Summary
La préparation des échantillons pour la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est un goulot d’étranglement important dans le flux de travail de détermination de la structure de cette méthode. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour l’utilisation d’un bloc imprimé en trois dimensions facile à utiliser pour la préparation de films de support afin de stabiliser les échantillons pour les études EM de transmission.
Abstract
La détermination de la structure par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) s’est rapidement développée au cours de la dernière décennie; toutefois, la préparation des échantillons demeure un goulot d’étranglement important. Les échantillons macromoléculaires sont idéalement imagés directement à partir d’orientations aléatoires dans une fine couche de glace vitrée. Cependant, de nombreux échantillons sont réfractaires à cela, et la dénaturation des protéines à l’interface air-eau est un problème courant. Pour surmonter ces problèmes, des films de support - y compris le carbone amorphe, le graphène et l’oxyde de graphène - peuvent être appliqués à la grille pour fournir une surface que les échantillons peuvent peupler, réduisant ainsi la probabilité que les particules subissent les effets délétères de l’interface air-eau. L’application de ces supports délicats sur les grilles nécessite toutefois une manipulation minutieuse pour éviter la casse, la contamination en suspension dans l’air ou des étapes de lavage et de nettoyage étendues. Un rapport récent décrit le développement d’un bloc de flottaison facile à utiliser qui facilite le transfert humide des films de support directement à l’échantillon. L’utilisation du bloc minimise le nombre d’étapes de manipulation manuelle requises, préservant l’intégrité physique du film de support et le temps pendant lequel la contamination hydrophobe peut s’accumuler, garantissant ainsi qu’un mince film de glace peut encore être généré. Cet article fournit des protocoles étape par étape pour la préparation de supports de carbone, de graphène et d’oxyde de graphène pour les études EM.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, les percées, principalement dans la technologie des détecteurs, mais aussi dans d’autres domaines techniques, ont facilité une succession d’augmentations substantielles de la résolution à laquelle les systèmes biologiquement pertinents peuvent être imagés par microscopie électronique à transmission (TEM)1,2. Malgré le fait que cryo-EM permet déjà la résolution de structures à haute résolution à partir d’aussi peu que 50 μg de protéines grâce à l’analyse monoparticulaire (SPA), la préparation d’échantillons et de grilles cryo-EM reste un goulot d’étranglement majeur3,4,5. Les échantillons de SPA sont constitués de macromolécules réparties approximativement au hasard dans une couche de glace vitrée. La glace doit être aussi fine que possible pour maximiser la différence de contraste entre les particules et le solvant. Les macromolécules biologiques sont plus stables (c.-à-d. moins susceptibles de perdre leur structure native) dans la glace plus épaisse, car elles restent mieux solvatées. De plus, les particules sont souvent beaucoup mieux réparties dans le champ de vision dans la glace beaucoup plus épaisse que la taille des particules6 et peuvent souvent ne pas être trouvées dans les trous dans les films de carbone.
De plus, des couches de glace plus épaisses diminuent la probabilité que les molécules soient proches de l’interface air-eau en raison du rapport surface/volume élevé, et il a été estimé que l’utilisation de méthodes standard de congélation par immersion pour les études cryo-EM entraîne l’adsorption d’environ 90 % des particules sur l’interface air-eau7. Une glace plus épaisse entraîne un fond trop élevé en raison de l’augmentation des événements de diffusion dans le solvant et de l’atténuation concomitante du signal6,7. Il est donc nécessaire d’obtenir une couche de glace vitreuse aussi mince que possible; idéalement, la couche ne serait que légèrement plus épaisse que la particule. Le défi pour le chercheur, qui doit être surmonté pour chaque échantillon différent appliqué à une grille, est de préparer des échantillons suffisamment minces pour l’imagerie à contraste élevé tout en maintenant l’intégrité structurelle des particules dans leur échantillon. L’adsorption des protéines à l’interface air-eau s’accompagne de plusieurs effets, généralement délétères.
Premièrement, la liaison des protéines à cette interface hydrophobe induit souvent une dénaturation de la protéine, qui se déroule rapidement et est généralement irréversible8,9. Une étude menée à l’aide de la synthase d’acide gras de levure a montré que jusqu’à 90% des particules adsorbées sont dénaturées10. Deuxièmement, les preuves d’une étude comparant la distribution d’orientation des ensembles de données de ribosomes 80S collectés soit sur du carbone amorphe11 ou sans support12 ont montré que l’interface air-eau peut provoquer une orientation préférentielle sévère compromettant la reconstruction 3D du volume13. Les méthodes permettant de réduire l’interaction des particules avec l’interface air-eau comprennent la supplémentation du tampon de congélation avec des tensioactifs (tels que des détergents), l’utilisation de films de support, la capture d’affinité ou l’échafaudage de substrats et des temps de plongée accélérés. L’utilisation de tensioactifs est associée à ses propres problèmes, car certains échantillons de protéines peuvent se comporter de manière non idéale en leur présence, tandis que les substrats de capture d’affinité et d’échafaudage nécessitent généralement des surfaces de grille et des stratégies de capture sur mesure. Enfin, bien qu’il y ait beaucoup de recherches sur le développement de dispositifs à plongeon rapide14,15,16, ceux-ci nécessitent des appareils qui ne sont généralement pas largement disponibles.
Bien que la grille TEM standard pour la cryo-EM biologique comporte déjà une feuille de carbone amorphe perforée17, il existe un certain nombre de protocoles disponibles pour la génération de films de support supplémentaires et leur transfert vers les grilles TEM. L’utilisation de ces films est une méthode établie de longue date pour la stabilisation des échantillons18. Les supports en carbone amorphe sont générés par évaporation et dépôt sur des feuilles de mica cristallines19, à partir desquelles les couches peuvent être flottantes sur des grilles, avec l’utilité des supports de flottaison comme outils utiles établis dans des rapports antérieurs20. Les flocons d’oxyde de graphène, généralement préparés à l’aide d’une version modifiée de la méthode Hummers21, ont été utilisés comme structure de support préférable au carbone amorphe pour leur signal de fond diminué ainsi que pour la capacité d’immobiliser et de stabiliser les macromolécules22. Plus récemment, l’utilisation du graphène comme film de support TEM a suscité un regain d’intérêt en raison de sa stabilité mécanique, de sa conductivité élevée, de sa contribution extrêmement faible au bruit de fond23, ainsi que de l’émergence de méthodes reproductibles pour générer de grandes surfaces macroscopiques de graphène monocouche24 et le transférer dans des grilles TEM25 . Comparé au carbone amorphe, qui subit des mouvements induits par le faisceau similaires, voire pires, que la glace dépourvue de film de support11,12,17, le graphène a montré une réduction significative du mouvement induit par le faisceau des images cryo-EM12.
Cependant, alors que le graphène hydrophilisé protégeait l’acide gras synthase de la dénaturation interfaciale air-eau, les auteurs de cette étude ont noté que le graphène était contaminé lors de la préparation de l’échantillon, probablement en raison d’une combinaison de contamination par les hydrocarbures atmosphériques et du réactif utilisé pour hydrophiliser les grilles10. En effet, malgré de nombreuses qualités supérieures du graphène, son utilisation généralisée est encore entravée par la dérivatisation nécessaire pour diminuer son hydrophobicité12, qui est finalement chimiquement difficile et nécessite un équipement spécialisé. Cet article présente des protocoles pour la préparation de supports d’échantillons de carbone amorphe, d’oxyde de graphène et de graphène à l’aide d’un bloc de flottaison d’échantillon imprimé en trois dimensions (3D27) pour transférer directement les films de support des substrats sur lesquels ils ont été générés vers des grilles TEM (Figure 1). L’un des principaux avantages de l’utilisation d’un tel dispositif est le transfert humide des films, minimisant la contamination hydrophobe des supports et, par conséquent, la nécessité d’un traitement supplémentaire, et réduisant le nombre d’étapes de manipulation manuelle potentiellement dommageables. Ces approches sont peu coûteuses à mettre en œuvre et donc largement accessibles et applicables aux études cryo-EM où des supports d’échantillons sont nécessaires.
Protocol
1. Préparation générale du transfert de pré-support des réseaux TEM
- À l’aide d’une paire de pinces à épiler propres et fines, soulevez et immergez les grilles TEM séquentiellement dans de l’eau double distillée (ddH2O) ou de l’eau ultrapure pendant 10 à 15 s, suivie d’acétate d’éthyle pendant 10 à 15 s.
REMARQUE: Ici, des pinces à épiler à action négative et à pointe oblique ont été utilisées. - Placez la pince à épiler, avec la grille toujours en main, d’un côté pour sécher à l’air libre pendant environ 5 min.
- Nettoyez les grilles au plasma pour dépouiller la surface de tout contaminant accumulé par l’air ou les étapes de lavage.
REMARQUE: Ici, le nettoyage au plasma a été effectué pendant 10-15 s dans l’air avec une puissance de radiofréquence de 25 W.
2. Préparation générale des solutions de réactifs
- Solution d’acétate d’uranyle (UAc) (2 % p/v)
- Envelopper un tube de 50 mL dans du papier d’aluminium, remplir de 50 mL d’eau ultrapure et ajouter 1 g de poudre d’UAc.
REMARQUE: UAc est sensible à la lumière et précipite avec le temps lorsqu’il est exposé. Comme l’UAc est radioactif et toxique, maintenez un niveau élevé de propreté. Avec le danger le plus grave résultant de l’inhalation ou de l’ingestion, des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter toute possibilité d’inhalation de particules fines. Des gants doivent toujours être portés lors de la manipulation ou de la pesée des sels d’uranium. Masques et lunettes fortement recommandés. Les sels d’uranium doivent être éliminés conformément aux exigences légales établies pour les dangers radioactifs dans l’État. - Laisser la solution remuer pendant 1 h pour permettre à tout l’UAc de se dissoudre. Conserver à 4°C.
- Avant utilisation, filtrer 1 mL de la solution de coloration dans un petit flacon à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour éliminer les cristaux d’acétate restants.
- Envelopper un tube de 50 mL dans du papier d’aluminium, remplir de 50 mL d’eau ultrapure et ajouter 1 g de poudre d’UAc.
- Suspension d’oxyde de graphène (GrOx)
- Pipette 2,5 μL de GrOx dans un tube de 1,5 mL (concentration finale de 1 %). Pipeter 2,5 μL de détergent n-dodécyl β-D-maltoside (DDM) à 10 % (p/v) dans le GrOx et mélanger doucement (concentration finale de 0,1 % (p/v)).
- Ajouter 245 μL d’eau ultrapure au mélange GrOx-DDM, et immédiatement vortex vigoureusement pendant 5 min. Utiliser la suspension GrOx dans les 1 h suivant la préparation, vortex vigoureusement pendant au moins 1 min avant utilisation immédiate.
- Solution de chlorure de fer(III) (FeCl3) (10 % p/v)
- Peser soigneusement 5 g de FeCl3 dans un bateau de pesage. Transfert dans un cylindre de mesure de 100 mL contenant 35 mL de ddH2O et une barre d’agitation magnétique.
- Placer sur une plaque d’agitation magnétique et dissoudre FeCl3 en ajoutant du ddH2O à un volume final de 50 mL. Filtrer la solution de FeCl3 à travers un filtre à seringue de 0,8 μm dans un flacon propre pour le stockage.
REMARQUE: FeCl3 est corrosif et irritant; se laver les mains et les autres zones exposées avec de l’eau et du savon doux avant de manger, de boire ou de fumer et en quittant le travail. Fournir une bonne ventilation dans la zone de traitement pour empêcher la formation de vapeur. Ne respirez pas la brume, les vapeurs, vaporisez. Les gants doivent toujours être portés lors de la manipulation ou de la pesée du sel. Masques et lunettes fortement recommandés chaque fois qu’ils sont utilisés.
3. Échange de tampon pour les films de support de carbone sur le mica pour préparer des échantillons colorés négativement à l’aide du bloc de flottaison de support
- Laver et nettoyer les grilles TEM au plasma.
REMARQUE: Ici, 300 grilles de cuivre trouées-carbone à mailles ont été utilisées comme indiqué ci-dessus dans la section 1. - Pipette 10-12 μL d’échantillon dans le puits d’échange tampon (avec les petits canaux) du bloc de flottaison et 10-12 μL de solution d’UAc à 2% (voir rubrique 2.1) pour la coloration négative dans le puits d’échange non tampon adjacent.
REMARQUE: Le puits a un volume de 10 μL; cependant, ajustez le volume de l’échantillon de sorte qu’un ménisque convexe se forme à la surface du liquide pour permettre une bonne flottation du film. Un faible volume d’échantillon peut provoquer une rupture du film. - Coupez soigneusement deux petits morceaux de mica avec un film de carbone prédéposé sur le dessus. Assurez-vous que les fragments de mica sont suffisamment larges pour s’insérer dans le puits (3,4 mm de largeur) et plus longs que la longueur du puits (3,45 mm), de sorte que le fragment reste sur le puits pendant que le carbone flotte et qu’il y ait suffisamment d’espace pour manipuler le fragment avec la pince à épiler.
REMARQUE: Pour manipuler le carbone, utilisez une pince à épiler plate à action négative à longue pointe. Lors de la découpe des fragments de mica, coupez en un seul mouvement pour maintenir l’intégrité du film de carbone. - Immerger le mica dans le puits avec un angle approximatif de 45° jusqu’à ce que le mica se trouve sur la rampe du puits et qu’une couche de carbone soit observée à la surface de l’échantillon liquide.
- Après l’incubation initiale sur l’échantillon (généralement de 20 s à 20 min selon l’adhérence de l’échantillon; optimiser cette période en fonction des besoins expérimentaux), retirer la feuille de mica très lentement pour récupérer le film de carbone et minimiser la rétention résiduelle de l’échantillon visqueux.
- Épongez soigneusement le mica en tapotant la surface inférieure (côté non carbone) avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide, puis échangez le carbone contenant l’échantillon en tache négative par application sur le puits opposé (c.-à-d. immerger le mica comme à l’étape 3.4) contenant la solution d’UAc à 2%.
REMARQUE: Une couche de carbone doit être observée flottant sur le dessus de la solution de coloration à ce stade. - Récupérez la couche de carbone flottante avec le côté troué recouvert de carbone d’une grille EM lavée et nettoyée au plasma. Laissez les grilles sécher à l’air libre jusqu’à l’imagerie sur un TEM. Idéalement, couvrez les grilles pendant le processus de séchage pour éviter la contamination en suspension dans l’air.
4. Application du bloc de flottaison de support pour préparer des grilles TEM revêtues d’oxyde de graphène
- Laver et nettoyer les grilles TEM au plasma à l’aide de grilles en cuivre à 300 mailles en carbone troué comme indiqué ci-dessus (section 1).
- Pipette 10-12 μL de suspension de GrOx (voir section 2.2) dans les 4 puits d’échange non tampons le long du bloc de flottaison. Pipette 10-12 μL ddH2O ou eau ultrapure dans les 4 puits d’échange tampon restants du bloc.
REMARQUE: Ce volume d’eau doit être suffisant pour former un léger ménisque convexe s’élevant au-dessus de la hauteur du bloc. - Déposer doucement 4 grilles sur la suspension GrOx de chaque puits pendant 1 min, en veillant à ce que le côté percé de carbone entre en contact avec la solution. Après 1 min, récupérez soigneusement chaque grille en faisant glisser la pince à épiler dans la rainure de la pince de chaque puits d’échange non tampon.
