Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kultur metoder til at studere apikale-specifikke interaktioner ved hjælp af tarmorganoid modeller

Published: March 23, 2021 doi: 10.3791/62330
Automatic Translation
*1, *2, *2, 1, 2, 2,3, 1, 2
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi to protokoller, der gør det muligt at modellere tarmapikaspecifikke interaktioner. Organoid-afledte tarmmonolag og AIR-Liquid Interface (ALI) kulturer letter generering af veldifferentierede epithelia tilgængelige fra både lysarms- og basolaterale sider, mens polaritetsindvendte tarmorganoider udsætter deres apikale side og kan opnås til høje gennemløbsanalyser.

Abstract

Tarmepitelets foring består af et simpelt lag af specialiserede epitelceller, der udsætter deres apikale side for lumen og reagerer på eksterne signaler. Nylig optimering af in vitro-kulturbetingelser giver mulighed for genskabelse af tarmstamcellenicher og udvikling af avancerede 3-dimensionelle (3D) kultursystemer, der opsummerer cellesammensætningen og organiseringen af epitelet. Tarmorganoider indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM) kan opretholdes på lang sigt og selvorganisere for at generere et veldefineret, polariseret epitel, der omfatter en intern lumen og en ekstern eksponeret basal side. Tarmorganoidernes restriktive karakter udgør en udfordring med hensyn til at få adgang til epitelin vitroens apikale overflade og begrænser undersøgelsen af biologiske mekanismer såsom optagelse af næringsstoffer og interaktioner mellem vært og mikrobiota/host-patogen. Her beskriver vi to metoder, der letter adgangen til den apikale side af organoidepitelet og understøtter differentieringen af specifikke tarmcelletyper. For det første viser vi, hvordan ECM fjernelse fremkalder en inversion af epitelcelle polaritet og giver mulighed for generering af apikale-out 3D organoider. For det andet beskriver vi, hvordan man genererer 2-dimensionelle (2D) monolayers fra enkeltcelleaffjedringer afledt af tarmorganoider, der består af modne og differentierede celletyper. Disse teknikker giver nye værktøjer til at studere apikale-specifikke interaktioner af epitel med eksterne signaler in vitro og fremme brugen af organoider som en platform for at lette præcision medicin.

Introduction

Tarmepitelet er det næststørste epitel i menneskekroppen og består af et polariseret cellelag, der letter optagelsen af næringsstoffer og fungerer som en barriere mod miljømæssige fornærmelser1. Denne skelnen mellem de apikale og basolaterale sider gør det muligt for epitelceller at udføre deres forskellige funktioner. Det apikale rum udsættes for lumen og formidler de epiteliske interaktioner med miljømæssige stimuli og mikroorganismer, samtidig med at det letter optagelsen af næringsstoffer. Basolateraloverfladen huser intercellulære kryds og cellematrix vedhæftninger, mens de blander sig med celler i immunsystemet og andet væv2. Disse knudepunkter genererer et uigennemtrængeligt monolag fastgjort til kældermembranen, der fungerer som en barriere og leverer de absorberede næringsstoffer til det omgivende kropsvæv.

Etableringen af kultursystemer, der er i stand til at rekapitalere disse tarmfunktioner in vitro, har været udfordrende3. Konventionelle in vitro modeller udnytte forvandlet human kolorektal cancer cellelinjer, såsom Caco-2, til at generere 2D monolayer kulturer. På trods af at de er i stand til at modellere flere funktioner i absorptive rumet, kan disse modeller ikke fuldt ud opsummere tarmepitelets sammensætning og funktion, som begrænser centrale funktionelle egenskaber og applikationer4,5.

Fremkomsten af organoider som et avanceret 3D-kultursystem genereret fra stamceller, der selvorganiserer og differentierer sig til organspecifikke celletyper, var et gennembrud i in vitro-undersøgelsen af tarmepitelet6. Tarmorganoider er indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM), der ligner de basale lamina og danner cellematrixkryds, der gør det muligt for disse kulturer at bevare epitelets apicobasale polaritet. Organoider udviser en lukket arkitektur, hvor den apikale side udsættes for det luminale rum og dermed efterligner tarmens struktur. Selvom denne lukkede organisation giver mulighed for at studere orienteringsspecifikke funktioner, begrænser den undersøgelser, der kræver adgang til den apikale side af epitelet. Der er taget forskellige tilgange til at overvinde disse begrænsninger i både 2D og 3D, herunder organoid fragmentering, organoid mikroinjection og generation af monolayerkulturer7. Organoid fragmentering forårsager tab af den strukturelle organisation og ødelæggelsen af cellekryds, hvilket gør det muligt at udsætte epitelets apikale overflade for mediet. Denne teknik udnytter fragmenternes regenerative kapacitet til at reformere organoider , når de sås i en ekstracellulær matrix og er blevet brugt til at modellere infektionssygdomme og værtspatogeninteraktioner8,9. Samtidig adgang til både den apikale og basale overflade kan dog også fremkalde ikke-specifikke infektionsresponser.

En alternativ tilgang, der giver adgang til den apikale overflade og bevarer både den strukturelle arkitektur og cellekryds, repræsenteres af mikroinjektionen af faktorer i organoidernes lumen. Denne metode er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere værtspatogeninteraktioner og modellere virkningerne af Cryptosporidium10, H. pylori11og C. difficile12 på mave-tarmepitelet in vitro. Ved hjælp af lignende teknikker blev det mutagene potentiale i pks+ stamme af E. coli på tarmepitelet bestemt13. Selv om det er effektivt, organoid mikroinjection er en besværlig og ineffektiv opgave i betragtning af det store antal organoider, der er nødvendige for at blive injiceret for at opnå målbare virkninger og derfor begrænser dens anvendelse for høj gennemstrømning assays.

Nylige fremskridt med tarmorganoider har også givet metoder til etablering af 2D-monolagsorganoidkulturer , hvorved deres apikale overflade14,15,16,17. Disse organoid-afledte monolayers rekapitalulere nøglen in vivo egenskaber tarm epitel. De udviser en fysiologisk relevant cellesammensætning, der indeholder både differentierede og stamcellepopulationer og modellerer mangfoldigheden på tværs af krypto-villus-aksen. Da apicobasal polaritet bevares, giver de iboende monolayeregenskaber nem adgang til både de apikale og basolaterale sider og medieudvekslinger kan efterligne tarmflow og fjernelse af affald, hvilket giver mulighed for langsigtet kultur. Disse funktioner gør organoid-afledte monolayers modtagelige for undersøgelser med fokus på luminale interaktioner og giver en overlegen model for epitelbarriere integritet og permeabilitet18,19.

Undersøgelser har vist , at epitelcellepolariteten er stramt reguleret af ECM-proteiner i MDCK-sfæroider20,21 og for nylig i humane tarmorganoider22. Fjernelse af ECM-komponenter eller hæmning af den integrinreceptor, der formidler cellematrixkrydsene, resulterer i en polaritetsændring af tarmorganoider og eksponering af epitelets apikale side til mediet22. Denne tilgang har tiltrukket sig interesse fra forskere, der arbejder med smitsomme sygdomme, da det giver nem adgang til den apikale side i 3D og gør det modtageligt for høje gennemløbsanalyser. Her beskriver vi en modificeret protokol baseret på det nylige arbejde fra Amieva lab22, der letter genereringen af 3D-tarmorganoider, der let udsætter deres apikale side. Vi skitserer også en protokol, der effektivt og reproducerbart kan generere tarm 2D-monolag afledt af tarmorganoider.

Protocol

Afledning af humane tarmorganoidkulturer blev udført som beskrevet andetsteds23. Organoider blev opretholdt i kulturen som beskrevet i produktinformationsarket (PIS) for tarmorganoidudvidelsesmediet (se materialetabellen).

1. Inversion af tarmorganoid polaritet

BEMÆRK: Dette afsnit vil skitsere protokollen for at vende polariteten af 3D-tarmorganoider. Denne protokol indeholder en detaljeret procedure for etablering af polariserede organoider med en eksponeret apiktisk overflade i suspension i en dyrkningsplade. Denne protokol er tænkt som en endepunktsanalyse, selv om organoiderne kunne opretholdes i denne kropsbygning i over 2 uger og opretholde en lille stamcellepopulation, der giver dem mulighed for at genetablere apikale organoider ved passage.

  1. Coating cultureware og rør med anti-klæbende opløsning
    BEMÆRK: For at maksimere antallet af apikale tarmorganoider og forhindre uønsket tilknytning til cultureware er forlakering af cultureware generelt påkrævet. Nedenstående afsnit beskriver belægningen af kultur og plastartikler med anti-vedhængende opløsning.
    1. Coat kultur plader, der skal anvendes i suspensionen del af protokollen som følger.
      1. Der tilsættes 0,5 ml anti-vedhængende opløsning til hver brønd på en 24-brønds vævskulturplade.
      2. Slyng pladen for at sprede opløsningen jævnt over overfladen og væggene i brøndene.
      3. Centrifuge pladen ved 1.300 x g i 10 min.
      4. Fjern anti-vedhængende opløsning fra hver brønd ved hjælp af en aspirator eller en 1 ml pipette.
      5. Vask brøndene med 1 mL DMEM/F-12 med 15mM HEPES (DMEM/F12).
      6. Fyld hver vasket godt med 0,5 mL DMEM/F-12 og opbevar pladen ved 37 °C og 5% CO2 indtil brug.
        BEMÆRK: Hvis de ikke anvendes med det samme, kan de belagte plader opbevares i inkubatoren i mindst 1 uge.
    2. Coat 15 mL koniske rør, der anvendes i denne protokol som følger.
      1. Der tilsættes 4 ml antitilstændendelig opløsning til det 15 ml koniske rør.
      2. Slyng røret for at sprede opløsningen jævnt over overfladen af væggene.
      3. Centrifuge røret ved 1.300 x g i 10 min.
      4. Fjern den anti-klæbende opløsning fra røret.
      5. Røret vaskes 1x med 5 mL DMEM/F-12 og aspireres DMEM/F-12. Rørene er nu klar til brug.
        BEMÆRK: Hvis den ikke anvendes med det samme, tilsættes 5 ml DMEM/F12 og opbevares ved 4 °C. Overtrukne rør kan opbevares ved 4 °C i mindst en uge.
  2. Polaritetsinversion af tarmorganoider ved suspensionskultur
    BEMÆRK: Nedenstående trin beskriver inversionen af tarmorganoider, der tidligere er dyrket under standard ECM-kuppelforhold. De procedurer, der er beskrevet her, er for en brønd af en 24-brønds plade. Hvis du bruger andet cultureware, skal du justere mængderne i overensstemmelse hermed.
    1. Fjern og kassér forsigtigt mediet fra hver brønd, der indeholder organoider, uden at forstyrre kælderenmbranens ekstracellulære matrixkuppel. Sørg for, at organoidernes størrelse er på 150-250 μm diameter (typisk på dag 3-5), før inversionsprotokollen påbegyndes.
    2. Der tilsættes 1 ml iskold dissociationsopløsning i hver brønd.
    3. Inkuber ved stuetemperatur (15-25 °C) i 1 min.
    4. Der tilsættes mindst 2 ml anti-klæbende opløsning til et 15 ml rør, der skal bruges til belægning af plastspidser.
    5. Der tilsættes mindst 2 ml DMEM/F-12 til et 15 ml rør, der skal bruges til vask af plastspidser skyllet med anti-klæbende opløsning.
    6. Coat en 1 mL pipettespids med anti-klæbende opløsning, pipetter 1 ml opløsning tre gange ind i røret med anti-klæbende opløsning fra trin 1.2.4.
    7. Spidsen vaskes i kold DMEM/F-12, og opløsningen hældes tre gange i røret med DMEM/F-12 fra trin 1.2.5.
    8. Ved hjælp af den belagte spids skal kuplerne forsigtigt løsnes ved at pipette langsomt. Pas på ikke at forstyrre eller fragmentere organoiderne.
    9. Organoidaffjedringen overføres til en plade, der er behandlet med anti-klæbende opløsning (fra trin 1.1.1).
    10. Pladen anbringes på en shaker ved 4 °C i 30 min. En gyro shaker kan bruges ved 70 omdrejninger i minuttet.
      BEMÆRK: Undgå hård rysten, såsom at hvirvle prøven, da det kan resultere i organoid fragmentering. Dannelsen af bobler og skum kan indikere hård rysten.
    11. Efter 30 minutter skal du fjerne pladen. Ved hjælp af en 1 mL pipettespids belagt med anti-klæbende opløsning skal opløsningen forsigtigt pipettes op og ned.
    12. Pladen anbringes på en shaker ved 4 °C i 15 min. En gyro shaker kan bruges ved 70 omdrejninger i minuttet.
    13. Fjern pladen og lad organoiderne bosætte sig ved tyngdekraften (1-2 minutter ved stuetemperatur). Overhold pladen under mikroskopet for at verificere organoid sedimentering.
      BEMÆRK: Undgå omfattende omrøring af pladen, da det kan forårsage afregnede organoider til at genbruge.
    14. Når organoiderne er faldet til ro, fjernes så meget af dissociationsopløsningen som muligt, og der vaskes ved at tilsætte 1,5 ml DMEM/F-12.
    15. Lad organoiderne sedimentere og fjern så meget af supernatanten som muligt. Gentag vasketrinnet igen.
      BEMÆRK: Overhold pladen under mikroskopet for at kontrollere organoid sedimentering, før du udfører et vasketrin.
    16. Fjern så meget af DMEM/F-12 som muligt og tilsæt 0,5 mL tarmorganoid ekspansionsmedium. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2.
    17. Den følgende dag skal du udføre en delvis medium ændring ved at vippe pladen på en 25- til 30-graders vinkel og fjerne medium langs brøndens væg. Fjern 0,4 mL medium, og pas på ikke at fjerne ophængte organoider.
    18. Tilsæt 0,4 mL tarmorganoid ekspansionsmedium. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 i 3 dage.
      BEMÆRK: Efter 3 dage skal de fleste organoider have en apiktisk polaritet, men store aggregater kan have dannet sig.
    19. Hvis der er dannet granulater, skal du bruge en 1 ml pipette med en spids belagt med anti-vedhængende opløsning (som beskrevet i trin 1.2.6 og 1.2.7) for at klippe aggregaterne ved at pipette op og ned 20 gange, mens du trykker enden af spidsen ind i bunden af pladen.
    20. Pladen anbringes ved 37 °C og 5% CO2, og der foretages en fuld medium ændring næste dag med tarmorganoidudvidelsesmedium (som beskrevet i punkt 1.2.17).
    21. Efter 2 dage (dag 5 i suspension) kan apikale tarmorganoider anvendes i downstream-assays.

2. Etablering af intestinale celle 2D monolayer og Air-Liquid Interface (ALI) kulturer afledt af 3D tarmorganoider

BEMÆRK: Dette afsnit vil skitsere protokollen for at generere 2D monolayer kulturer fra tarmorganoider. Denne teknik giver den fordel, at der etableres en sammenløbet, polariseret monolayerkultur med en eksponeret apiktisk overflade i en vævskulturplade, der indeholder cellekulturmembranindsats. Selvom monolayeren begynder at differentiere sig i det nedsænkede monolayerformat, kan der opnås yderligere differentiering af monolayer ved at skifte til en ALI-kultur, efter at den har nået sammenløb. Både monolayer og efterfølgende ALI-protokoller er tænkt som endepunktsanalyser, og selvom monolagskulturen opretholder en lille stamcellepopulation, kan ingen af dem opdeles effektivt og passeres, når den er etableret.

  1. Forberedelse af medier og plader til tarmmonolayerkultur
    1. Forbered intestinale organoid differentiering Medium som skitseret af producenten for monolayer kultur (se Liste over materialer). Der tilsættes kun Y-27632 til et medium, der vil blive anvendt inden for 1 uge ved en endelig koncentration på 10 μM. Hvis den ikke anvendes med det samme, opbevares den ved 4 °C.
    2. Forvarme Trypsin EDTA (0,05%) til 37 °C.
    3. Mindst 2 timer før såning af monolayerkulturer fremstilles en 2% ECM-belægningsopløsning som følger.
      1. Tø ECM på is og tilsæt 1:50 til kold, steril PBS for at forberede en 2% opløsning. Der fremstilles tilstrækkelige mængder til at tilsætte 100 μL til den øverste brønd af hver 6,5 mm (0,33 cm2) cellekulturmembranindsats, der skal anvendes. Juster lydstyrken korrekt for større eller mindre kulturer.
    4. Der tilsættes 100 μL til hver brønd, og hver plade inkuberes ved 37 °C og 5% CO2, indtil det er nødvendigt (mindst 2 timer før såning).
  2. Dissocierende tarmorganoider til monolagsgeneration og -kultur
    1. Fjern et passende antal organoidkulturbrønde fra inkubatoren. Se tabel 1 for det anbefalede antal brønde, der skal høstes til forskellige kulturvarer.
    2. Indsug alt medium fra organoidkulturerne uden at forstyrre ECM-kuplen.
    3. Der tilsættes 1 ml dissociationsopløsning til hver brønd.
    4. Inkuber ved stuetemperatur (15-25 °C) i mindst 1 min.
    5. Ved hjælp af en 1 mL pipette, kraftigt pipette op og ned for at forstyrre kuplen og frigive organoider.
    6. Pool de suspenderede organoider fra hver brønd i et 15 mL konisk rør. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter med blid omrøring eller rokkende. Organoider til såning af flere brønde kan samles på dette trin, op til 10 mL volumen i hvert rør.
    7. Centrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
    8. Fjern og kassér supernatanten. Der tilsættes 5 mL iskold DMEM/F-12 til genbrugte organoider.
    9. Der blandes og centrifuges igen ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
    10. Aspirere supernatant, fjerne så meget som muligt, være omhyggelig med ikke at forstyrre pellet.
      BEMÆRK: Nogle resterende ECM kan forblive i pellet; dette bør dog ikke i væsentlig grad påvirke organoidernes dissociation.
    11. Der tilsættes 1 mL forvarmede (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05%) til genopståede organoider. Bland grundigt for at sikre en jævn affjedring. Tilføj op til yderligere 1 mL Trypsin-EDTA for et stort antal celler, eller hvis der er en betydelig mængde ECM tilbage.
    12. Inkuber ved 37 °C i 5-10 min.
    13. Bland grundigt med en 1 mL pipette for at forstyrre organoiderne så meget som muligt. Organoider bør adskilles fuldstændigt i enkelte celler eller små fragmenter. Hvis der er større fragmenter eller hele organoider tilbage efter grundig pipettering, skal inkubationen fortsættes med Trypsin-EDTA ved 37 °C i yderligere 3-5 min.
      BEMÆRK: Inkubat må ikke inkuberes med Trypsin-EDTA i mere end 20 minutter, da dette kan resultere i et øget tab af cellegabilitet.
    14. Når organoiderne er tilstrækkeligt adskilte, tilsættes et tilsvarende volumen DMEM/F-12 (f.eks. 1 mL DMEM/F-12 pr. mL Trypsin-EDTA) og pipettes op og ned for at blandes grundigt. Inaktiver Trypsin-EDTA ved at tilføje 10% FBS til DMEM/F-12 i dette trin.
    15. Centrifugefragmenter ved 200 x g i 5 min ved 2-8 °C.
    16. Hvis de dissociated organoider undlader at pellet, dette er almindeligt og kan skyldes en ophobning af slim frigivet af de dissociated celler. I dette tilfælde blandes cellerne grundigt ved at pipette op og ned og centrifugere dem igen ved 200 x g i 5 min ved 2-8 °C.
    17. Fjern forsigtigt så meget supernatant som muligt, så kun cellepillen efterlades.
    18. Resuspend cellerne i 100 μL intestinal organoid differentiering medium (med 10 μM Y-27632) for hver brønd, der skal sås. Juster lydstyrken korrekt for større eller mindre brøndstørrelser.
    19. De overtrukne plader fjernes fra inkubatoren (tilberedt i trin 3.1.4) og fjernes den overskydende ECM fra hver brønd.
    20. Der tilsættes 100 μL af celleophænget til den øverste brønd i hver cellekulturindsats.
    21. Tilsæt 500 μL tarmorganoiddifferentieringsmedium til den nederste brønd i hvert cellekulturindsats.
    22. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2.
    23. Udskift mediet i både de øvre og nederste brønde hver 2. til 3. dag. Monolayer kulturer bør nå sammenløb inden for 7 dage og vil ofte nå sammenløb inden for 2-3 dage.
  3. Etablering af en AIR-Liquid Interface (ALI) kultur
    BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan yderligere differentiering af en nedsænket tarmmonolayerkultur opnås ved at overføre den nedsænkede monolagskultur til en ALI-kultur. Denne kulturmetode vil tillade en stigning i antallet af differentierede celletyper, især celler i sekretorisk afstamning, såsom bæger- og enteroendokrine celler.
    1. Etablere en monolayer kultur i en celle kultur indsætte som beskrevet ovenfor i trin 2.2.1-2.2.23 og opretholde denne kultur på 100% sammenløb i mindst 4 dage.
    2. For at etablere en ALI-kultur skal du fjerne medium fra de øvre og nedre brønde. Tilsæt frisk tarmorganoid differentieringsmedium (med Y-27632) til den nederste brønd, hvilket efterlader den øverste brønd tom.
    3. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2.
    4. Udskift mediet i den nederste brønd hver 2-3 dage og lad monolayer at differentiere i mindst 1 uge.
    5. Skyl den øverste brønd med steril PBS for at fjerne overskydende slimakkumulering, hvis det er nødvendigt.
      Under disse forhold kan ALI-kulturen opretholdes i mindst 2-3 uger.

Representative Results

Organoider blev genereret fra biopsiprøver efter den protokol, der tidligere var beskrevet23, og i for intestinal organoid ekspansionsmedium (se materialetabellen). Figur 1A, Venstre Panel, viser fænotypen af tarmorganoiderne dyrket i en kuppel med tarmorganoidudvidelsesmedium. Under disse kulturforhold udviser organoider en cystisk morfologi defineret af et tyndt (10-25 μm) epitel, der omslutter en lumen (Figur 1A, Højre Panel). På dette stadium vender den apikale side af tarmepitelet mod lumen, mens basolateralsiden kontakter den omgivende ekstracellulære matrix. Da størstedelen af organoiderne nåede den ønskede størrelse, blev den ekstracellulære matrix fjernet, og organoiderne blev derefter dyrket i suspension. Tabet af cellulær binding til den ekstracellulære matrix udløser en inversionsproces i organoiderne, hvilket resulterer i en vending af polariteten af organoidepitelet, udsætter den apikale side af epitelet for vækstmediet og internaliserer basolateralsiden.

I nogle kulturer, organoider i suspension aggregat og sikring, en effekt, som er mere dybtgående i løbet af de første 3 dage (Figur 1B, Venstre Panel). Anvendelse af en klipningsteknik gør det muligt at løsne organoiderne og fortsætte kulturerne i dagevis med minimal omlægning (Figur 1B, Højre panel).

Tarmorganoider, der dyrkes i ECM-kupler, fortsætter med at ekspandere (Figur 1C, Venstre Panel) og udviser spontan dannelse af sekundære spirende strukturer, der ligner små krypter, på basolateralsiden af epitelet omkring lumen ( Figur1C, HøjrePanel). Samtidig fortsætter organoider, der opretholdes i 5 dage uden ekstracellulær matrix, med at udvikle sig i suspension (Figur 1D, Venstre panel). Inversion af polariteten er karakteriseret ved fortykkelsen (30-40 μm) af epitelet, der omgiver organoidernes kerne og udseendet af en række morfologier: langstrakt (figur 1D, højre panel og supplerende figur 1A), cystisk (supplerende figur 1B) og uregelmæssig (supplerende figur 1C). Dette kombineres ofte med en indskrænkning af det luminale rum i organoiden, der påvirker deres samlede størrelse.

Effektiv inversion kan også bekræftes ved at analysere udtrykket af tarmspecifikke polaritetsmarkører. Apical-out tarmorganoider viser en tydelig lokalisering af kernerne mod organoidens lumen, som angivet af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) signalet. Udtrykket af apikale markører, såsom VILLIN (Figur 2A) og ZO-1 (Figur 2B), registreres på ydersiden af epitelet, der udsættes for mediet. Denne lokalisering står i skarp kontrast til den, der observeres i tarmorganoider dyrket i ECM. Ekstracellulære matrix indlejrede organoider farves til kerner (DAPI), VILLIN (Figur 2C), og ZO-1 (Figur 2D) viser en apicobasal polaritet, hvor den apikale side vender lumen af organoid.

Fuldstændig fjernelse af ECM er nødvendig for at opnå effektiv polaritetsinversion af tarmorganoiderne. Lejlighedsvis, en del af organoider findes i suspension kulturer omgivet af ECM rester, viser en cystisk morfologi, der tyder på en svigt i polaritet inversion af epitel (Supplerende figur 2A). Analyse af immunfluorescerende farvning, der udføres på disse organoider, viser, at kernerne (DAPI) er basolaterale (DAPI) langs epitelet og udtrykket ZO-1 på den apikale side, der vender ud mod organoidens lumen (supplerende figur 2B), der bekræfter, at ufuldstændig ECM-fjernelse forårsager fastholdelse af apicobasal polaritet på samme måde som ECM-indlejrede organoider.

Protokollen for etablering af tarmmonolayerkulturer resulterer i en sammenflydende monolayerkultur inden for 7 dage efter såning, og kulturen vil ofte nå sammenløb inden for så lidt som 2-3 dage. En af de største determinanter for succes er antallet og kvaliteten af celler, der anvendes til frø monolayer. Figur 3A, Venstre panel giver et eksempel på en ideel såningstæthed på ca. 150.000 celler i et 6,5 mm cellekulturmembranindsats. Dette tal er ikke fast og kan være meget varierende baseret på donoren og kvaliteten af kildeorganoidkulturen; Cellenummeret bør derfor optimeres baseret på disse variabler. Hvis såningstætheden er for lav eller af dårlig kvalitet (Figur 3A, Højre Panel), er der muligvis ikke tilstrækkelige vedhæftede filer til at danne en sammenflydende monolagskultur.

Når monolaget er etableret (Figur 3B), danner cellerne tætte knudepunkter, hvilket skaber et brostensbelagt udseende (Figur 3B, Venstre panel). Hvis de undlader at danne et sammenløbet monolayer (Figur 3B, Højre Panel), vil monolayerens udseende ofte være "ujævnt", med regioner af god kvalitet cellevedhæftning, men med større huller mellem disse regioner. Disse kulturer giver ikke en funktionel barriere mellem de basale og apikale rum og er ikke egnede til de beskrevne assays. En sammenløbet monolag orienterer sin VILLIN-holdige børste kant mod den apikale side af epitelet, med sin kerne placeret mod basolateral pol i cellen (Figur 4B). Mellem celler dannes intercellulære kryds bestående af multiproteinkomplekser, herunder ZO-1 (Figur 4B). Deres tilstedeværelse er nøglen til at give den epiteliske kulturs barrierefunktion.

Når overgangen til en ALI-kultur er sammenløbet, medfører den yderligere differentiering af kulturen(figur 3C). Små, runde bægerceller vises, og selve monolayeren får et mere foldet udseende. Selv om bægerceller er til stede i epitel af neddykket kultur (Figur 4A), de er mere fremtrædende efter ALI differentiering. Bægerceller til stede i epitel udskiller slim, hvilket fører til et tåget udseende over toppen af epitelet. Bægercellerne og det udskillede slim kan visualiseres ved farvning for det udskillede mucinprotein MUC2 (Figur 4A, C og D), og stigningen i bægercellepopulationen kan måles ved en stigning i MUC2-ekspressionen ( Supplerende figur3A). Det er ikke nødvendigt at fjerne dette gellignende slimlag, og det vil holde sig til overfladen af epitelet og forblive efter gentagne vaske. Hvis fjernelse er nødvendig, vaskes kulturen med en mucolytisk forbindelse, såsom 10 mM N-acetylcystein eller 50 μg/mL DTT, fjernes overskydende slim. Ud over stigningen i bægercellepopulationen øger ALI-grænsefladen også tilstedeværelsen af enteroendokrine celler (som angivet med CHGA-udtryk) (Supplerende figur 3B) og modne enterocytter (som angivet i KRT20-udtryk) (Supplerende figur 3C).

Figure 1
Figur 1: Stadier af den apikale intestinale organoide generation. (A) Repræsentative billeder af en kuppel med organoider af den ønskede størrelse på dag 4 (Venstre panel, Skala bar = 500 μm). Organoider er tynde indhegnede med et åbent lysrum (højre panel, skalastang = 100 μm). (B) Repræsentativt billede af en brønd med omfattende sammenlægning efter 3 dages suspension (venstre panel, skalastang = 200 μm). Billede af klumpfragmenter direkte efter klipning (højre panel, skalalinje = 200 μm). (C) Repræsentativt billede af tarmorganoider i kuplen på dag 7. Organoider viser en udvidet lumen med dannelsen af små knopper på basolateralsiden af epitelet (Venstre 20x forstørrelse, Højre 100x forstørrelse af det markerede område, Skalastang = 200 μm). d) Repræsentativt billede af tarmorganoider efter fjernelse af ECM og efterfølgende suspensionskultur i 5 dage. Organoiderne opnår en tæt morfologi med et fortykket epitel og udsætter deres apikale side til mediet. (Venstre 20x forstørrelse, højre 100x forstørrelse af det markerede område, Skalalinje = 200 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2:Immunfluorescerende farvning for cellepolaritetsmarkører i tarmorganoider. Apical-out (A, B), og apical-in (C, D) orienterede tarmorganoider blev plettet med apikale markører ZO-1 og VILLIN, og med epitel markør E-CADHERIN (rød). DAPI (blå) blev brugt til at visualisere kerner. Venstre paneler viser billeder taget ved 25x forstørrelse og højre paneler vise billeder af forskellige organoider ved 63x forstørrelse (kun panel C viser 25x og 63x forstørrelse af samme organoid). (A)Apical-out tarmorganoider, der er farvet med VILLIN (grøn) og E-CADHERIN (rød), angiver eksponeringen af den apikale side til mediet. (B) Apical-out tarmorganoider farves med ZO-1 (grøn) og E-CADHERIN (rød) viser tilstedeværelsen af stramme vejkryds og reversion af apicobasal polaritet. (C) Matrigel-indlejret tarmorganoid farvet med VILLIN (grøn) og E-CADHERIN (rød), der viser den apikale side mod organoid lumen. (D) Matrigel-indlejrede tarmorganoider, der er farvet med ZO-1 (grøn) og E-CADHERIN (rød), og som angiver tilstedeværelsen af apikale stramme knudepunkter, der vender mod organoidens lumen. (Skalabjælke = 100 μm). Organoider blev plettet af immunfluorescens og afbildet ved hjælp af tidligere offentliggjorte protokoller24,25. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Etablering af tarmmonolayerkulturer ( A) Repræsentativt billede af 3D-organoider efter behandling med 0,05% Trypsin-EDTA. Organoider er dissociated til enkeltceller eller små celle-klumper som forberedelse til såning monolayer kulturer. Venstre panel: eksempel på en optimal såningstæthed for en monolagskultur, ca. 150.000 celler pr. 100 μL på et 6,5 mm cellekulturmembranindsats. Højre panel: eksempel på suboptimal såningstæthed ved < 50.000 celler pr. 100 μL på et 6,5 mm cellekulturmembranindsats. (B) Repræsentativt lysfeltsbillede af en nedsænket monolagskultur. Venstre panel: 100% sammenflydende lag med det karakteristiske brostensbelagte udseende. Højre panel: ca. 50% sammenflydende monolag. Huller set i monolayer (angivet ved stiplede linje) tæt over tid på grund af den fortsatte spredning af tarm stamceller. (C) Repræsentativt lysfeltsbillede af en differentieret ALI-kultur på 7 dage. (Skalabjælke = 200 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Immunfluorescerende farvning for differentierede cellemarkører i monolagskulturer. (B) Z-stack billede af immunfluorescerende farvning af en neddykket monolayer. VILLIN farvning (grøn) langs den apikale ende af epitelet indikerer tilstedeværelsen af en børstekant, og ZO-1 farvning (rød) indikerer tilstedeværelsen af stramme kryds mellem cellerne (blå = DAPI). (C) Z-stack billede af immunfluorescent farvning af en ALI-differentieret monolayer kultur for mucin protein MUC2, der angiver tilstedeværelsen af et betydeligt større antal bægerceller inden for ALI monolayer kultur (grøn = MUC2, blå = DAPI). (D) Kryudt af den ALI-differentierede monolagskultur, der er farvet for tilstedeværelsen af MUC2 (grøn) og E-CADHERIN (rød), og som angiver tilstedeværelsen af bægerceller i epitelet og udskillelsen af slim langs monolayerkulturens apikale side. (Skalabjælke = 200 μm). Monolayer kulturer blev plettet af immunofluorescens og afbildet ved hjælp af tidligere offentliggjorte protokoller26,27. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Spektrum af fænotyper af apikale tarmorganoider i kultursuspension. (A,B,C) Yderligere repræsentative billeder af tarmorganoidmorologier, der opretholdes i suspension 5 dage efter ECM-fjernelse. Organoid polaritet har omvendt. Organoiderne er blevet mere tætte med et fortykket epitel, og den apikale side af organoiderne vender udad. Organoider kan vise en række morfologier: langstrakt (A), cystisk (B) og uregelmæssig (C). (Skalabjælke = 100 μm). Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 2: Tarmorganoider undlader at vende polariteten i nærværelse af restdræmbranmatrixmediet i suspensionskulturer. (A) Repræsentativt billede af ufuldstændig ECM-fjernelse og manglende invertering af organoidernes polaritet. Matrigel rester er til stede omkring organoider og bidrage til at opretholde epitel polaritet orienteret apical-in. Organoider viser en cystisk morfologi med et tyndt epitel omkring lumen (Scale bar = 200 μm). (B) Repræsentativt billede af en ikke-omvendt organoid, der findes under suspensionskulturforhold. Nuclei (blå = DAPI) og E-CADHERIN (rød) er placeret til basolateral side, ZO-1 (grøn) udtrykkes til den apikale side, der vender lumen af organoid. (Skalabjælke = 100 μm). Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 3: Genekspression af differentierede cellemarkører i monolagskulturer. (A,B,C) Udtryk for MUC2, CHGAog KRT20 i neddykket og ALI-differentieret monolayerkultur genereret i tarmorganoiddifferentieringsmedium i forhold til en 3D-organoidkultur dyrket med intestinale organoidudvidelsesmedium etableret via qPCR. Etablering af en neddykket monolayerkultur øger ekspressionen af hver differentieret cellemarkør; Differentiering som ALI-kultur øger imidlertid ekspressionen af hver markør eksponentielt. Fejllinjer = +/- SEM. Klik her for at hente denne fil.

KULTURTØJ TIL MONOLAG ANTAL BRØNDE AF TARMORGANOIDER, DER SKAL HØSTES (fra 50 μL kuppel/pr. brønd, der skal sås)
6,5 mm Transwell-skær 1 - 2 brønde
12 mm Transwell-skær 3 - 4 brønde
6-brønds plade 6 - 8 brønde
24-brønds plade 3 - 4 brønde
96-brønds plade 1 - 2 brønde

Tabel 1: Antal brønde af tarmorganoider, der skal høstes til forskellige kulturvarer

Discussion

Epitelorganoidmodeller er blevet kraftfulde platforme, der kan bruges til at modellere vævsorganisation, sygdomsprogression og identificereterapier 23,28,29. Organoid mikroinjection har tilføjet værdi til organoidernes evne til modellering af smitsomme sygdomme, da det giver mulighed for patogeninteraktion med den apikale side af værtsepitelet. Nylige fremskridt inden for mikroinjection teknikker har optimeret injektion hastighed i organoider og har opnået en hastighed på op til 90 injiceres organoider i timen. Barrierefunktionen i injicerede organoider blev bevaret, og den lave iltkoncentration inde i lumen gjorde det muligt for overlevelsen af obligatoriske anaerob injicerede bakterier30. Undersøgelser har imidlertid bemærket tilstedeværelsen af heterogenitet i organoidpopulationer inden for samme brønd. Disse forskelle blev observeret i størrelse og form31, ekspressionsniveauer for nøglegener32samt spredningsrater33. Differentialresponser inden for samme organoidpopulation på forbindelser som forskolin og PGE2 eller koleratoksin er også blevet beskrevet28,33. Disse resultater fremhæver behovet for høje organoidtal i undersøgelser og begrænser udnyttelsen af luminal injektion.

Konventionel organoidkultur er baseret på indkapsling og formering af organoider i en hydrogel. Hydrogels kan dog udgøre begrænsninger på diffusion og indføre koncentrationsgradienter, hvilket kan øge heterogeniteten34. Desuden er der dokumenteret stor variation, ikke kun mellem kulturer og donorer, men også under individuelle forsøgsbetingelser. Donorkilde, hydrogelens biokemiske egenskaber og organoidens iboende heterogenitet som kultursystem er vigtige faktorer, der kan øge eksperimentel variation og begrænse reproducerbarheden af resultater opnået i downstream-applikationer. Begge de metoder, der er beskrevet her, giver et simpelt middel til at udsætte den apikale side af epitelet, hvilket giver mulighed for modellering af forbindelser og patogener af interesse ved direkte at tilføje dem til kulturmediet. Reduktionen i hydrogeludnyttelsen kan begrænse eksperimentelle variabilitet fra tekniske fejlkilder.

De apikale intestinale organoider bevarer de vigtigste egenskaber ved organoidmodelsystemet, og deres skalerbarhed gør dem mere modtagelige for høje gennemløbsanalyser sammenlignet med 2D-monolayeren. Da organoiderne bevarer deres 3D-struktur, er tilgængeligheden af den basale side imidlertid begrænset og kan hindre undersøgelser, der kræver adgang til begge sider samtidigt.

