Prøvepreparering for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er en betydelig flaskehals i strukturbestemmelsesarbeidsflyten til denne metoden. Her tilbyr vi detaljerte metoder for å bruke en brukervennlig, tredimensjonalt trykt blokk for utarbeidelse av støttefilmer for å stabilisere prøver for em-studier av overføring.
Strukturbestemmelse ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har vokst raskt det siste tiåret; Prøvepreparering forblir imidlertid en betydelig flaskehals. Makromolekylære prøver er ideelt avbildet direkte fra tilfeldige orienteringer i et tynt lag med glassaktig is. Imidlertid er mange prøver ildfaste mot dette, og protein denaturering ved luftvannsgrensesnittet er et vanlig problem. For å overvinne slike problemer, støtte filmer – inkludert amorf karbon, grafen og grafenoksid – kan brukes på rutenettet for å gi en overflate som prøver kan fylle, noe som reduserer sannsynligheten for at partikler opplever de skadelige effektene av luftvanngrensesnittet. Anvendelsen av disse delikate støttene til gitter krever imidlertid forsiktig håndtering for å forhindre brudd, luftbåren forurensning eller omfattende vaske- og rengjøringstrinn. En fersk rapport beskriver utviklingen av en brukervennlig flyteblokk som letter fuktet overføring av støttefilmer direkte til prøven. Bruk av blokken minimerer antall manuelle håndteringstrinn som kreves, bevarer den fysiske integriteten til støttefilmen, og tiden som hydrofob forurensning kan påløpe, og sikrer at en tynn isfilm fortsatt kan genereres. Dette dokumentet inneholder trinnvise protokoller for fremstilling av karbon-, grafen- og grafenoksidstøtter for EM-studier.
I løpet av det siste tiåret har gjennombrudd, hovedsakelig innen detektorteknologi, men også på andre tekniske felt, lagt til rette for en rekke betydelige økninger i oppløsningen der biologisk relevante systemer kan avbildes ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM)1,2. Til tross for at cryo-EM allerede tillater oppløsning av høyoppløselige strukturer fra så lite som 50 μg protein gjennom enpartikkelanalyse (SPA), forblir kryo-EM-prøve og nettforberedelse store flaskehalser3,4,5. SPA-prøver består av makromolekyler fordelt omtrent tilfeldig innenfor et lag med glassaktig is. Isen må være så tynn som mulig for å maksimere kontrastforskjellen mellom partiklene og løsningsmidlet. Biologiske makromolekyler er mer stabile (dvs. mindre sannsynlig å miste sin opprinnelige struktur) i tykkere is, fordi de forblir bedre løst. Videre er partikler ofte funnet å være mye bedre fordelt over synsfeltet i is mye tykkere enn partikkelstørrelsen6 og kan ofte ikke bli funnet i hull i karbonfilmene i det hele tatt.
I tillegg reduserer tykkere lag med is sannsynligheten for at molekyler er nær luftvannsgrensesnittet på grunn av det høye forholdet mellom overflate og volum, og det er anslått at bruk av standard frysingsmetoder for kryo-EM-studier resulterer i adsorpsjon av ~ 90% av partiklene til luftvannsgrensesnittet7. Tykkere is resulterer i uønsket høy bakgrunn på grunn av økte spredningshendelser i løsningsmidlet og samtidig demping av signalet6,7. Det er derfor nødvendig å oppnå et så tynt lag med glassaktig is som mulig; Ideelt sett ville laget bare være litt tykkere enn partikkelen. Utfordringen for forskeren, som må overvinnes for hver enkelt prøve som brukes på et rutenett, er å forberede prøver tynne nok til høykontrastavbildning samtidig som partiklenes strukturelle integritet opprettholdes i prøven. Protein adsorpsjon til luft-vann-grensesnittet er ledsaget av flere, vanligvis skadelige, effekter.
For det første induserer binding av proteiner til dette hydrofobe grensesnittet ofte denaturering av proteinet, som fortsetter raskt og vanligvis er irreversibel8,9. En studie utført ved hjelp av gjærfettsyresyntase viste at opptil 90% av adsorberte partikler denatureres10. For det andre viste bevis fra en studie som sammenlignet orienteringsfordelingen av 80S ribosomedatasett samlet inn enten på amorf karbon11 eller uten støtte12, at luftvanngrensesnittet kan forårsake alvorlig preferanseorientering som kompromitterer 3D-rekonstruksjon av volumet13. Metoder for å redusere partikkelinteraksjon med luftvannsgrensesnittet inkluderer tilskudd av frysebufferen med overflateaktive stoffer (for eksempel vaskemidler), bruk av støttefilmer, affinitetsfangst eller stillas av substrater og akselererte stupetider. Bruken av overflateaktive stoffer er forbundet med sine egne problemer, da noen proteinprøver kan oppføre seg ikke-ideelt i deres nærvær, mens affinitetsfangst og stillasunderlag generelt krever tekniske skreddersydde rutenettoverflater og fangststrategier. Til slutt, selv om det er mye forskning på utviklingen av raskt stupte enheter14,15,16, krever disse apparater som generelt ikke er allment tilgjengelige.
Selv om standard TEM-rutenett for biologisk kryo-EM allerede har en perforert amorf karbonfolie17, er det en rekke protokoller tilgjengelig for generering av ekstra støttefilmer og deres overføring til TEM-rutenett. Bruken av disse filmene er en etablert metode for prøvestabilisering18. Amorfe karbonstøtter genereres ved fordampning og avsetning på krystallinske glimmerplater19, hvorfra lagene kan flyte på gitter, med nytten av flytestøtter som nyttige verktøy etablert i tidligere rapporter20. Grafenoksidflak, vanligvis tilberedt ved hjelp av en modifisert versjon av Hummers-metoden21, har blitt brukt som en foretrukket støttestruktur til amorf karbon for deres reduserte bakgrunnssignal, samt evnen til å immobilisere og stabilisere makromolekyler22. Mer nylig har det vært en gjenoppblomstrende interesse for bruk av grafen som TEM-støttefilm på grunn av sin mekaniske stabilitet, høy ledningsevne, ekstremt lavt bidrag til bakgrunnsstøy23, samt fremveksten av reproduserbare metoder for å generere makroskopisk store områder av monolayer graphene24 og overføre den til TEM-rutenett25 . Sammenlignet med amorf karbon, som gjennomgår stråleinduserte bevegelser på samme måte som, eller verre, enn is som mangler støttefilm11,12,17, viste grafen en betydelig reduksjon i stråleindusert bevegelse av kryo-EM-bilder12.
Men mens hydrofilisert grafen beskyttet fettsyresyntase fra luft-vann interfacial denaturering, bemerket forfatterne av denne studien at grafen ble forurenset under prøvepreparering, sannsynligvis på grunn av en kombinasjon av atmosfærisk hydrokarbonforurensning og fra reagenset som brukes til å hydrofilisere gitteret10. Faktisk, til tross for mange av de overlegne egenskapene til grafen, er den utbredte bruken fortsatt hindret av avledningen som kreves for å redusere hydrofobiskheten12, som til slutt er kjemisk vanskelig og krever spesialutstyr. Dette dokumentet rapporterer protokoller for fremstilling av amorf karbon, grafenoksid og grafenprøvestøtter ved hjelp av en tredimensjonalt (3D) trykt prøveflytasjonsblokk27 for direkte overføring av støttefilmer fra underlagene de ble generert til TEM-rutenett (figur 1). En viktig fordel ved å bruke en slik enhet er fuktet overføring av filmer, minimering av hydrofob forurensning av støttene og dermed behovet for videre behandling, og redusere antall potensielt skadelige manuelle håndteringstrinn. Disse tilnærmingene er billige å implementere og derfor allment tilgjengelige og anvendelige for cryo-EM-studier der utvalgsstøtter er nødvendige.
Dette dokumentet presenterer protokoller for håndtering av både amorfe karbon- og grafenfilmer for kryo-EM prøvepreparering ved hjelp av en prøveflytende blokk27. En STL-fil for støtteblokken er fritt tilgjengelig fra det offentlige Thingiverse-repositoriet [www.thingiverse.com/thing:3440684], og kan skrives ut med en hvilken som helst passende stereolitografiskriver fra en passende harpiks. Bruken av karbonfilmer som dekker et TEM-rutenett innebærer vanligvis karbonflyten på prøve28. Denne tilnærmingen til å forberede negative flekkgitter minimerer lufteksponering under støttehåndtering, og reduserer dermed forurensning og protein denaturering. Utarbeidelsen av gitter ved hjelp av flytende karbon i små brønner er fordelaktig for å flyte et større overflateareal, det vil si i et vannbad eller Petri-tallerken, i så fall forekommer mekanisk skjæring av karbonet mye lettere.
Brukerkontokontroll kan være vanskelig å kjøpe på grunn av gjeldende helse- og sikkerhetsforskrifter på tidspunktet for publisering. Mange andre ofte brukte, ikke-radioaktive, negative fargingsreagenser er tilgjengelige, og protokoller for deres forberedelse har blitt beskrevet tidligere29. Selv om alternative flekker ikke har blitt brukt med denne støtteflytblokken, er det ikke sannsynlig at det ville være noen forskjeller i disse protokollene i tillegg til optimalisering av inkubasjonstid med prøve (trinn 3.5), som allerede er iboende prøveavhengig. Hovedtrinnet i denne GrOx-støtteforberedelsesprotokollen er trinn 4.4, uthevet av notatet for å forhindre at vann- og GrOx-løsningen kommer i kontakt rundt rutenettkanten. Upassende blanding av vann- og GrOx-løsningene forhindrer enveis sedimentering av GrOx-flakene ved kapillær virkning. Å ha GrOx-flak på begge sider av karbonfolie resulterer i tykke lag, og dermed negerer fordelene ved å bruke GrOx som en nesten enkeltlagsstøtte, samt fange vann mellom flakene, noe som forårsaker forurensning av brukbare områder med ekstra lag med is. Graphene oksid støtte forberedelse er relativt enkelt å oppnå ved hjelp av dråper av løsning på fleksibel polyolefinfilm. Men når det utføres på den måten, er det lettere å forurense kobbersiden av rutenettet ved å feilbehandle feil; Bruken av flyteblokken reduserer sannsynligheten for denne eventualiteten.
Til slutt presenterer dette dokumentet en protokoll for å forberede grafendekkede rutenett som unngår noen form for grafenforbehandling for å gjøre den hydrofil, og dermed redusere kostnadene og øke tilgjengeligheten. Opprettholde en fuktet film gjennom prøvepreparering og påføring av prøve in situ i blokken like før frysing er tilstrekkelig til å tillate generering av egnede islag for kryo-EM med en homogen prøvefordeling. Totalt sett minimerer protokollene som presenteres her prøvekontakt med luftvannsgrensesnittet, og reduserer derfor prøveforringelse og støtteforurensning. For de tre støttefilmene som brukes i disse tilnærmingene, kan homogene utvalgsfordelinger oppnås på tvers av rutenettene sammen med avbildning av intakte, godt bevarte enkeltpartikler.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke alle medlemmene av Seksjon for strukturell og syntetisk biologi ved Imperial College London som har bidratt til å teste disse teknikkene, samt Harry Barnett ved Imperial College Advanced Hackspace, og Paul Simpson ved Centre for Structural Biology. CHSA støttes av et Sir Henry Dale Fellowship finansiert av Wellcome Trust og Royal Society (206212/Z/17/Z).
Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |