Summary
Prøvepreparering for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er en betydelig flaskehals i strukturbestemmelsesarbeidsflyten til denne metoden. Her tilbyr vi detaljerte metoder for å bruke en brukervennlig, tredimensjonalt trykt blokk for utarbeidelse av støttefilmer for å stabilisere prøver for em-studier av overføring.
Abstract
Strukturbestemmelse ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har vokst raskt det siste tiåret; Prøvepreparering forblir imidlertid en betydelig flaskehals. Makromolekylære prøver er ideelt avbildet direkte fra tilfeldige orienteringer i et tynt lag med glassaktig is. Imidlertid er mange prøver ildfaste mot dette, og protein denaturering ved luftvannsgrensesnittet er et vanlig problem. For å overvinne slike problemer, støtte filmer - inkludert amorf karbon, grafen og grafenoksid - kan brukes på rutenettet for å gi en overflate som prøver kan fylle, noe som reduserer sannsynligheten for at partikler opplever de skadelige effektene av luftvanngrensesnittet. Anvendelsen av disse delikate støttene til gitter krever imidlertid forsiktig håndtering for å forhindre brudd, luftbåren forurensning eller omfattende vaske- og rengjøringstrinn. En fersk rapport beskriver utviklingen av en brukervennlig flyteblokk som letter fuktet overføring av støttefilmer direkte til prøven. Bruk av blokken minimerer antall manuelle håndteringstrinn som kreves, bevarer den fysiske integriteten til støttefilmen, og tiden som hydrofob forurensning kan påløpe, og sikrer at en tynn isfilm fortsatt kan genereres. Dette dokumentet inneholder trinnvise protokoller for fremstilling av karbon-, grafen- og grafenoksidstøtter for EM-studier.
Introduction
I løpet av det siste tiåret har gjennombrudd, hovedsakelig innen detektorteknologi, men også på andre tekniske felt, lagt til rette for en rekke betydelige økninger i oppløsningen der biologisk relevante systemer kan avbildes ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM)1,2. Til tross for at cryo-EM allerede tillater oppløsning av høyoppløselige strukturer fra så lite som 50 μg protein gjennom enpartikkelanalyse (SPA), forblir kryo-EM-prøve og nettforberedelse store flaskehalser3,4,5. SPA-prøver består av makromolekyler fordelt omtrent tilfeldig innenfor et lag med glassaktig is. Isen må være så tynn som mulig for å maksimere kontrastforskjellen mellom partiklene og løsningsmidlet. Biologiske makromolekyler er mer stabile (dvs. mindre sannsynlig å miste sin opprinnelige struktur) i tykkere is, fordi de forblir bedre løst. Videre er partikler ofte funnet å være mye bedre fordelt over synsfeltet i is mye tykkere enn partikkelstørrelsen6 og kan ofte ikke bli funnet i hull i karbonfilmene i det hele tatt.
I tillegg reduserer tykkere lag med is sannsynligheten for at molekyler er nær luftvannsgrensesnittet på grunn av det høye forholdet mellom overflate og volum, og det er anslått at bruk av standard frysingsmetoder for kryo-EM-studier resulterer i adsorpsjon av ~ 90% av partiklene til luftvannsgrensesnittet7. Tykkere is resulterer i uønsket høy bakgrunn på grunn av økte spredningshendelser i løsningsmidlet og samtidig demping av signalet6,7. Det er derfor nødvendig å oppnå et så tynt lag med glassaktig is som mulig; Ideelt sett ville laget bare være litt tykkere enn partikkelen. Utfordringen for forskeren, som må overvinnes for hver enkelt prøve som brukes på et rutenett, er å forberede prøver tynne nok til høykontrastavbildning samtidig som partiklenes strukturelle integritet opprettholdes i prøven. Protein adsorpsjon til luft-vann-grensesnittet er ledsaget av flere, vanligvis skadelige, effekter.
For det første induserer binding av proteiner til dette hydrofobe grensesnittet ofte denaturering av proteinet, som fortsetter raskt og vanligvis er irreversibel8,9. En studie utført ved hjelp av gjærfettsyresyntase viste at opptil 90% av adsorberte partikler denatureres10. For det andre viste bevis fra en studie som sammenlignet orienteringsfordelingen av 80S ribosomedatasett samlet inn enten på amorf karbon11 eller uten støtte12, at luftvanngrensesnittet kan forårsake alvorlig preferanseorientering som kompromitterer 3D-rekonstruksjon av volumet13. Metoder for å redusere partikkelinteraksjon med luftvannsgrensesnittet inkluderer tilskudd av frysebufferen med overflateaktive stoffer (for eksempel vaskemidler), bruk av støttefilmer, affinitetsfangst eller stillas av substrater og akselererte stupetider. Bruken av overflateaktive stoffer er forbundet med sine egne problemer, da noen proteinprøver kan oppføre seg ikke-ideelt i deres nærvær, mens affinitetsfangst og stillasunderlag generelt krever tekniske skreddersydde rutenettoverflater og fangststrategier. Til slutt, selv om det er mye forskning på utviklingen av raskt stupte enheter14,15,16, krever disse apparater som generelt ikke er allment tilgjengelige.
Selv om standard TEM-rutenett for biologisk kryo-EM allerede har en perforert amorf karbonfolie17, er det en rekke protokoller tilgjengelig for generering av ekstra støttefilmer og deres overføring til TEM-rutenett. Bruken av disse filmene er en etablert metode for prøvestabilisering18. Amorfe karbonstøtter genereres ved fordampning og avsetning på krystallinske glimmerplater19, hvorfra lagene kan flyte på gitter, med nytten av flytestøtter som nyttige verktøy etablert i tidligere rapporter20. Grafenoksidflak, vanligvis tilberedt ved hjelp av en modifisert versjon av Hummers-metoden21, har blitt brukt som en foretrukket støttestruktur til amorf karbon for deres reduserte bakgrunnssignal, samt evnen til å immobilisere og stabilisere makromolekyler22. Mer nylig har det vært en gjenoppblomstrende interesse for bruk av grafen som TEM-støttefilm på grunn av sin mekaniske stabilitet, høy ledningsevne, ekstremt lavt bidrag til bakgrunnsstøy23, samt fremveksten av reproduserbare metoder for å generere makroskopisk store områder av monolayer graphene24 og overføre den til TEM-rutenett25 . Sammenlignet med amorf karbon, som gjennomgår stråleinduserte bevegelser på samme måte som, eller verre, enn is som mangler støttefilm11,12,17, viste grafen en betydelig reduksjon i stråleindusert bevegelse av kryo-EM-bilder12.
Men mens hydrofilisert grafen beskyttet fettsyresyntase fra luft-vann interfacial denaturering, bemerket forfatterne av denne studien at grafen ble forurenset under prøvepreparering, sannsynligvis på grunn av en kombinasjon av atmosfærisk hydrokarbonforurensning og fra reagenset som brukes til å hydrofilisere gitteret10. Faktisk, til tross for mange av de overlegne egenskapene til grafen, er den utbredte bruken fortsatt hindret av avledningen som kreves for å redusere hydrofobiskheten12, som til slutt er kjemisk vanskelig og krever spesialutstyr. Dette dokumentet rapporterer protokoller for fremstilling av amorf karbon, grafenoksid og grafenprøvestøtter ved hjelp av en tredimensjonalt (3D) trykt prøveflytasjonsblokk27 for direkte overføring av støttefilmer fra underlagene de ble generert til TEM-rutenett (figur 1). En viktig fordel ved å bruke en slik enhet er fuktet overføring av filmer, minimering av hydrofob forurensning av støttene og dermed behovet for videre behandling, og redusere antall potensielt skadelige manuelle håndteringstrinn. Disse tilnærmingene er billige å implementere og derfor allment tilgjengelige og anvendelige for cryo-EM-studier der utvalgsstøtter er nødvendige.
Protocol
1. Generell forberedelse av TEM-rutenett forhåndsstøtteoverføring
- Bruk et par rene, fine pinsett, løft og senk TEM-gitter sekvensielt i dobbeltdestillert vann (ddH2O) eller ultrarent vann i 10-15 s, etterfulgt av etylacetat, i 10-15 s.
MERK: Her ble det brukt negative, skrått spiss pinsett. - Plasser pinsettene, med gitteret fortsatt i grep, til den ene siden for å lufttørke i ~ 5 min.
- Plasmarens gitteret for å fjerne overflaten på eventuelle forurensninger som er påløpt gjennom luft- eller vasketrinnene.
MERK: Her ble plasmarengjøring gjort for 10-15 s i luften med en radiofrekvenseffekt på 25 W.
2. Generell utarbeidelse av reagensløsninger
- Uranylacetat (UAc)-løsning (2 % m/v)
- Pakk et 50 ml rør i folie, fyll med 50 ml ultrapure vann, og tilsett 1 g UAc pulver.
MERK: UAc er lysfølsom og utfelles over tid når den blir eksponert. Siden UAc er radioaktiv og giftig, opprettholde et høyt nivå av renslighet. Med den alvorligste faren som oppstår ved innånding eller inntak, bør det utvises ekstra forsiktighet for å forhindre mulighet for innånding av fine partikler. Hansker må alltid brukes ved håndtering eller veiing av uransalter. Masker og vernebriller anbefales på det sterkeste. Uransalter må avhendes i henhold til de juridiske kravene som stilles til radioaktive farer i staten. - La oppløsningen røre i 1 time for å tillate at all UAc oppløses. Oppbevars ved 4 °C.
- Før bruk, filtrer 1 ml av flekkoppløsningen i et lite hetteglass med 0,22 μm filter for å fjerne eventuelle gjenværende acetatkrystaller.
- Pakk et 50 ml rør i folie, fyll med 50 ml ultrapure vann, og tilsett 1 g UAc pulver.
- Grafenoksid (GrOx) suspensjon
- Pipette 2,5 μL GrOx i et 1,5 ml rør (1 % endelig konsentrasjon). Pipette 2,5 μL 10 % (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) vaskemiddel i GrOx, og bland forsiktig (0,1 % (w/v) sluttkonsentrasjon).
- Tilsett 245 μL ultrarent vann til GrOx-DDM-blandingen, og virvel kraftig i 5 min. Bruk GrOx-suspensjon innen 1 t forberedelse, virvel kraftig i minst 1 min før umiddelbar bruk.
- Jern(III) klorid (FeCl3) oppløsning (10% m/v)
- Vei forsiktig 5 g FeCl3 i en veiebåt. Overfør til en 100 ml målesylinder som inneholder 35 ml ddH2O og en magnetisk rørestang.
- Plasser på en magnetisk røreplate, og oppløs FeCl3, og legg ddH2O til et sluttvolum på 50 ml. Filtrer FeCl3-oppløsningen gjennom et 0,8 μm sprøytefilter i en ren flaske for oppbevaring.
MERK: FeCl3 er etsende og irriterende; vask hender og andre utsatte områder med mild såpe og vann før du spiser, drikker eller røyker og når du forlater arbeidet. Gi god ventilasjon i prosessområdet for å forhindre dannelse av damp. Ikke pust inn tåke, damper, spray. Hansker må alltid brukes ved håndtering eller veiing av saltet. Masker og vernebriller anbefales på det sterkeste når de er i bruk.
3. Bufferutveksling for karbonstøttefilmer på glimmer for å forberede negativt fargede prøver ved hjelp av støtteflåteblokken
- Vask og plasma-rene TEM-gitter.
MERK: Her ble 300 mesh holey-carbon kobbergitter brukt som beskrevet ovenfor i avsnitt 1. - Pipette 10-12 μL prøve inn i bufferutvekslingsbrønnen (med de små kanalene) i flyteblokken og 10-12 μL 2% UAc-løsning (se pkt. 2.1) for negativ farging i den tilstøtende ikke-bufferutvekslingsbrønnen.
MERK: Brønnen har et volum på 10 μL; Juster imidlertid prøvevolumet slik at en konveks menisk dannes på overflaten av væsken for å tillate riktig filmflyt. Et lavt prøvevolum kan føre til filmbrudd. - Klipp forsiktig to små biter av glimmer med predeposited karbonfilm på toppen. Pass på at glimmerfragmentene er brede nok til å passe inn i brønnen (3,4 mm bredde) og lengre enn brønnlengden (3,45 mm), slik at fragmentet vil sitte på brønnen mens karbon flyter, og det er nok plass til å håndtere fragmentet med pinsettene.
MERK: For å håndtere karbonet, bruk flate, negativ-action langspiss pinsett. Når du kutter glimmerfragmentene, kutt ved hjelp av enkle bevegelser for å opprettholde integriteten til karbonfilmen. - Senk glimmeren ned i brønnen med en omtrentlig vinkel på 45° til glimmeren sitter på brønnens rampe og et lag karbon observeres på overflaten av væskeprøven.
- Etter den første inkubasjonen på prøve (vanligvis 20 s til 20 min avhengig av prøvetilslutningen; optimaliser denne perioden basert på eksperimentelle behov), trekk glimmerarket veldig sakte for å gjenopprette karbonfilmen og minimere gjenværende viskøs prøveretensjon.
- Fjern forsiktig glimmer glimmeren ved å tappe den nedre overflaten (ikke-karbonsiden) med filterpapir for å fjerne overflødig væske, og bytt deretter karbonlageret prøven i negativ flekk ved å bruke den motsatte brønnen (dvs. senk glimmen som i trinn 3.4) som inneholder 2% UAc-løsningen.
MERK: Et karbonlag bør observeres flytende på toppen av flekkløsningen på dette tidspunktet. - Gjenopprett det flytende karbonlaget med den hullete karbondekkede siden av et vasket og plasmarengjort EM-rutenett. La gitteret lufttørke til det er bildebehandling på en TEM. Ideelt sett, dekk gitteret under tørkeprosessen for å unngå luftbåren forurensning.
4. Påføring av støtteflåteblokken for å forberede grafenoksidbelagte TEM-rutenett
- Vask og plasmarens TEM-gitter med 300 mesh holey-carbon kobbergitter som beskrevet ovenfor (avsnitt 1).
- Pipette 10-12 μL GrOx-suspensjon (se pkt. 2.2) i de 4 ikke-bufferutvekslingsbrønnene langs flyteblokken. Pipette 10-12 μL ddH2O eller ultrarent vann inn i de resterende 4 bufferutvekslingsbrønnene i blokken.
MERK: Dette volumet av vann bør være tilstrekkelig til å danne en liten konveks menisk som stiger over blokkens høyde. - Slipp 4 gitter forsiktig på GrOx-fjæringen av hver brønn i 1 min, og sørg for at den hullete karbondekkede siden kommer i kontakt med løsningen. Etter 1 min, gjenopprett hvert rutenett forsiktig ved å skyve pinsettene inn i pinsettsporet til hver ikke-bufferutvekslingsbrønn.
- Svært forsiktig og kort berøre kobber, ikke-karbondekket side av hvert rutenett til ddH2O i den tilstøtende brønnen. Hold deretter forsiktig og forsiktig rutenettet, vanndråpesiden ned, mot et stykke filterpapir.
MERK: Blotting av vannet vil trekke GrOx-fjæringen gjennom gitteret ved kapillær virkning. Det er viktig å unngå å senke nettet i ddH2O, så kontakten bør være veldig kort. Når gitteret løftes, skal en vanndråpe holde til undersiden av rutenettet. Pass på at du ikke flytter rutenettet på filterpapiret, da dette kan forstyrre bosettingen av GrOx-flakene. - La gitteret i pinsettene lufttørke til de er tilberedning med prøve. Ideelt sett, dekk gitteret under tørkeprosessen for å unngå luftbåren forurensning.
5. Anvendelse av støtteflåteblokken for fremstilling av prøver på monolayer-grafenfilmer
- Vask TEM-rutenettene som beskrevet ovenfor (avsnitt 1), men utelat plasmarengjøring.
MERK: Her ble det brukt 300 mesh holey-carbon gullgitter, men andre ikke-kobbergitter eller kobberlegeringsgitter er også praktiske. - For å deponere gitter med grafen, overføre direkte fra grafen dyrket på kobber (Cu-grafen) substrater til kryo-EM-rutenett, som beskrevet tidligere25.
- Plasser fire vaskede gitter på toppen av et Cu-grafenark (10 mm × 10 mm) avsatt på en glasssklie, og dekk hvert rutenett med en dråpe isopropanol (5-10 μL) for å tillate intim kontakt mellom monolayergrafen og rutenettet.
MERK: Sørg for å plassere den hullete karbondekkede siden av gitteret i kontakt med grafenplaten. - Når isopropanol er helt fordampet (vanligvis 2 t), flytt Cu-grafenplaten med gitter på 10% (w / v) FeCl3-løsning (se avsnitt 2.3) i en glass Petri-tallerken, og la den etse ved romtemperatur over natten. Dekk parabolen for å unngå luftbåren forurensning.
MERK: Etter at etsingen er fullført, vil bare grafenmonolayeren forbli flytende på FeCl3-løsningen - dette skal være synlig for øyet med passende belysning. - Bruk en løkke med diameter større enn TEM-rutenettstørrelsen for å fiske gitteret som flyter på grafenmonolayeren, og overfør forsiktig til en glass Petri-tallerken som inneholder ddH2O å vaske.
MERK: Vær ekstremt forsiktig når du fisker gitteret for å unngå å treffe veggene på Petri-parabolen, noe som kan føre til grafenfilmbrudd eller bøyning. - Vask to ganger til i vann ved å fiske gitter og overføre til en ren Petri-tallerken som inneholder ddH2O for å fjerne alle gjenværende FeCl3. Til slutt overfører du gitter til en Petri-tallerken som inneholder prøvebuffer til prøvepreparering og frysing.
MERK: Den grafendekkede siden av gitteret må holdes fuktet til enhver tid for å unngå eksponering for luftbårne forurensninger.
- Plasser fire vaskede gitter på toppen av et Cu-grafenark (10 mm × 10 mm) avsatt på en glasssklie, og dekk hvert rutenett med en dråpe isopropanol (5-10 μL) for å tillate intim kontakt mellom monolayergrafen og rutenettet.
- Pipette prøven (10-12 μL) inn i en ikke-bufferutvekslingsbrønn for flyteblokken. Når prøven er klar i blokken, velger du et grafenbelagt rutenett fra bufferløsningen ved hjelp av et par rene pinsett, og plasserer på overflaten av den prøveholdige brønnen.
- Etter en passende inkubasjonsperiode (1-5 min avhengig av prøven; optimaliser i henhold til eksperimentelle behov), velg rutenettet med et par rene frysende pinsett, og fortsett med blotting og vitrifisering.
Representative Results
TEM-gitter tilberedt med amorfe karbonstøtter dekkes vanligvis over hele rutenettoverflaten. Selv om brudd på karbonfilmen forekommer i noen tilfeller sammen med noe ruffling (figur 2A), er et stort antall rutenettstorg uberørte og dermed mye anvendelige for negative fargingsformål. Den viktigste faktoren som påvirker støttens integritet er karbontykkelsen, som bestemmes under karbonfordampning. På samme måte, med denne GrOx-protokollen, oppnås god dekning rutinemessig over hele rutenettet (figur 2B). En enkelt påføring av GrOx-suspensjon i 1 min er tilstrekkelig for å sikre få områder med flere lag, som er enkle å se på grunn av flakkanter. GrOx-gitter kan tilberedes raskt fra råvarer og er svært beskyttende for prøven. Imidlertid er flakkanter, ufullstendig dekning og ruffling oftere synlige med GrOx-rutenett enn for de andre teknikkene på grunn av GrOx-flakenes natur.
Selv om grafens integritet støtter film, som amorf karbon, avhenger av avsetningsprosessen, viser områder som er godt dekket det karakteristiske diffraksjonsmønsteret til enkeltlags grafen. Viktigst, ved å holde grafenstøttefilmer fuktet, kan prøver gjenopprettes fra flyteblokken etter en inkubasjonsperiode og data samlet inn på en måte som kan brukes til enkeltpartikkelanalyse. Denne metoden krever ingen annen behandling av grafen for fukting, og fjerner dermed kravet om dyrt utstyr for å gjengi grafenhydrafil, og det er best å forberede støttefilmer kort tid før prøvepreparering og nettfrysing (figur 2C).
Figur 1: Eksempel på flyteblokkutforming og -anvendelse under støttefilmforberedelse. (A) Skjematisk for topp-, brønn- og sidevisninger av flyteblokken, inkludert målinger av formen, dybden og hellingen. Sporet for pinsettspisser å hvile, samt kanaler for å sette inn nåler, er indikert. (B) Amorfe karbonlag kan enkelt flyte på overflaten av bufferen som finnes i brønnene i flyteblokken ved hjelp av rampen, det vil si under utarbeidelsen av negativt fargede TEM-rutenett. (C) Bredden på brønnene er egnet til å romme ett TEM-nett, mens pinsettsporene reduserer behovet for å frigjøre og plukke opp gitter unødvendig under forberedelsestrinn, men tilbyr en definert vei for å gjenvinne gitter uten risiko for bøyning hvis gitter slippes ut. Bilder i B er endret fra 27. Forkortelse: TEM = transmisjonselektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Typiske eksempler på prøvestøttefilmer utarbeidet ved hjelp av flyteblokken. Rutenett firkantede (venstre) og bildevisninger (til høyre) vises for (A) amorfe karbon-, (B) grafenoksid- og (C) grafenstøttefilmer som er laget ved hjelp av flyteblokken. Den amorfe karbonstøtten ble brukt til fremstilling av 70S ribosomer for negativ farging, mens grafenoksid og grafenstøtter ble brukt til fremstilling av 70S ribosomer for kryo-EM. Bilder i A og C er endret fra 27. Skalalinje for en rutenettsrute = 10 μm; skalastolper for B- og C-rutenett firkanter = 5 μm; skalalinjer for A-C-bildevisninger = 50 nm. Forkortelse: cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Dette dokumentet presenterer protokoller for håndtering av både amorfe karbon- og grafenfilmer for kryo-EM prøvepreparering ved hjelp av en prøveflytende blokk27. En STL-fil for støtteblokken er fritt tilgjengelig fra det offentlige Thingiverse-repositoriet [www.thingiverse.com/thing:3440684], og kan skrives ut med en hvilken som helst passende stereolitografiskriver fra en passende harpiks. Bruken av karbonfilmer som dekker et TEM-rutenett innebærer vanligvis karbonflyten på prøve28. Denne tilnærmingen til å forberede negative flekkgitter minimerer lufteksponering under støttehåndtering, og reduserer dermed forurensning og protein denaturering. Utarbeidelsen av gitter ved hjelp av flytende karbon i små brønner er fordelaktig for å flyte et større overflateareal, det vil si i et vannbad eller Petri-tallerken, i så fall forekommer mekanisk skjæring av karbonet mye lettere.
Brukerkontokontroll kan være vanskelig å kjøpe på grunn av gjeldende helse- og sikkerhetsforskrifter på tidspunktet for publisering. Mange andre ofte brukte, ikke-radioaktive, negative fargingsreagenser er tilgjengelige, og protokoller for deres forberedelse har blitt beskrevet tidligere29. Selv om alternative flekker ikke har blitt brukt med denne støtteflytblokken, er det ikke sannsynlig at det ville være noen forskjeller i disse protokollene i tillegg til optimalisering av inkubasjonstid med prøve (trinn 3.5), som allerede er iboende prøveavhengig. Hovedtrinnet i denne GrOx-støtteforberedelsesprotokollen er trinn 4.4, uthevet av notatet for å forhindre at vann- og GrOx-løsningen kommer i kontakt rundt rutenettkanten. Upassende blanding av vann- og GrOx-løsningene forhindrer enveis sedimentering av GrOx-flakene ved kapillær virkning. Å ha GrOx-flak på begge sider av karbonfolie resulterer i tykke lag, og dermed negerer fordelene ved å bruke GrOx som en nesten enkeltlagsstøtte, samt fange vann mellom flakene, noe som forårsaker forurensning av brukbare områder med ekstra lag med is. Graphene oksid støtte forberedelse er relativt enkelt å oppnå ved hjelp av dråper av løsning på fleksibel polyolefinfilm. Men når det utføres på den måten, er det lettere å forurense kobbersiden av rutenettet ved å feilbehandle feil; Bruken av flyteblokken reduserer sannsynligheten for denne eventualiteten.
Til slutt presenterer dette dokumentet en protokoll for å forberede grafendekkede rutenett som unngår noen form for grafenforbehandling for å gjøre den hydrofil, og dermed redusere kostnadene og øke tilgjengeligheten. Opprettholde en fuktet film gjennom prøvepreparering og påføring av prøve in situ i blokken like før frysing er tilstrekkelig til å tillate generering av egnede islag for kryo-EM med en homogen prøvefordeling. Totalt sett minimerer protokollene som presenteres her prøvekontakt med luftvannsgrensesnittet, og reduserer derfor prøveforringelse og støtteforurensning. For de tre støttefilmene som brukes i disse tilnærmingene, kan homogene utvalgsfordelinger oppnås på tvers av rutenettene sammen med avbildning av intakte, godt bevarte enkeltpartikler.
Disclosures
Forfatterne er ikke klar over noen interessekonflikter med hensyn til dette arbeidet.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke alle medlemmene av Seksjon for strukturell og syntetisk biologi ved Imperial College London som har bidratt til å teste disse teknikkene, samt Harry Barnett ved Imperial College Advanced Hackspace, og Paul Simpson ved Centre for Structural Biology. CHSA støttes av et Sir Henry Dale Fellowship finansiert av Wellcome Trust og Royal Society (206212/Z/17/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
| Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
| Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
| Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
| Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
| Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
| Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
| n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
| Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
| Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
| Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
| Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
| Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
| Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |
References
- Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461 (2013).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
- Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183 (2003).
- Hummers, W. S., Offeman, R. E.
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
- Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
- Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
