支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製

Summary

この方法の構造決定ワークフローにおいて、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)のサンプル調製は重要なボトルネックとなっている。ここでは、透過EM試験用サンプルを安定化させる支持膜の作製に使いやすい3次元印刷ブロックを用いた詳細な方法を提供する。

Abstract

クライオ電子顕微鏡(クライオ-EM)による構造決定は、この10年間で急速に成長しています。ただし、サンプルの準備は依然として重大なボトルネックです。高分子サンプルは、氷の薄い層のランダムな配向から直接画像化することが理想的です。しかし、多くのサンプルはこれに耐え難く、空気と水の界面でのタンパク質変性が一般的な問題である。このような問題を克服するために、アモルファスカーボン、グラフェン、酸化グラフェンを含む支持膜をグリッドに適用して、サンプルが入り込むことができる表面を提供し、空気と水の界面の有害な影響を経験する粒子の確率を低下させることができる。しかし、これらのデリケートなサポートをグリッドに適用するには、破損、空中汚染、または広範な洗浄および洗浄ステップを防ぐために慎重な取り扱いが必要です。最近のレポートでは、サンプルに直接サポートフィルムの濡れた移動を容易にする使いやすい浮遊ブロックの開発について説明しています。ブロックの使用は、必要な手動処理ステップの数を最小限に抑え、支持体の物理的完全性を維持し、疎水性汚染が発生する時間を超え、氷の薄膜を生成できることを保証します。本論文では、EM研究のための炭素、グラフェン、酸化グラフェン支持体の作成に関するステップバイステップのプロトコルを提供する。

Introduction

過去10年間で、主に検出器技術だけでなく、他の技術分野でもブレークスルーは、生物学的に関連するシステムを透過電子顕微鏡(TEM)^1,2によって画像化できる分解能の大幅な増加を促進してきました。cryo-EMは、単粒子分析(SPA)を通じてタンパク質の50μgから高解像度の分解能を既に可能にしているにもかかわらず、クライオEMサンプルおよびグリッド調製は依然として主要なボトルネック^{である3,4,5}です。SPAサンプルは、ビトリアス氷の層内にほぼランダムに分布する高分子で構成されています。粒子と溶媒のコントラスト差を最大化するには、氷をできるだけ薄くする必要があります。生物学的高分子は、より安定している(すなわち、天然構造を失う可能性が低い)、より厚い氷の中では、より良い溶媒和のままであるからである。さらに、粒子は、粒子サイズ⁶よりもはるかに厚い氷の視野に分布することがしばしば見られ、炭素膜の穴の中に全く見つからない場合が多い。

さらに、氷の層が厚いほど、表面対体積比が高いため、分子が空気界面に近い確率が低下し、クライオEM研究に標準的なプランジ凍結法を用いると、空気水界面への粒子の90%の吸着が生じると推定されています^。より厚い氷は、溶媒内の散乱事象の増加とシグナル^6,7の付随的減衰のために望ましくない高いバックグラウンドをもたらす。したがって、可能な限り薄い氷の層を達成する必要があります。理想的には、この層は粒子よりもわずかに厚いだけです。グリッドに適用されるあらゆる異なるサンプルに対して克服しなければならない研究者の課題は、サンプル内の粒子の構造的完全性を維持しながら、高コントラストイメージングに十分な薄い標本を調製することです。空気と水の界面へのタンパク質吸着は、いくつかの、通常は有害な、効果を伴う。

まず、この疎水性界面へのタンパク質の結合は、タンパク質の変性を誘発することが多く、これは急速に進行し、典型的には不可逆的^{である8,9である}。酵母脂肪酸合成酵素を用いて行われた研究では、吸着粒子の最大90%が変性¹⁰であることを示した。第二に、非晶質炭素^{11または支持なし}のいずれかで収集された80Sリボソームデータセットの配向分布を比較する研究からの証拠は、空気水界面が容積¹³の3D再構成を損なう重度の優先配向性を引き起こす可能性があることを示した。空気水界面との粒子相互作用を低減する方法には、界面活性剤(洗剤など)による凍結緩衝液の補充、支持膜の使用、基材のアフィニティー捕捉または足場、および加速された急激な時間が含まれる。界面活性剤の使用は、いくつかのタンパク質サンプルが存在下で理想的に動作しない可能性があるため、独自の問題に関連していますが、アフィニティーキャプチャングおよび足場基板は一般的にエンジニアリングオーダーメイドのグリッド表面とキャプチャ戦略を必要とします。最後に、急速突っ込み装置^14,15,16の開発に関する研究は多いが、これらは一般に広く利用できない装置を必要とする。

生物学的クライオEMの標準TEMグリッドは既に穿ファレンス非晶質炭素箔¹⁷を備えていますが、追加の支持フィルムの生成とTEMグリッドへの転送に利用可能なプロトコルが数多くあります。これらのフィルムの使用は、サンプル安定化¹⁸のための長い確立された方法である。アモルファス炭素支持体は、結晶性マイカシート¹⁹上の蒸発および堆積によって生成され、そこから層をグリッドに浮かべることができ、浮遊サポートの有用性を従来のレポート²⁰で確立された有用なツールとして利用する。グラフェン酸化物フレークは、典型的にはハマース法²¹の改変バージョンを用いて調製され、それらの減少したバックグラウンド信号に対する非晶質炭素に好適な支持構造として、ならびに高分子を固定化し安定化させる能力²²として使用されている。最近では、その機械的安定性、高い導電性、^{バックグラウンドノイズへの}寄与度が極めて低いため、グラフェンをTEM支持フィルムとして使用することに対する関心が再び高まっており、単層グラフェン²⁴のマクロ的に大きな領域を生成し、TEMグリッド²⁵に転送する再生可能な方法の出現が行われています。.支持フィルム11,12,17を欠く氷よりも同様に、または悪いビーム誘発動きを受ける非晶質炭素と比較すると、グラフェンはクライオEM画像¹²のビーム誘発運動の有意な減少を示した。

しかし、親水化グラフェンは空気水界面変性から脂肪酸合成酵素を保護したが、この研究の著者らは、グラフェンが検体調製中に汚染され、大気炭化水素汚染とグリッドを親水化するために使用される試薬の組み合わせによる可能性が高いことを指摘^した。確かに、グラフェンの優れた資質の多くにもかかわらず、その広範な使用は、最終的には化学的に困難であり、専門の機器を必要とするその疎水性¹²を減少させるために必要な誘導体化によって依然として妨げられています。この論文では、アモルファスカーボン、酸化グラフェン、グラフェンサンプルサポートの調製に関するプロトコルを、3次元(3D)プリントされたサンプル浮遊ブロック²⁷ を用いて、それらが生成された基板からTEMグリッドに支持フィルムを直接移動する(図1)。。このような装置を使用する主な利点は、フィルムの濡れた移動、支持体の疎水性汚染を最小限に抑え、その結果、さらなる治療の必要性、および潜在的に損傷を与える手動処理ステップの数を減らすことである。これらのアプローチは実装に安価であり、サンプルサポートが必要なcryo-EM研究に広くアクセス可能で適用可能です。

Protocol

1. TEMグリッドの一般的な準備事前サポート転送

1. 清潔で細かいピンセットを使用して、TEMグリッドを2倍蒸留水(_ddH2O)または超純水で10〜15sの超純水に順番に持ち上げ、沈下し、続いて酢酸エチルを10〜15 sで使用します。
   注:ここでは、負の作用、斜め先端ピンセットが使用されました。
2. グリッドをグリップにしたままピンセットを片側に置き、約5分間空気乾燥します。
3. プラズマは、空気または洗浄ステップを介して発生した汚染物質の表面を取り除くためにグリッドをきれいにします。
   注:ここでは、プラズマクリーニングは25 Wの無線周波パワーで空気中の10-15 sのために行われました。

2. 試薬溶液の一般的な調製

1. ウラニル酢酸(UAc)溶液(2%w/v)
   1. 50 mLチューブをホイルで包み、50mLの超純水で満たし、UAcパウダーを1g加えます。
      注: UAc は光に敏感で、露出すると時間の経過とともに沈殿します。UAcは放射性と毒性であるため、高いレベルの清潔さを維持します。吸入または摂取から生じる最も深刻な危険に、細かい粒子を吸入する可能性を防ぐために余分な注意を払う必要があります。ウラニウム塩を取り扱ったり、重量を量るときは、手袋は常に着用する必要があります。マスクとゴーグルは強くお勧めします。ウラン塩は、州内の放射性危険に対して定められた法的要件に従って処分されなければならない。
   2. 溶液を1時間撹拌したままにして、すべてのUAcが溶解できるようにします。4°Cで保管する。
   3. 使用前に、0.22 μmフィルターを使用して、染色液の1mLを小さなバイアルにフィルターし、残りのアセテート結晶を除去します。
2. 酸化グラフェン(GrOx)懸濁液
   1. ピペット2.5 μLのGrOxを1.5mLチューブに(1%最終濃度)ピペット2.5 μLの10%(w/v) n-ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)洗剤をGrOxに入れ、穏やかに混合します(0.1%(w/v)最終濃度)。
   2. GrOx-DDMミックスに245μLの超純水を加え、すぐに5分間激しくボルテックスを加え、調製から1時間以内にGrOx懸濁液を使用し、すぐに使用する前に少なくとも1分間激しく渦を流します。
3. 塩化鉄(III)(_FeCl3)溶液(10%w/v)
   1. 慎重に重量を量るボートの_FeCl3 の5gを量る。35 mLの_ddH2Oと磁気攪拌棒を含む100 mL測定用シリンダーに移します。
   2. 磁気撹拌板に置き、_FeCl3を溶解し、ddH2Oを最終容積50mLに加える。0.8 μmのシリンジフィルターを通して、保管用のクリーンボトルに_FeCl3ソリューションをフィルターします。
      注: _FeCl3 は腐食性と刺激性です。食べたり、飲んだり、喫煙したり、仕事を離れる前に、手や他の露出した部分を軽い石鹸と水で洗ってください。蒸気の形成を防ぐために、プロセス領域で良好な換気を提供します。霧、蒸気、スプレーを吸い込まないでください。手袋は、塩を取り扱ったり、計量したりする際に常に着用する必要があります。マスクとゴーグルは、使用時には必ずお勧めです。

3. サポートフロートブロックを使用して負の染色サンプルを準備するマイカ上のカーボンサポートフィルムのバッファー交換

1. 洗浄およびプラズマクリーンTEMグリッド。
   注: ここでは、セクション 1 で上記の概略で 300 メッシュの穴あけ -炭素銅グリッドを使用しました。
2. ピペット10-12 μLのサンプルは、浮遊ブロックの(小さいチャネルを使用して)、2%UAc溶液の10-12 μL(セクション2.1を参照)に、隣接する非バッファ交換井戸への負の染色のために(小さいチャネルを有する)。
   注:ウェルの体積は10 μLです。ただし、液体の表面に凸半月板が形成され、適切なフィルムの浮き出しができるようにサンプルの体積を調整します。少量のサンプルはフィルム破損の原因となります。
3. 慎重に上に事前堆積カーボンフィルムとマイカの2つの小片をカット。マイカの破片がウェル(3.4 mm幅)に収まるほど広く、ウェル長さ(3.45mm)よりも長く、炭素が浮遊している間に断片が井戸の上に座り、ピンセットで断片を処理するのに十分なスペースがあることを確認してください。
   注:炭素を処理するには、平らな負の作用の長い先端のピンセットを使用してください。マイカ断片を切断する場合は、炭素膜の完全性を維持するために単一の動きを使用して切断する。
4. マイカがウェルのランプに座り、液体サンプルの表面に炭素の層が観察されるまで、ほぼ45°の角度で井戸にマイカを浸します。
5. サンプルの最初のインキュベーション(通常、サンプルの付着に応じて20〜20分)後、この期間を実験ニーズに基づいて最適化し、マイカシートを非常にゆっくりと引き出して炭素膜を回収し、粘性差し込み残存試料の残留を最小限に抑えます。
6. 濾紙で下面(非カーボン側)をタップしてマイカを慎重にブロットし、その後、2%UAc溶液を含む逆ウェルに塗布して試料を負の汚れに交換する(即ち、ステップ3.4のようにマイカを浸す)。
   注: この時点で、炭素層が染色液の上に浮かんでいるのを観察する必要があります。
7. 洗浄され、プラズマ洗浄EMグリッドの穴のあいたカーボンカバー側で浮遊炭素層を回収します。TEMでイメージングするまで、グリッドをエアドライのままにします。理想的には、空気汚染を避けるために乾燥プロセス中にグリッドをカバーします。

