-inducerede bevægelser på samme måde som, eller værre, end is mangler en støtte film11,12,17, graphene viste en betydelig reduktion i stråle-induceret bevægelse af cryo-EM billeder12.
Men mens hydroofile grafen beskyttet fedtsyrer syntasere fra luft-vand interfacial denaturering, forfatterne af denne undersøgelse bemærkede, at grafen blev forurenet under prøve forberedelse, sandsynligvis på grund af en kombination af atmosfærisk kulbrinte forurening og fra reagens bruges til hydrophilize gitre10. På trods af mange af de overlegne kvaliteter af grafen er dens udbredte brug stadig hæmmet af den derivatisering, der kræves for at reducere dens hydrofobicity12, som i sidste ende er kemisk vanskelig og kræver specialudstyr. Dette papir rapporterer protokoller til fremstilling af amorf kulstof, grafenoxid og grafenprøveunderstøttelse ved hjælp af en tredimensionelt (3D) trykt prøve floatation block27 til direkte overførsel af støttefilm fra de substrater, hvor de blev genereret, til TEM-gitre (figur 1). En vigtig fordel ved at bruge en sådan enhed er den fugtede overførsel af film, minimere hydrofob forurening af understøtningerne og dermed behovet for yderligere behandling og reducere antallet af potentielt skadelige manuelle håndteringstrin. Disse tilgange er billige at implementere og derfor bredt tilgængelige og anvendelige for cryo-EM-undersøgelser, hvor prøvestøtte er nødvendige.
Dette papir præsenterer protokoller for håndtering af både amorfe kulstof og grafen film til cryo-EM prøve forberedelse ved hjælp af en prøve floatation block27. En STL-fil til supportblokken er frit tilgængelig fra det offentlige Thingiverse-lager [www.thingiverse.com/thing:3440684] og kan 3D-printes med enhver passende stereolitografiprinter fra en passende harpiks. Brugen af kulstoffilm, der dækker et TEM-gitter, indebærer normalt kulstofflåd på prøven28. Denne tilgang til udarbejdelse af negative pletgitre minimerer lufteksponeringen under støttehåndtering og reducerer dermed forurening og proteindenaturering. Forberedelsen af gitre, der bruger flydende kulstof i små brønde, er fordelagtigt at flyde et større overfladeareal, dvs. i et vandbad eller petriskål, i hvilket tilfælde mekanisk klipning af kulstof forekommer meget lettere.
UAc kan være vanskeligt at købe på grund af gældende sundheds- og sikkerhedsbestemmelser på tidspunktet for offentliggørelsen. Mange andre almindeligt anvendte, ikke-radioaktive, negative farvning reagenser er tilgængelige, og protokoller for deres forberedelse er blevet beskrevet tidligere29. Selv om der ikke er anvendt alternative pletter med denne støtte floatation blok, er det ikke sandsynligt, at der ville være nogen forskelle i disse protokoller ud over optimering af inkubationstid med prøve (trin 3.5), som allerede i sagens natur er stikprøveafhængig. Det vigtigste trin i denne GrOx-supportforberedelsesprotokol er trin 4.4, fremhævet af noten for at forhindre vand- og GrOx-løsningen i at komme i kontakt rundt om gitterkanten. Uhensigtsmæssig blanding af vandet og GrOx-opløsninger forhindrer ensrettet afregning af GrOx-flagerne ved kapillær handling. At have GrOx-flager på begge sider af kulstoffolien resulterer i tykke lag og negerer dermed fordelene ved at bruge GrOx som en næsten enkelt lagstøtte samt fældefangstvand mellem flagerne, hvilket forårsager forurening af brugbare områder med yderligere lag is. Grafenoxid støtte forberedelse er relativt let at opnå ved hjælp af dråber af opløsning på fleksibel polyolefin film. Men når det udføres på den måde, er det lettere ved et uheld at forurene kobbersiden af nettet ved fejlfejl; brugen af flydeblokken reducerer sandsynligheden for denne eventualitet.
Endelig dette papir præsenterer en protokol til at forberede grafen-dækket net, der undgår enhver form for grafen forbehandling for at gøre det hydrofile, hvilket reducerer omkostningerne og øge dens tilgængelighed. Det er tilstrækkeligt at opretholde en fugtet folie under hele prøveforberedelsen og påføring af prøven på stedet i blokken lige før frysningen, så der kan dannes egnede ilag til kryo-EM med en homogen prøvefordeling. Samlet set minimerer de protokoller, der præsenteres her, prøvekontakt med luft-vand-grænsefladen, hvilket reducerer prøvedenaturering og understøtter forurening. For de tre støttefilm, der anvendes i disse tilgange, kan homogene prøvefordelinger opnås på tværs af gitrene sammen med billeddannelse af intakte, velbevarede enkeltpartikler.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af sektionen for strukturel &syntetisk biologi på Imperial College London, der har hjulpet med at teste disse teknikker, samt Harry Barnett på Imperial College Advanced Hackspace, og Paul Simpson på Center for Strukturel Biologi. CHSA støttes af et Sir Henry Dale Fellowship, der finansieres i fællesskab af Wellcome Trust og Royal Society (206212/Z/17/Z).
Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |