Summary
La preparación de muestras para la microscopía crioelectrónica (crio-EM) es un cuello de botella significativo en el flujo de trabajo de determinación de la estructura de este método. Aquí, proporcionamos métodos detallados para usar un bloque impreso tridimensionalmente fácil de usar para la preparación de películas de soporte para estabilizar muestras para estudios EM de transmisión.
Abstract
La determinación de la estructura por microscopía crioelectrónica (crio-EM) ha crecido rápidamente en la última década; sin embargo, la preparación de muestras sigue siendo un cuello de botella significativo. Las muestras macromoleculares se visualizan idealmente directamente desde orientaciones aleatorias en una capa delgada de hielo vítreo. Sin embargo, muchas muestras son refractarias a esto, y la desnaturalización de proteínas en la interfaz aire-agua es un problema común. Para superar estos problemas, se pueden aplicar películas de soporte, que incluyen carbono amorfo, grafeno y óxido de grafeno, a la rejilla para proporcionar una superficie que las muestras puedan poblar, reduciendo la probabilidad de que las partículas experimenten los efectos nocivos de la interfaz aire-agua. Sin embargo, la aplicación de estos delicados soportes a las rejillas requiere un manejo cuidadoso para evitar roturas, contaminación en el aire o pasos extensos de lavado y limpieza. Un informe reciente describe el desarrollo de un bloque de flotación fácil de usar que facilita la transferencia húmeda de películas de soporte directamente a la muestra. El uso del bloque minimiza el número de pasos de manipulación manual requeridos, preservando la integridad física de la película de soporte y el tiempo durante el cual se puede acumular la contaminación hidrofóbica, asegurando que aún se pueda generar una película delgada de hielo. Este documento proporciona protocolos paso a paso para la preparación de soportes de carbono, grafeno y óxido de grafeno para estudios EM.
Introduction
Durante la última década, los avances, principalmente en la tecnología de detectores, pero también en otros campos técnicos, han facilitado una sucesión de aumentos sustanciales en la resolución a la que los sistemas biológicamente relevantes pueden ser fotografiados por microscopía electrónica de transmisión (TEM)1,2. A pesar de que la crio-EM ya permite la resolución de estructuras de alta resolución desde tan solo 50 μg de proteína a través del análisis de partículas individuales (SPA), la muestra crio-EM y la preparación de la rejilla siguen siendo los principales cuellos de botella3,4,5. Las muestras de SPA consisten en macromoléculas distribuidas aproximadamente al azar dentro de una capa de hielo vítreo. El hielo debe ser lo más delgado posible para maximizar la diferencia de contraste entre las partículas y el disolvente. Las macromoléculas biológicas son más estables (es decir, menos propensas a perder su estructura nativa) en hielo más grueso, porque permanecen mejor solvadas. Además, a menudo se encuentra que las partículas están mucho mejor distribuidas sobre el campo de visión en hielo mucho más grueso que el tamaño de partícula6 y, con frecuencia, es posible que no se encuentren dentro de los agujeros en las películas de carbono en absoluto.
Además, las capas más gruesas de hielo disminuyen la probabilidad de que las moléculas estén cerca de la interfaz aire-agua debido a la alta relación superficie-volumen, y se ha estimado que el uso de métodos estándar de congelación por inmersión para estudios crio-EM da como resultado la adsorción de ~ 90% de partículas a la interfaz aire-agua7. El hielo más grueso da como resultado un fondo indeseablemente alto debido al aumento de los eventos de dispersión dentro del disolvente y la atenuación concomitante de la señal6,7. Por lo tanto, es necesario lograr una capa lo más delgada posible de hielo vítreo; idealmente, la capa sería solo un poco más gruesa que la partícula. El desafío para el investigador, que debe superarse para cada muestra diferente aplicada a una rejilla, es preparar especímenes lo suficientemente delgados para imágenes de alto contraste mientras se mantiene la integridad estructural de las partículas dentro de su muestra. La adsorción de proteínas a la interfaz aire-agua se acompaña de varios efectos, generalmente perjudiciales.
En primer lugar, la unión de las proteínas a esta interfaz hidrofóbica a menudo induce la desnaturalización de la proteína, que procede rápidamente y es típicamente irreversible8,9. Un estudio realizado con levadura de ácidos grasos sintasa mostró que hasta el 90% de las partículas adsorbidas están desnaturalizadas10. En segundo lugar, la evidencia de un estudio que comparó la distribución de orientación de los conjuntos de datos de ribosomas 80S recopilados sobre carbono amorfo11 o sin soporte12 mostró que la interfaz aire-agua puede causar una orientación preferencial severa que compromete la reconstrucción 3D del volumen13. Los métodos para reducir la interacción de partículas con la interfaz aire-agua incluyen la suplementación del tampón de congelación con surfactantes (como detergentes), el uso de películas de soporte, la captura de afinidad o andamiaje de sustratos y tiempos de inmersión acelerados. El uso de tensioactivos se asocia con sus propios problemas, ya que algunas muestras de proteínas pueden comportarse de manera no ideal en su presencia, mientras que los sustratos de captura de afinidad y andamiaje generalmente requieren la ingeniería de superficies de cuadrícula a medida y estrategias de captura. Finalmente, aunque hay mucha investigación sobre el desarrollo de dispositivos de caída rápida14,15,16, estos requieren aparatos que generalmente no están ampliamente disponibles.
Aunque la rejilla TEM estándar para crio-EM biológicos ya cuenta con una lámina de carbono amorfa perforada17, hay una serie de protocolos disponibles para la generación de películas de soporte adicionales y su transferencia a las rejillas TEM. El uso de estas películas es un método establecido desde hace mucho tiempo para la estabilización de la muestra18. Los soportes de carbono amorfo se generan por evaporación y deposición en láminas de mica cristalina19, a partir de las cuales las capas pueden flotar en rejillas, con la utilidad de los soportes de flotación como herramientas útiles establecidas en informes anteriores20. Las escamas de óxido de grafeno, típicamente preparadas utilizando una versión modificada del método Hummers21, se han utilizado como una estructura de soporte preferible al carbono amorfo por su disminución de la señal de fondo, así como la capacidad de inmovilizar y estabilizar macromoléculas22. Más recientemente, ha habido un resurgimiento del interés en el uso del grafeno como película de soporte TEM debido a su estabilidad mecánica, alta conductividad, contribución extremadamente baja al ruido de fondo23, así como la aparición de métodos reproducibles para generar macroscópicamente grandes áreas de grafeno monocapa24 y transferirlo a las rejillas TEM25 . En comparación con el carbono amorfo, que sufre movimientos inducidos por el haz de manera similar o peor que el hielo que carece de una película de soporte11,12,17, el grafeno mostró una reducción significativa en el movimiento inducido por el haz de las imágenes crio-EM12.
Sin embargo, mientras que el grafeno hidrofilizado protegió la sintasa de ácidos grasos de la desnaturalización interfacial aire-agua, los autores de este estudio observaron que el grafeno se contaminó durante la preparación de la muestra, probablemente debido a una combinación de contaminación atmosférica por hidrocarburos y por el reactivo utilizado para hidrofilizar las rejillas10. De hecho, a pesar de muchas de las cualidades superiores del grafeno, su uso generalizado todavía se ve obstaculizado por la derivatización requerida para disminuir su hidrofobicidad12, que en última instancia es químicamente difícil y requiere equipos especializados. Este artículo informa sobre los protocolos para la preparación de soportes de muestras de carbono amorfo, óxido de grafeno y grafeno utilizando un bloque de flotación de muestra impreso tridimensionalmente (3D)27 para transferir directamente las películas de soporte de los sustratos en los que se generaron a las rejillas TEM (Figura 1). Una ventaja clave del uso de un dispositivo de este tipo es la transferencia húmeda de películas, minimizando la contaminación hidrofóbica de los soportes y, en consecuencia, la necesidad de un tratamiento adicional, y reduciendo el número de pasos de manipulación manual potencialmente dañinos. Estos enfoques son baratos de implementar y, por lo tanto, ampliamente accesibles y aplicables para estudios de crio-EM donde se necesitan apoyos de muestra.
Protocol
1. Preparación general de la transferencia previa al soporte de las redes TEM
- Usando un par de pinzas limpias y finas, levante y sumerja las rejillas TEM secuencialmente en agua de doble destilación (ddH2O) o agua ultrapura durante 10-15 s, seguida de acetato de etilo, durante 10-15 s.
NOTA: Aquí, se usaron pinzas de acción negativa, de punta oblicua. - Coloque las pinzas, con la rejilla aún en agarre, a un lado para secar al aire durante ~ 5 min.
- Limpie con plasma las rejillas para despojar la superficie de cualquier contaminante acumulado a través del aire o los pasos de lavado.
NOTA: Aquí, la limpieza por plasma se realizó durante 10-15 s en el aire con una potencia de radiofrecuencia de 25 W.
2. Preparación general de soluciones de reactivos
- Solución de acetato de uranilo (UAc) (2% p/v)
- Envuelva un tubo de 50 ml en papel de aluminio, llene con 50 ml de agua ultrapura y agregue 1 g de polvo de UAc.
NOTA: UAc es sensible a la luz y precipita con el tiempo cuando se expone. Como la UAc es radiactiva y tóxica, mantenga un alto nivel de limpieza. Con el peligro más grave derivado de la inhalación o ingestión, se debe tener especial cuidado para evitar cualquier posibilidad de inhalación de partículas finas. Siempre se deben usar guantes al manipular o pesar las sales de uranio. Mascarillas y gafas muy recomendables. Las sales de uranio deben eliminarse de acuerdo con los requisitos legales establecidos para los peligros radiactivos dentro del estado. - Deje que la solución se agite durante 1 h para permitir que todo el UAc se disuelva. Conservar a 4°C.
- Antes de su uso, filtre 1 ml de la solución de tinción en un vial pequeño con un filtro de 0,22 μm para eliminar los cristales de acetato restantes.
- Envuelva un tubo de 50 ml en papel de aluminio, llene con 50 ml de agua ultrapura y agregue 1 g de polvo de UAc.
- Suspensión de óxido de grafeno (GrOx)
- Pipetear 2,5 μL de GrOx en un tubo de 1,5 mL (concentración final del 1%). Pipetear 2,5 μL de detergente n-dodecil β-D-maltósido (DDM) al 10% (p/v) en el GrOx, y mezclar suavemente (concentración final del 0,1% (p/v)).
- Agregue 245 μL de agua ultrapura a la mezcla GrOx-DDM e inmediatamente vórtice vigorosamente durante 5 min. Use la suspensión de GrOx dentro de 1 h de la preparación, vórtice vigorosamente durante al menos 1 minuto antes del uso inmediato.
- Solución de cloruro de hierro (III) (FeCl3) (10% p/v)
- Pesa cuidadosamente 5 g de FeCl3 en un bote de pesaje. Transfiera a un cilindro de medición de 100 ml que contenga 35 ml de ddH2O y una barra de agitación magnética.
- Coloque en una placa de agitación magnética y disuelva FeCl3, agregando ddH2O a un volumen final de 50 ml. Filtre la solución de FeCl3 a través de un filtro de jeringa de 0,8 μm en una botella limpia para su almacenamiento.
NOTA: FeCl3 es corrosivo e irritante; lavarse las manos y otras áreas expuestas con agua y jabón suave antes de comer, beber o fumar y al salir del trabajo. Proporcionar una buena ventilación en el área de proceso para evitar la formación de vapor. No respire niebla, vapores, aerosol. Los guantes siempre deben usarse al manipular o pesar la sal. Mascarillas y gafas muy recomendables siempre que estén en uso.
3. Intercambio de tampón para películas de soporte de carbono en mica para preparar muestras teñidas negativamente utilizando el bloque de flotación de soporte
- Lavar y limpiar con plasma las rejillas TEM.
NOTA: Aquí, se utilizaron 300 rejillas de cobre de malla de carbono agujereado como se describe anteriormente en la sección 1. - Pipetear 10-12 μL de muestra en el pozo de intercambio tampón (con los canales pequeños) del bloque de flotación y 10-12 μL de solución de UAc al 2% (ver sección 2.1) para la tinción negativa en el pozo de intercambio adyacente sin tampón.
NOTA: El pozo tiene un volumen de 10 μL; sin embargo, ajuste el volumen de la muestra para que se forme un menisco convexo en la superficie del líquido para permitir la flotación adecuada de la película. Un volumen bajo de muestra puede causar rotura de la película. - Corte cuidadosamente dos pequeños trozos de mica con película de carbono predepositada en la parte superior. Asegúrese de que los fragmentos de mica sean lo suficientemente anchos como para caber en el pozo (3,4 mm de ancho) y más largos que la longitud del pozo (3,45 mm), de modo que el fragmento se asiente en el pozo mientras el carbono está flotando, y haya suficiente espacio para manejar el fragmento con las pinzas.
NOTA: Para manejar el carbono, use pinzas planas de punta larga de acción negativa. Al cortar los fragmentos de mica, corte utilizando movimientos individuales para mantener la integridad de la película de carbono. - Sumerja la mica en el pozo con un ángulo aproximado de 45° hasta que la mica se asiente en la rampa del pozo y se observe una capa de carbono en la superficie de la muestra líquida.
- Después de la incubación inicial en la muestra (típicamente de 20 s a 20 min dependiendo de la adherencia de la muestra; optimice este período en función de las necesidades experimentales), retire la lámina de mica muy lentamente para recuperar la película de carbono y minimizar la retención de muestra viscosa residual.
- Seque cuidadosamente la mica golpeando la superficie inferior (lado sin carbono) con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido, y posteriormente cambie el carbono que contiene la muestra en una mancha negativa mediante la aplicación al pozo opuesto (es decir, sumerja la mica como en el paso 3.4) que contiene la solución de UAc al 2%.
NOTA: Se debe observar una capa de carbono flotando sobre la solución de tinción en este punto. - Recupere la capa de carbono flotante con el lado cubierto de carbono agujereado de una rejilla EM lavada y limpiada con plasma. Deje que las rejillas se sequen al aire hasta obtener imágenes en un TEM. Idealmente, cubra las rejillas durante el proceso de secado para evitar la contaminación en el aire.
4. Aplicación del bloque de flotación de soporte para preparar rejillas TEM recubiertas de óxido de grafeno
- Lave y limpie las rejillas TEM con plasma utilizando rejillas de cobre de 300 mallas de carbono agujereado como se describe anteriormente (sección 1).
- Pipetear 10-12 μL de suspensión de GrOx (ver sección 2.2) en los 4 pozos de intercambio no tampón a lo largo del bloque de flotación. Pipetear 10-12 μL ddH2O o agua ultrapura en los 4 pozos de intercambio tampón restantes del bloque.
NOTA: Este volumen de agua debe ser suficiente para formar un ligero menisco convexo que se eleva por encima de la altura del bloque. - Deje caer 4 rejillas suavemente sobre la suspensión GrOx de cada pozo durante 1 minuto, asegurándose de que el lado cubierto de carbono agujereado haga contacto con la solución. Después de 1 minuto, recupere cada rejilla con cuidado deslizando las pinzas en la ranura de la pinza de cada pozo de intercambio que no sea amortiguador.
- Toque muy suave y brevemente el lado de cobre, no cubierto de carbono de cada rejilla al ddH2O en el pozo adyacente. Luego, sostenga con cuidado y suavemente la rejilla, con gotas de agua hacia abajo, contra un trozo de papel de filtro.
NOTA: Secar el agua atraerá la suspensión de GrOx a través de la rejilla por acción capilar. Es crucial evitar sumergir la rejilla en el ddH2O, por lo que el contacto debe ser muy breve. Cuando se levanta la rejilla, una gota de agua debe sujetarse a la parte inferior de la rejilla. Tenga cuidado de no mover la rejilla en el papel de filtro, ya que esto podría alterar el asentamiento de las escamas de GrOx. - Deje que las rejillas de las pinzas se sequen al aire hasta su preparación con la muestra. Idealmente, cubra las rejillas durante el proceso de secado para evitar la contaminación en el aire.
5. Aplicación del bloque de flotación de soporte para la preparación de muestras en películas monocapa de grafeno
- Lave las rejillas TEM como se describe anteriormente (sección 1), pero omitiendo la limpieza por plasma.
NOTA: Aquí, se utilizaron 300 rejillas de oro de malla de carbono agujereado, pero otras rejillas que no son de cobre o rejillas de aleación de cobre también son practicables. - Para depositar rejillas con grafeno, transfiera directamente del grafeno cultivado en sustratos de cobre (Cu-grafeno) a rejillas crio-EM, como se describió anteriormente25.
- Coloque cuatro rejillas lavadas sobre una lámina de Cu-grafeno (10 mm × 10 mm) depositadas en un portaobjetos de vidrio, y cubra cada rejilla con una gota de isopropanol (5-10 μL) para permitir el contacto íntimo entre el grafeno monocapa y la rejilla.
NOTA: Asegúrese de colocar el lado agujereado cubierto de carbono de las rejillas en contacto con la lámina de grafeno. - Cuando el isopropanol esté completamente evaporado (normalmente 2 h), flote la lámina de Cu-grafeno con rejillas sobre una solución de FeCl3 al 10% (p/v) (ver sección 2.3) en una placa de Petri de vidrio y déjela grabar a temperatura ambiente durante la noche. Cubra el plato para evitar la contaminación en el aire.
NOTA: Una vez completado el grabado, solo la monocapa de grafeno permanecerá flotando en la solución FeCl3 , esto debe ser visible a simple vista con la iluminación adecuada. - Use un bucle con un diámetro mayor que el tamaño de la rejilla TEM para pescar las rejillas que flotan en la monocapa de grafeno, y transfiera cuidadosamente a una placa de Petri de vidrio que contenga ddH2O para lavar.
NOTA: Tenga mucho cuidado al pescar las rejillas para evitar golpear las paredes de la placa de Petri, lo que puede causar rotura o flexión de la película de grafeno. - Lavar dos veces más en agua mediante rejillas de pesca y transferir a una placa de Petri limpia que contenga ddH2O para eliminar todo el FeCl3 residual. Finalmente, transfiera las rejillas a una placa de Petri que contenga un tampón de muestra hasta la preparación de la muestra y la congelación por inmersión.
NOTA: El lado cubierto de grafeno de las rejillas debe mantenerse húmedo en todo momento para evitar su exposición a contaminantes en el aire.
- Coloque cuatro rejillas lavadas sobre una lámina de Cu-grafeno (10 mm × 10 mm) depositadas en un portaobjetos de vidrio, y cubra cada rejilla con una gota de isopropanol (5-10 μL) para permitir el contacto íntimo entre el grafeno monocapa y la rejilla.
- Pipetear la muestra (10-12 μL) en un pozo de intercambio no tampón del bloque de flotación. Cuando la muestra esté lista en el bloque, elija una rejilla recubierta de grafeno de la solución tampón con un par de pinzas limpias y colóquela sobre la superficie del pozo que contiene la muestra.
- Después de un período de incubación apropiado (1-5 min dependiendo de la muestra; optimice de acuerdo con las necesidades experimentales), elija la rejilla con un par de pinzas de congelación limpias y proceda con la secación y vitrificación.
Representative Results
Las rejillas TEM preparadas con soportes de carbono amorfo generalmente están cubiertas en toda la superficie de la rejilla. Aunque la rotura de la película de carbono ocurre en algunos casos junto con algunos volantes (Figura 2A), una gran cantidad de cuadrados de rejilla son prístinos y, por lo tanto, ampliamente aplicables para fines de tinción negativa. El factor principal que afecta la integridad del soporte es el espesor de carbono, que se determina durante la evaporación del carbono. Del mismo modo, con este protocolo GrOx, se logra rutinariamente una buena cobertura en toda la red (Figura 2B). Una sola aplicación de suspensión grOx durante 1 minuto es suficiente para garantizar pocas áreas con múltiples capas, que son fáciles de ver debido a los bordes en escamas. Las rejillas GrOx se pueden preparar rápidamente a partir de materias primas y son altamente protectoras de la muestra. Sin embargo, los bordes en escamas, la cobertura incompleta y los volantes son más visibles con las rejillas GrOx que para las otras técnicas debido a la naturaleza de las escamas GrOx.
Aunque la integridad de la película de soporte de grafeno, como el carbono amorfo, depende del proceso de deposición, las áreas que están bien cubiertas muestran el patrón de difracción característico del grafeno de una sola capa. Es importante destacar que, al mantener húmedas las películas de soporte de grafeno, las muestras se pueden recuperar del bloque de flotación después de un período de incubación y los datos se recopilan de una manera susceptible de análisis de una sola partícula. Este método no requiere ningún otro tratamiento del grafeno para la humectación, eliminando así el requisito de equipos costosos para hacer que el grafeno sea hidrófilo, y es mejor preparar películas de soporte poco antes de la preparación de la muestra y la congelación en rejilla (Figura 2C).
Figura 1: Diseño y aplicación del bloque de flotación de muestra durante la preparación de la película de soporte. (A) Esquema de las vistas superior, de pozo y lateral del bloque de flotación, incluidas las mediciones de la forma, la profundidad y la inclinación. Se indican la ranura para que las puntas de las pinzas descansen, así como los canales para insertar agujas. (B) Las capas de carbono amorfo pueden flotar fácilmente en la superficie del amortiguador contenido dentro de los pozos del bloque de flotación utilizando la rampa, es decir, durante la preparación de rejillas TEM teñidas negativamente. (C) El ancho de los pozos es adecuado para acomodar una rejilla TEM, mientras que las ranuras de las pinzas reducen la necesidad de liberar y recoger las rejillas innecesariamente durante los pasos de preparación, pero ofrecen una ruta definida para recuperar las rejillas sin riesgo de flexión si se liberan las rejillas. Las imágenes en B se modifican a partir de 27. Abreviatura: TEM = microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos típicos de películas de soporte de muestra preparadas utilizando el bloque de flotación. Las vistas de cuadrícula cuadrada (izquierda) e imagen (derecha) se muestran para (A) carbono amorfo, (B) óxido de grafeno y (C) películas de soporte de grafeno preparadas utilizando el bloque de flotación. El soporte de carbono amorfo se utilizó en la preparación de ribosomas 70S para tinción negativa, mientras que los soportes de óxido de grafeno y grafeno se utilizaron en la preparación de ribosomas 70S para crio-EM. Las imágenes en A y C se modifican de 27. Barra de escala para un cuadrado de cuadrícula = 10 μm; barras de escala para cuadrados de cuadrícula B y C = 5 μm; barras de escala para vistas de imagen A-C = 50 nm. Abreviatura: cryo-EM = crio-microscopía electrónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este artículo presenta protocolos para el manejo de películas de carbono amorfo y grafeno para la preparación de muestras crio-EM utilizando un bloque de flotación de muestra27. Un archivo STL para el bloque de soporte está disponible gratuitamente en el repositorio público de Thingiverse [www.thingiverse.com/thing:3440684], y se puede imprimir en 3D con cualquier impresora estereolitográfica adecuada a partir de una resina adecuada. El uso de películas de carbono que cubren una rejilla TEM generalmente implica la flotación de carbono en la muestra28. Este enfoque para preparar rejillas de manchas negativas minimiza la exposición al aire durante el manejo del soporte, reduciendo así la contaminación y la desnaturalización de proteínas. La preparación de rejillas que utilizan carbono flotante en pozos pequeños es ventajosa para flotar en una superficie más grande, es decir, en un baño de agua o placa de Petri, en cuyo caso el cizallamiento mecánico del carbono ocurre mucho más fácilmente.
UAc puede ser difícil de comprar debido a las regulaciones actuales de salud y seguridad en el momento de la publicación. Se dispone de muchos otros reactivos de tinción negativa no radiactivos de uso común, y los protocolos para su preparación se han descrito anteriormente29. Aunque no se han utilizado tinciones alternativas con este bloque de flotación de soporte, no es probable que haya diferencias en estos protocolos además de la optimización del tiempo de incubación con la muestra (paso 3.5), que ya es inherentemente dependiente de la muestra. El paso clave en este protocolo de preparación de soporte grOx es el paso 4.4, resaltado por la nota para evitar que el agua y la solución GrOx entren en contacto alrededor del borde de la red. La mezcla inadecuada del agua y las soluciones de GrOx impide la sedimentación unidireccional de las escamas de GrOx por acción capilar. Tener escamas de GrOx en ambos lados de la lámina de carbono da como resultado capas gruesas, negando así las ventajas de usar GrOx como soporte de casi una sola capa, así como atrapar agua entre las escamas, lo que causa la contaminación de áreas utilizables con capas adicionales de hielo. La preparación de soporte de óxido de grafeno es relativamente fácil de lograr utilizando gotas de solución en una película flexible de poliolefina. Sin embargo, cuando se realiza de esa manera, es más fácil contaminar accidentalmente el lado de cobre de la rejilla por errores de mal manejo; el uso del bloque de flotación reduce la probabilidad de esta eventualidad.
Finalmente, este trabajo presenta un protocolo para preparar rejillas cubiertas de grafeno que evita cualquier tipo de pretratamiento con grafeno para hacerlo hidrófilo, reduciendo así su costo y aumentando su accesibilidad. Mantener una película humedecida durante toda la preparación de la muestra y aplicar la muestra in situ en el bloque justo antes de la congelación es suficiente para permitir la generación de capas de hielo adecuadas para crio-EM con una distribución de muestra homogénea. En general, los protocolos presentados aquí minimizan el contacto de la muestra con la interfaz aire-agua, lo que reduce la desnaturalización de la muestra y admite la contaminación. Para las tres películas de soporte utilizadas en estos enfoques, se pudieron lograr distribuciones de muestras homogéneas a través de las rejillas junto con imágenes de partículas individuales intactas y bien conservadas.
Disclosures
Los autores no tienen conocimiento de ningún conflicto de intereses con respecto a este trabajo.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a todos los miembros de la Sección de Biología Estructural y Sintética del Imperial College de Londres que han ayudado a probar estas técnicas, así como a Harry Barnett en el Imperial College Advanced Hackspace y Paul Simpson en el Centro de Biología Estructural. CHSA cuenta con el apoyo de una beca Sir Henry Dale financiada conjuntamente por el Wellcome Trust y la Royal Society (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E.
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