4. 支持浮遊ブロックの適用はグラフェン酸化物コーティングTEMグリッドを準備する

1. 上で概説した300メッシュの穴あき炭素銅格子を使用して、洗浄およびプラズマクリーンTEMグリッド(セクション1)。
2. フローティングブロックに沿って4つの非バッファ交換ウェルにGrOx懸濁液のピペット10-12 μL(セクション2.2を参照) 。ピペット10-12 μL _ddH2Oまたは超純水をブロックの残りの4つのバッファー交換ウェルに入れます。
   注:水のこの量は、ブロックの高さを超えて上昇するわずかな凸半月板を形成するのに十分でなければなりません。
3. 4グリッドを各ウェルのGrOxサスペンションに1分間そっと落とし、穴のあいたカーボンで覆われた側が溶液に接触することを保証します。1分後、ピンセットを各非バッファ交換のピンセット溝に入れて慎重にグリッドを回収します。
4. 非常に穏やかに、簡単に隣接するウェルの_ddH2Oに各グリッドの銅、非炭素で覆われた側面に触れる。その後、慎重かつ穏やかにグリッド、水滴側を下に、ろ過用紙の一部に対して保持します。
   注:水をブロッティングすると、毛細血管のアクションによってグリッドを通してGrOxサスペンションが描画されます。_ddH2O でグリッドを沈めないようにすることが重要なので、接触は非常に簡潔にする必要があります。グリッドが持ち上げられると、水滴がグリッドの下側に保持されるはずです。これはGrOxフレークの沈降を乱す可能性がありますので、フィルター紙のグリッドを移動しないように注意してください。
5. サンプルで調製するまで、ピンセット内のグリッドを空気乾燥にしておきます。理想的には、空気汚染を避けるために乾燥プロセス中にグリッドをカバーします。

5. 単層グラフェンフィルム上のサンプルの調製のための支持浮遊ブロックの適用

1. 上述の図(セクション1)に示すようにTEMグリッドを洗浄しますが、プラズマクリーニングは省略してください。
   注: ここでは、300 メッシュの穴あきカーボンゴールドグリッドが使用されましたが、他の銅以外のグリッドや銅合金グリッドも実用的です。
2. グラフェンを用いてグリッドを堆積させるために、銅(Cu-graphene)基質上で成長したグラフェンから、クライオEMグリッドに直接移し、^{前述の25を挙げた}。
   1. ガラススライドに堆積したCu-grapheneシート(10mm×10mm)の上に4つの洗浄グリッドを置き、各グリッドをイソプロパノール(5〜10 μL)の滴で覆い、単層グラフェンとグリッドの間に密接な接触を可能にします。
      注:グラフェンシートに接触するグリッドの穴のあいたカーボンで覆われた側を配置してください。
   2. イソプロパノールが完全に蒸発したら(通常は2時間)、グリッドを持つCu-grapheneシートを10%(w/v)_FeCl3 溶液(セクション2.3を参照)にガラスペトリ皿に浮かべ、室温で一晩エッチングに残します。空気中の汚染を避けるために皿を覆う。
      注:エッチングが完了した後、グラフェン単層のみが_FeCl3 溶液に浮いたままになります。
   3. TEMグリッドサイズよりも大きな直径のループを使用してグラフェン単層に浮かぶグリッドを釣り、_ddH2Oを含むガラスペトリ皿に慎重に移して洗浄します。
      注:グラフェンフィルムの破損や曲がりを引き起こす可能性のあるペトリ皿の壁にぶつかるのを避けるためにグリッドを釣るときには非常に慎重にしてください。
   4. 釣りグリッドで水でさらに2回洗浄し、すべての残留_FeCl3を除去するためにddH2Oを含むきれいなペトリ皿に転送します。最後に、サンプル調製およびプランジ凍結までサンプルバッファーを含むペトリ皿にグリッドを移します。
      注:グラフェンで覆われたグリッドの側面は、空気中の汚染物質への暴露を避けるために常に濡れた状態に保つ必要があります。
3. サンプル(10-12 μL)を浮遊ブロックの非バッファ交換ウェルにピペットします。サンプルがブロック内で準備ができたら、きれいなピンセットのペアを使用して緩衝液からグラフェンコーティングされたグリッドを選び、サンプル含有ウェルの表面に置きます。
4. 適切なインキュベーション期間(サンプルに応じて1〜5分、実験ニーズに応じて最適化)の後、きれいな凍結ピンセットでグリッドを選び、ブロッティングとガラス化を進めます。

Representative Results

アモルファスカーボン支持体で作製されたTEMグリッドは、通常、グリッド表面全体にわたって覆われています。炭素膜の破損は、いくつかのフリルと一緒に発生するが(図2A)、グリッドの正方形の数が自然のままであり、したがって、負の染色の目的のために広く適用されます。支持の完全性に影響を与える主な要因は、炭素蒸発の間に決定される炭素厚さである。同様に、この GrOx プロトコルでは、グリッド全体にわたって良好なカバレッジが日常的に実現されます (図 2B)。1分間のGrOx懸濁液の単一のアプリケーションは、フレークエッジのために見やすい複数の層を持ついくつかの領域を確保するのに十分です。GrOxグリッドは原料からすぐに準備でき、サンプルの高度な保護である。ただし、フレークエッジ、不完全なカバレッジ、およびラッフルは、GrOxフレークの性質上、他の技術よりもGrOxグリッドでより頻繁に見られます。

グラフェン支持膜の完全性は、非晶質炭素と同様に、堆積過程に依存するが、十分に覆われている領域は、単層グラフェンの特徴的な回折パターンを表示する。重要なことに、グラフェン支持膜を湿潤にしておくことで、サンプルはインキュベーション期間後の浮遊ブロックから回収することができ、データは単粒子分析に適した方法で収集される。この方法は、湿潤のためのグラフェンの他の処理を必要とせず、それによりグラフェンを親水性にレンダリングするための高価な機器の要件を取り除き、サンプル調製およびグリッド凍結の直前に支持膜を調製するのが最善である(図2C)。

図1:サポートフィルムの準備中のサンプル浮遊ブロック設計と適用. (A)形状、深さ、および傾斜の測定値を含む浮遊ブロックの上、井戸、および側面図の概図。ピンシーザーの先端が休む溝、ならびに針を挿入するチャネルが示されている。(B)アモルファス炭素層は、バタリに染色されたTEMグリッドの調製中 に、すなわち、浮遊ブロックのウェル内に含まれるバッファの表面に容易に浮かべることができる。(C)ウェルの幅は1つのTEMグリッドを収容するのに適していますが、トゥイザー溝は準備段階で不必要にグリッドを解放して拾う必要性を減らしますが、グリッドが解放された場合に曲がるリスクなしにグリッドを回復するための定義されたパスを提供します。 B の画像は ²⁷から変更されます。略語: TEM = 透過電子顕微鏡. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:浮遊ブロックを用いて作製したサンプル支持フィルムの代表的な例グリッド四角形(左)および画像(右)ビューは、(A)アモルファスカーボン、(B)酸化グラフェン、および(C)浮遊ブロックを用いて調製したグラフェン支持フィルムについて示されている。非晶質炭素支持体は、陰性染色のための70Sリボソームの調製に使用されたが、一方、酸化グラフェンおよびグラフェン支持体は、クライオEMのための70Sリボソームの調製に使用された。AとCの画像は²⁷から変更されます。グリッド四角形のスケールバー = 10 μm;BおよびCグリッドの正方形のスケールバー = 5 μm;A-C イメージ ビューのスケール バー = 50 nm。略語: クライオEM = クライオ電子顕微鏡.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