- Touchez très doucement et brièvement le côté en cuivre, non recouvert de carbone de chaque grille jusqu’au ddH2O dans le puits adjacent. Ensuite, maintenez soigneusement et doucement la grille, côté gouttelette d’eau vers le bas, contre un morceau de papier filtre.
REMARQUE: Le buvard de l’eau attirera la suspension de GrOx à travers la grille par action capillaire. Il est crucial d’éviter d’immerger la grille dans le ddH2O, le contact doit donc être très bref. Lorsque la grille est soulevée, une gouttelette d’eau doit retenir le dessous de la grille. Veillez à ne pas déplacer la grille sur le papier filtre car cela pourrait perturber la décantation des flocons de GrOx. - Laissez sécher les grilles dans la pince à épiler jusqu’à ce qu’elles soient préparées avec l’échantillon. Idéalement, couvrez les grilles pendant le processus de séchage pour éviter la contamination en suspension dans l’air.
5. Application du bloc de flottaison de support pour la préparation d’échantillons sur des films monocouche-graphène
- Lavez les grilles TEM comme indiqué ci-dessus (section 1), mais en omettant le nettoyage au plasma.
REMARQUE: Ici, 300 grilles en or troué-carbone ont été utilisées, mais d’autres grilles non en cuivre ou en alliage de cuivre sont également réalisables. - Pour déposer des grilles avec du graphène, transférez directement du graphène cultivé sur des substrats de cuivre (Cu-graphène) vers des grilles cryo-EM, comme décrit précédemment25.
- Placez quatre grilles lavées sur une feuille de Cu-graphène (10 mm × 10 mm) déposée sur une lame de verre et recouvrez chaque grille d’une goutte d’isopropanol (5-10 μL) pour permettre un contact intime entre le graphène monocouche et la grille.
REMARQUE: Assurez-vous de placer le côté troué recouvert de carbone des grilles en contact avec la feuille de graphène. - Lorsque l’isopropanol est complètement évaporé (généralement 2 h), faire flotter la feuille de Cu-graphène avec des grilles sur une solution de FeCl3 à 10 % (p/v) (voir rubrique 2.3) dans une boîte de Petri en verre et laisser graver à température ambiante pendant la nuit. Couvrir le plat pour éviter la contamination en suspension dans l’air.
REMARQUE: Une fois la gravure terminée, seule la monocouche de graphène restera flottante sur la solution FeCl3 - cela devrait être visible à l’œil nu avec un éclairage approprié. - Utilisez une boucle d’un diamètre supérieur à la taille de la grille TEM pour pêcher les grilles flottant sur la monocouche de graphène et transférez-les soigneusement dans une boîte de Petri en verre contenant du ddH2O pour les laver.
REMARQUE: Soyez extrêmement prudent lorsque vous pêchez les grilles pour éviter de heurter les parois de la boîte de Pétri, ce qui peut provoquer une rupture ou une flexion du film de graphène. - Laver deux fois de plus dans l’eau en pêchant des grilles et transférer dans une boîte de Petri propre contenant du ddH2O pour éliminer tout FeCl3 résiduel. Enfin, transférez les grilles dans une boîte de Pétri contenant un tampon d’échantillon jusqu’à la préparation de l’échantillon et la congélation.
REMARQUE: Le côté recouvert de graphène des grilles doit être maintenu mouillé en tout temps pour éviter leur exposition aux contaminants en suspension dans l’air.
- Placez quatre grilles lavées sur une feuille de Cu-graphène (10 mm × 10 mm) déposée sur une lame de verre et recouvrez chaque grille d’une goutte d’isopropanol (5-10 μL) pour permettre un contact intime entre le graphène monocouche et la grille.
- Pipeter l’échantillon (10-12 μL) dans un puits d’échange non tampon du bloc de flottaison. Lorsque l’échantillon est prêt dans le bloc, choisissez une grille recouverte de graphène dans la solution tampon à l’aide d’une pince à épiler propre et placez-la sur la surface du puits contenant l’échantillon.
- Après une période d’incubation appropriée (1 à 5 minutes selon l’échantillon; optimiser en fonction des besoins expérimentaux), choisissez la grille avec une paire de pinces à épiler propres et procédez au buvard et à la vitrification.
Representative Results
Les grilles TEM préparées avec des supports en carbone amorphe sont généralement recouvertes sur toute la surface de la grille. Bien que la rupture du film de carbone se produise dans certains cas avec quelques ébouriffements (Figure 2A), un grand nombre de carrés de grille sont immaculés et donc largement applicables à des fins de coloration négative. Le principal facteur affectant l’intégrité du support est l’épaisseur du carbone, qui est déterminée lors de l’évaporation du carbone. De même, avec ce protocole GrOx, une bonne couverture est régulièrement obtenue sur l’ensemble du réseau (Figure 2B). Une seule application de suspension GrOx pendant 1 min est suffisante pour assurer peu de zones avec plusieurs couches, qui sont faciles à voir en raison des bords en flocons. Les grilles grOx peuvent être préparées rapidement à partir de matières premières et sont très protectrices de l’échantillon. Cependant, les bords en flocons, la couverture incomplète et les volants sont plus fréquemment visibles avec les grilles GrOx que pour les autres techniques en raison de la nature des flocons GrOx.
Bien que l’intégrité du film de support de graphène, comme le carbone amorphe, dépende du processus de dépôt, les zones bien couvertes présentent le motif de diffraction caractéristique du graphène monocouche. Il est important de noter qu’en maintenant les films de support en graphène mouillés, les échantillons peuvent être récupérés du bloc de flottaison après une période d’incubation et les données collectées d’une manière propice à l’analyse d’une seule particule. Cette méthode ne nécessite aucun autre traitement du graphène pour le mouillage, éliminant ainsi la nécessité d’un équipement coûteux pour rendre le graphène hydrophile, et il est préférable de préparer des films de support peu de temps avant la préparation de l’échantillon et la congélation de la grille (Figure 2C).
Figure 1 : Conception et application du bloc de flottaison de l’échantillon pendant la préparation du film de support. (A) Schéma des vues supérieures, de puits et latérales du bloc de flottaison, y compris les mesures de la forme, de la profondeur et de l’inclinaison. La rainure pour que les embouts de la pince à reposer, ainsi que les canaux pour insérer des aiguilles, sont indiqués. (B) Les couches de carbone amorphes peuvent facilement être flottées sur la surface du tampon contenu dans les puits du bloc de flottaison à l’aide de la rampe, c’est-à-dire lors de la préparation de grilles TEM colorées négativement. (C) La largeur des puits est adaptée pour accueillir une grille TEM, tandis que les rainures de la pince à épiler réduisent le besoin de libérer et de ramasser inutilement les grilles pendant les étapes de préparation, mais offrent un chemin défini pour récupérer les grilles sans risque de flexion si les grilles sont libérées. Les images en B sont modifiées à partir de 27. Abréviation : TEM = microscopie électronique à transmission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples typiques d’exemples de films de support préparés à l’aide du bloc de flottaison. Les vues carrées de la grille (à gauche) et de l’image (à droite) sont montrées pour (A) le carbone amorphe, (B) l’oxyde de graphène et (C) les films de support de graphène préparés à l’aide du bloc de flottation. Le support en carbone amorphe a été utilisé dans la préparation des ribosomes 70S pour la coloration négative, tandis que les supports en oxyde de graphène et en graphène ont été utilisés dans la préparation des ribosomes 70S pour cryo-EM. Les images en A et C sont modifiées à partir de 27. Barre d’échelle pour un carré de grille A = 10 μm; barres d’échelle pour les carrés de grille B et C = 5 μm; barres d’échelle pour les vues d’image A-C = 50 nm. Abréviation : cryo-EM = cryo-microscopie électronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Cet article présente des protocoles pour la manipulation de films de carbone et de graphène amorphes pour la préparation d’échantillons cryo-EM à l’aide d’un bloc de flottaison d’échantillon27. Un fichier STL pour le bloc de support est disponible gratuitement à partir du dépôt public Thingiverse [www.thingiverse.com/thing:3440684], et peut être imprimé en 3D avec n’importe quelle imprimante stéréolithographique appropriée à partir d’une résine appropriée. L’utilisation de films de carbone recouvrant une grille TEM implique généralement la flottaison du carbone sur l’échantillon28. Cette approche de préparation des grilles de taches négatives minimise l’exposition à l’air lors de la manipulation du support, réduisant ainsi la contamination et la dénaturation des protéines. La préparation de grilles utilisant du carbone flottant dans de petits puits est avantageuse pour faire flotter une plus grande surface, c’est-à-dire dans un bain-marie ou une boîte de Pétri, auquel cas le cisaillement mécanique du carbone se produit beaucoup plus facilement.
