Provberedning för kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) är en betydande flaskhals i arbetsflödet för strukturbestämning av denna metod. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för att använda ett lätt att använda, tredimensionellt tryckt block för beredning av stödfilmer för att stabilisera prover för överförings-EM-studier.
Strukturbestämning genom kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har snabbt vuxit under det senaste decenniet; Provberedningen är dock fortfarande en betydande flaskhals. Makromolekylära prover avbildas idealiskt direkt från slumpmässiga orienteringar i ett tunt lager av glasaktig is. Många prover är dock eldfasta till detta, och protein denaturation vid luft-vatten gränssnittet är ett vanligt problem. För att övervinna sådana problem kan stödfilmer, inklusive amorft kol, grafen och grafenoxid – appliceras på nätet för att tillhandahålla en yta som prover kan fylla, vilket minskar sannolikheten för att partiklar upplever de skadliga effekterna av luft-vattengränssnittet. Tillämpningen av dessa känsliga stöd på galler kräver dock noggrann hantering för att förhindra brott, luftburen förorening eller omfattande tvätt- och rengöringssteg. En färsk rapport beskriver utvecklingen av ett lättåtkomligt flytblock som underlättar våt överföring av stödfilmer direkt till urvalet. Användningen av blocket minimerar antalet manuella hanteringssteg som krävs, bevarar stödfilmens fysiska integritet och den tid under vilken hydrofobisk förorening kan uppstå, vilket säkerställer att en tunn isfilm fortfarande kan genereras. Detta dokument ger steg-för-steg protokoll för beredning av kol, grafen och grafenoxid stöd för EM-studier.
Under det senaste decenniet har genombrott, främst inom detektorteknik, men även inom andra tekniska områden, underlättat en rad betydande ökningar av den upplösning vid vilken biologiskt relevanta system kan avbildas genom transmissionselektronmikroskopi (TEM)1,2. Trots att cryo-EM redan tillåter upplösning av högupplösta strukturer från så lite som 50 μg protein genom enpartikelanalys (SPA), är kryo-EM-prov och nätberedning fortfarande stora flaskhalsar3,4,5. SPA-prover består av makromolekyler som distribueras ungefär slumpmässigt inom ett lager av glasaktig is. Isen måste vara så tunn som möjligt för att maximera kontrastskillnaden mellan partiklarna och lösningsmedlet. Biologiska makromolekyler är stabilare (dvs. mindre benägna att förlora sin inhemska struktur) i tjockare is, eftersom de förblir bättre solvated. Dessutom visar det sig ofta att partiklar är mycket bättre fördelade över synfältet i is som är mycket tjockare än partikelstorleken6 och ofta kanske inte finns i hål i kolfilmerna alls.
Dessutom minskar tjockare lager av is sannolikheten för att molekyler är nära luft-vattengränssnittet på grund av det höga förhållandet mellan yta och volym, och det har uppskattats att användning av vanliga dykfrysningsmetoder för kryo-EM-studier resulterar i adsorption av ~ 90% av partiklarna till luft-vattengränssnittet7. Tjockare is resulterar i oönskad hög bakgrund på grund av ökade spridningshändelser i lösningsmedlet och samtidig dämpning av signalen6,7. Det är därför nödvändigt att uppnå ett så tunt lager glasaktig is som möjligt. helst skulle skiktet bara vara något tjockare än partikeln. Utmaningen för forskaren, som måste övervinnas för varje olika prov som appliceras på ett galler, är att förbereda exemplar som är tillräckligt tunna för högkontrastavbildning samtidigt som partiklarnas strukturella integritet i provet bibehålls. Proteinadsorption till luft-vattengränssnittet åtföljs av flera, vanligtvis skadliga, effekter.
För det första inducerar bindning av proteiner till detta hydrofoba gränssnitt ofta denaturering av proteinet, som fortsätter snabbt och är vanligtvis irreversibelt8,9. En studie utförd med jästfettsyrasyntas visade att upp till 90% av adsorberade partiklar är denaturerade10. För det andra visade bevis från en studie som jämförde orienteringsfördelningen av 80S ribosomdatamängder som samlats in antingen på amorft kol11 eller utan stöd12 att luft-vattengränssnittet kan orsaka allvarlig förmånsorientering som äventyrar 3D-rekonstruktionen av volymen13. Metoder för att minska partikelinteraktion med luft-vattengränssnittet inkluderar tillskott av frysbufferten med tensider (såsom tvättmedel), användning av stödfilmer, affinitetsfångst eller byggnadsställningar av substrat och accelererade plungtider. Användningen av tensider är förknippad med sina egna problem, eftersom vissa proteinprover kan bete sig icke-idealiskt i sin närvaro, medan affinitetsfångande och byggnadsställningar i allmänhet kräver tekniska skräddarsydda nätytor och fångststrategier. Slutligen, även om det finns mycket forskning om utvecklingen av snabbslungande enheter14,15,16, kräver dessa apparater som i allmänhet inte är allmänt tillgängliga.
Även om det vanliga TEM-nätet för biologisk kryo-EM redan har en perforerad amorf kolfolie17, finns det ett antal protokoll tillgängliga för generering av ytterligare stödfilmer och deras överföring till TEM-nät. Användningen av dessa filmer är en sedan länge etablerad metod för provstabilisering18. Amorfa kolstöd genereras genom avdunstning och deponering på kristallina glimmerplåtar19, från vilka lagren kan flyta på galler, med nyttan av flytstöd som användbara verktyg som fastställts i tidigare rapporter20. Grafenoxidflingor, vanligtvis beredda med hjälp av en modifierad version av Hummers-metoden21, har använts som en föredragen stödstruktur framför amorft kol för deras minskade bakgrundssignal samt förmågan att immobilisera och stabilisera makromolekyler22. På senare tid har intresset för användning av grafen ökat som TEM-stödfilm på grund av dess mekaniska stabilitet, höga konduktivitet, extremt låga bidrag till bakgrundsljud23, liksom framväxten av reproducerbara metoder för att generera makroskopiskt stora områden av monoskiktsgrafen24 och överföra den till TEM-nät25 . Jämfört med amorft kol, som genomgår strålinducerade rörelser på samma sätt som, eller värre, än is som saknar en stödfilm11,12,17, visade grafen en signifikant minskning av stråleinducerad rörelse av kryo-EM-bilder12.
Men medan hydrofiliserad grafen skyddade fettsyrasyntas från luft-vatten interfacial denaturation, författarna till denna studie noterade att grafen blev förorenade under provberedning, sannolikt på grund av en kombination av atmosfärisk kolväte förorening och från reagens som används för att hydrofilisera galler10. Trots många av grafenens överlägsna egenskaper hindras dess utbredda användning fortfarande av den härledning som krävs för att minska dess hydrofobi12, vilket i slutändan är kemiskt svårt och kräver specialistutrustning. Detta dokument rapporterar protokoll för beredning av amorft kol, grafenoxid och grafenprov stöder användning av ett tredimensionellt (3D) tryckt provflöten27 för att direkt överföra stödfilmer från de substrat på vilka de genererades till TEM-nät (figur 1). En viktig fördel med att använda en sådan anordning är den fuktade överföringen av filmer, minimering av hydrofobisk förorening av stöden och följaktligen behovet av ytterligare behandling och minskning av antalet potentiellt skadliga manuella hanteringssteg. Dessa metoder är billiga att genomföra och därför allmänt tillgängliga och tillämpliga för kryo-EM-studier där provstöd är nödvändiga.
Detta dokument presenterar protokoll för hantering av både amorfa kol- och grafenfilmer för kryo-EM-provberedning med hjälp av ett provflötenblock27. En STL-fil för supportblocket är fritt tillgänglig från det offentliga Thingiverse-arkivet [www.thingiverse.com/thing:3440684], och kan 3D-skrivas ut med vilken lämplig stereolitografiskrivare som helst från ett lämpligt harts. Användningen av kolfilmer som täcker ett TEM-nät innebär vanligtvis att kolet flyter på provet28. Detta tillvägagångssätt för att förbereda negativa fläcknät minimerar luftexponeringen under supporthantering, vilket minskar förorening och proteindenaturering. Beredningen av galler som använder flytande kol i små brunnar är fördelaktigt för att flyta en större yta, dvs. i ett vattenbad eller Petriskål, i vilket fall mekanisk klippning av kolet sker mycket lättare.
UAc kan vara svårt att köpa på grund av gällande hälso- och säkerhetsbestämmelser vid tidpunkten för publiceringen. Många andra vanliga, icke-radioaktiva, negativa färgning reagenser finns tillgängliga, och protokoll för deras beredning har beskrivits tidigare29. Även om alternativa fläckar inte har använts med detta stödflottörblock, är det inte troligt att det skulle finnas några skillnader i dessa protokoll förutom optimering av inkubationstiden med prov (steg 3.5), som redan i sig är provberoende. Det viktigaste steget i detta GrOx-supportförberedelseprotokoll är steg 4.4, som markeras av anteckningen för att förhindra att vatten- och GrOx-lösningen kommer i kontakt runt gallerkanten. Olämplig blandning av vatten- och GrOx-lösningar förhindrar enkelriktad sedimentering av GrOx-flingorna genom kapillärverkan. Att ha GrOx-flingor på båda sidor av kolfolien resulterar i tjocka lager, vilket negerar fördelarna med att använda GrOx som ett nästan enda lagerstöd, samt att fånga vatten mellan flingorna, vilket orsakar förorening av användbara områden med ytterligare lager av is. Grafenoxid stöd beredning är relativt lätt att uppnå med hjälp av droppar av lösning på flexibel polyolefin film. När det utförs på detta sätt är det dock lättare att oavsiktligt förorena kopparsidan av nätet genom felhanteringsfel; Användningen av flytblocket minskar sannolikheten för denna eventualitet.
Slutligen presenterar detta dokument ett protokoll för att förbereda grafentäckta galler som undviker någon form av grafenförbehandling för att göra det hydrofilt, vilket minskar dess kostnad och ökar dess tillgänglighet. Att underhålla en fuktad film under hela provberedningen och applicera provet in situ i blocket strax före frysning är tillräckligt för att möjliggöra generering av lämpliga islager för kryo-EM med en homogen provfördelning. Sammantaget minimerar protokollen som presenteras här provkontakten med luft-vattengränssnittet, vilket minskar provav denaturering och stöder förorening. För de tre stödfilmer som används i dessa metoder skulle homogena provfördelningar kunna uppnås över rutnäten tillsammans med avbildning av intakta, välbevarade enskilda partiklar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla medlemmar i sektionen för struktur – syntetisk biologi vid Imperial College London som har hjälpt till att testa dessa tekniker, liksom Harry Barnett vid Imperial College Advanced Hackspace och Paul Simpson vid Centre for Structural Biology. CHSA stöds av ett Sir Henry Dale Fellowship som finansieras gemensamt av Wellcome Trust och Royal Society (206212/Z/17/Z).
Basic Plasma Cleaner (230 V) | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
Dumont tweezers N5A INOX. | Dumont Swissmade | 0302-N5A-PO | |
Dumont tweezers NGG INOX. | Dumont Swissmade | 0102-NGG-PO | |
Ehtylacetate | Sigma-Aldrich | 270989-250ML | |
Fishing Loops 10 μL | VWR | 612-9353 | |
Graphene Oxide 2 mg/mL | Sigma-Aldrich | 763705-25ML | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 31232-250MG | |
Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm | Agar Scientific | AGG250-1 | We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm |
Monolayer Graphene on Cu | Graphenea | N/A | 10 mm x 10 mm, pack of 4 |
n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) | GLYCON Biochemicals GmbH | D97002-C | |
Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-101-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids | Enzo Life Sciences | JBS-X-102-Cu300 | |
Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids | Electron Microscopy Sciences | Q350AR1 | |
Scissors | Agar Scientific | AGT577 | |
Uranyl Acetate | TAAB Laboratories Equipment | U001 | |
Vitrobot Mark IV | FEI | N/A | |
Whatman filter paper 55 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-055 | |
Whatman filter paper 70 mm | GE Healthcare Life Sciences | 1441-070 |