本論文では、サンプル浮遊^block27を用いたクライオEMサンプル調製用の非晶質炭素及びグラフェンフィルムの取り扱いに関するプロトコルを紹介する。サポートブロックのSTLファイルは、パブリックThingiverseリポジトリ[www.thingiverse.com/thing:3440684]から自由に入手でき、適切な樹脂から任意の適切なステレオリソグラフィプリンタで3Dプリントすることができます。TEMグリッドを覆う炭素フィルムの使用は、通常、サンプル²⁸に炭素浮遊を伴う。負の染色グリッドを準備するこのアプローチは、サポートの取り扱い時の空気暴露を最小限に抑え、コンタミネーションとタンパク質の変性を低減します。小さな井戸に浮遊炭素を使用するグリッドの調製は、より大きな表面積、 すなわち、水浴またはペトリ皿に浮遊することに有利であり、その場合、炭素の機械的剪断がはるかに容易に起こる。

UAcは、公開時点での現在の安全衛生規制により購入が困難な場合があります。他にも多くの一般的に使用される、非放射性、陰性染色試薬が入手可能であり、それらの調製のためのプロトコルは、以前²⁹に記載されている。このサポートフロートブロックでは代替染色は使用されていませんが、サンプルによるインキュベーション時間の最適化(ステップ3.5)以外に、これらのプロトコルに違いが生じそうにありません。このGrOxサポート調製プロトコルの重要なステップはステップ4.4で、水とGrOx溶液がグリッドエッジの周りに接触するのを防ぐためにノートで強調されています。水とGrOx溶液の不適切な混合は毛細管作用によるGrOxフレークの単方向の沈降を防ぐ。炭素箔の両側にGrOxフレークを持つことは厚い層をもたらし、GrOxをほぼ単一層支持として使用することや、フレーク間の水をトラップする利点を否定し、氷の追加層で使用可能な領域の汚染を引き起こす。グラフェン酸化物支持剤は、フレキシブルポリオレフィン膜上の溶液の液滴を用いて比較的容易に達成できる。しかし、そのように実行すると、誤った誤差を取り扱うことによって、誤ってグリッドの銅側を汚染する方が簡単です。浮動ブロックを使用すると、この不測の事態の可能性が減少します。

最後に、グラフェンで覆われたグリッドを準備するプロトコルを提示し、それを親水性にするためのグラフェン前処理を避け、コストを削減し、アクセシビリティを高めます。試料調製を通して湿ったフィルムを維持し、凍結直前 にブロック内のその場で 試料を塗布することで、均質なサンプル分布を有するcryo-EMに適した氷層を生成するのに十分である。全体として、ここで紹介するプロトコルは、空気と水の界面とのサンプル接触を最小限に抑え、従ってサンプルの変性および支持汚染を減らす。これらのアプローチで使用される3つの支持膜では、均質なサンプル分布をグリッド全体で達成し、無傷で保存状態の良い単一粒子のイメージングを行うことができました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basic Plasma Cleaner (230 V)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Dumont tweezers N5A INOX.	Dumont Swissmade	0302-N5A-PO
Dumont tweezers NGG INOX.	Dumont Swissmade	0102-NGG-PO
Ehtylacetate	Sigma-Aldrich	270989-250ML
Fishing Loops 10 μL	VWR	612-9353
Graphene Oxide 2 mg/mL	Sigma-Aldrich	763705-25ML
Iron (III) chloride	Sigma-Aldrich	31232-250MG
Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm	Agar Scientific	AGG250-1	We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm
Monolayer Graphene on Cu	Graphenea	N/A	10 mm x 10 mm, pack of 4
n-dodecyl β-D-maltoside (DDM)	GLYCON Biochemicals GmbH	D97002-C
Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids	Enzo Life Sciences	JBS-X-101-Cu300
Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids	Enzo Life Sciences	JBS-X-102-Cu300
Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids	Electron Microscopy Sciences	Q350AR1
Scissors	Agar Scientific	AGT577
Uranyl Acetate	TAAB Laboratories Equipment	U001
Vitrobot Mark IV	FEI	N/A
Whatman filter paper 55 mm	GE Healthcare Life Sciences	1441-055
Whatman filter paper 70 mm	GE Healthcare Life Sciences	1441-070