UAc peut être difficile à acheter en raison des réglementations en vigueur en matière de santé et de sécurité au moment de la publication. De nombreux autres réactifs de coloration négative, non radioactifs et couramment utilisés, sont disponibles, et les protocoles de leur préparation ont été décrits précédemment29. Bien que des colorations alternatives n’aient pas été utilisées avec ce bloc de flottaison de support, il est peu probable qu’il y ait des différences dans ces protocoles en dehors de l’optimisation du temps d’incubation avec l’échantillon (étape 3.5), qui est déjà intrinsèquement dépendant de l’échantillon. L’étape clé de ce protocole de préparation du support GrOx est l’étape 4.4, mise en évidence par la note visant à empêcher l’eau et la solution GrOx d’entrer en contact autour du bord de la grille. Un mélange inapproprié de l’eau et des solutions de GrOx empêche la décantation unidirectionnelle des flocons de GrOx par action capillaire. Avoir des flocons de GrOx des deux côtés de la feuille de carbone donne des couches épaisses, annulant ainsi les avantages de l’utilisation de GrOx comme support de couche presque unique, ainsi que le piégeage de l’eau entre les flocons, ce qui provoque la contamination des zones utilisables avec des couches supplémentaires de glace. La préparation de support d’oxyde de graphène est relativement facile à réaliser en utilisant des gouttelettes de solution sur un film de polyoléfine flexible. Cependant, lorsqu’il est effectué de cette manière, il est plus facile de contaminer accidentellement le côté cuivre du réseau par des erreurs de manipulation; l’utilisation du bloc de flottaison réduit la probabilité de cette éventualité.
Enfin, cet article présente un protocole pour préparer des grilles recouvertes de graphène qui évite tout type de prétraitement du graphène pour le rendre hydrophile, réduisant ainsi son coût et augmentant son accessibilité. Le maintien d’un film mouillé tout au long de la préparation de l’échantillon et l’application de l’échantillon in situ dans le bloc juste avant la congélation sont suffisants pour permettre la génération de couches de glace appropriées pour la cryo-EM avec une distribution homogène de l’échantillon. Dans l’ensemble, les protocoles présentés ici minimisent le contact de l’échantillon avec l’interface air-eau, réduisant ainsi la dénaturation de l’échantillon et la contamination du support. Pour les trois films de support utilisés dans ces approches, des distributions d’échantillons homogènes ont pu être obtenues à travers les grilles ainsi que l’imagerie de particules uniques intactes et bien préservées.
Disclosures
Les auteurs n’ont connaissance d’aucun conflit d’intérêts à l’égard de ce travail.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres de la Section de biologie structurale et synthétique de l’Imperial College de Londres qui ont aidé à tester ces techniques, ainsi que Harry Barnett de l’Imperial College Advanced Hackspace et Paul Simpson du Centre de biologie structurale. ChSA est soutenu par une bourse Sir Henry Dale financée conjointement par le Wellcome Trust et la Royal Society (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E. Preparation of Graphitic Oxide. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339 (1958).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