Vi har vist, at polaritetsinversionen af tarmorganoider afhænger af en effektiv og absolut fjernelse af ECM, samtidig med at organoidernes intakte struktur bevares. Både brugen af dissociationsopløsningen til at fjerne ECM og den anti-vedhængende løsning til at forhindre organoider i at klæbe til plastmaterialet bidrog til at forbedre den samlede effektivitet af den protokol, der blev offentliggjort af Co. J. Y. og kolleger22, navnlig med hensyn til antallet af apikale organoider, der blev produceret til downstream-applikationer.

Desuden bemærkede vi, at vores protokol understøtter en mere effektiv inversion af organoider mindre end 250 μm og ved hjælp af større organoider kan resultere i en reduceret organoid output, på grund af fragmentering forårsaget af pipetting. Bredborespidser, som dem, der er angivet i materialetabellen, kan tillade brug af større organoider. Bredborespidser er dog mindre effektive i ECM-dissociation sammenlignet med standardspidser på grund af den lavere anvendte mekaniske kraft. Derfor kan gentage trin 1.2.9-1.2.11 være påkrævet for tilstrækkelig forstyrrelse og fuldstændig fjernelse af alle ECM-rester, når der arbejdes med større organoider.

Organoider i suspension kan overleve i mindst 2 uger. Efter denne periode observerede vi morfologiændringer og et øget antal celledød. Tilstedeværelsen af formerende celler i de apikale organoider22 giver mulighed for genetablering af apikale intestinale organoidkulturer. Dette kan opnås ved at adskille apikale organoider til enkelte celler og integrere dem i ECM med tarmorganoid ekspansionsmedium.

En begrænsning, der ofte forekommer i protokoller, der beskriver etableringen af tarmorganoider i suspensionskulturer, er generering af store aggregater. Dette påvirker flere variabler såsom effektivitet, reproducerbarhed af de morfologiske træk, permeabilitet til forbindelser og parakrinesignalering. I lighed med protokollen offentliggjort af Co, J. Y. og kolleger bekræfter vi her at have opnået polaritetsinversion på mindst 97% af alle de suspenderede organoider uden at klippe efter 3 dage i suspension. I modsætning til offentliggørelsen har vi imidlertid indført et mekanisk dissociationstrin for at reducere dannelsen af store aggregater og øge udbyttet. Da denne procedure kan beskadige organoidernes epitel, forlængede vi organoids inkubationsperioden i yderligere 2 dage for at muliggøre fuldstændig epitelgenvinding og sikre kulturer af høj kvalitet til downstream-applikationer. Indførelsen af konstant omrøring ved brug af en inkubator shaker eller en spinner kolbe kan potentielt reducere fusionshændelser, minimere fragmentering og øge iltningen. Disse alternative tilgange kan opretholde kulturerne i længere tid, reducere celledøden og give mulighed for yderligere differentiering af de apikale tarmorganoider.

Etableringen af en organoid-afledt 2D monolayer giver flere fordele og ulemper i forhold til de omvendte polaritet organoider. Den her beskrevne protokol giver mulighed for hurtig etablering af en sammenløbet monolayerkultur, typisk på mindre end 7 dage og mulighed for langsigtet vedligeholdelse af kulturerne i en længere periode (op til 10 uger). Protokollen og de medier, der anvendes her, giver også mulighed for effektiv differentiering af et betydeligt antal celler, der ikke altid findes i andre organoid-afledte monolayerkulturer16. Etablering af en monolayer på en cellekulturindsatsmembran giver samtidig adgang til både de apikale og basolaterale sider af epitelet, hvilket gør dem ideelle til undersøgelser i barriereintegritet og epiteltransport. Denne forenklede adgang gør dem også mere modtagelige for infektions- og lægemiddelbehandlingsundersøgelser. Desuden opretholder disse kulturer mange af de egenskaber, der er unikke for donoren, og bevarer deres relevans for patientspecifikke undersøgelser. ALI-kulturmetoden letter også differentieringen af et mere funktionelt epitel bestående af både sekretoriske og absorptive celletyper, hvilket gør det mere repræsentativt for det menneskelige tarmepitetel. Den relative stabilitet i disse kulturer gør det også muligt at opretholde dem i en længere periode, hvilket giver mulighed for langsigtede undersøgelser. Begrænsningerne i denne tilgang er imidlertid det store antal celler, der kræves for at etablere et sammenstømret monolag, og behovet for at opretholde fuldstændig sammenløb for at have en funktionel adskillelse mellem de apikale og basolaterale kamre. Den karakteristiske kryptarkitektur, som kan modelleres i 3D-organoidkulturerne, går også tabt ved etablering af en monolagskultur. Ikke desto mindre gør kulturens eksperimentelt venlige format og den lethed, hvormed de apikale og basolaterale sider af epitelet kan tilgås, det til et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af tarmfysiologi.

Disclosures

G.S., W.C. og S.S. er medarbejdere hos STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (UK). M.S., F.E., S.L., A.E., og R. K.C. er medarbejdere hos STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Canada).

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret af Horizon 2020-bevillingen OrganoVIR 812673 på projektet Organoids for Virus Research - Et innovativt uddannelse-ITN-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies Inc. 7010 For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mL STEMCELL Technologies Inc. 38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free Corning 356231 Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts STEMCELL Technologies Inc. 38023/38024 For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate STEMCELL Technologies Inc. 38017 For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) STEMCELL Technologies Inc. 37350 For washing 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D2650 Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies Inc. 36254 For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) STEMCELL Technologies Inc. 7174 For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 6010 For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 100-0214 For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%) STEMCELL Technologies Inc. 7910 For 2D Monolayer establishment.
Y-27632 STEMCELL Technologies Inc. 72302 RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tips Corning #TF-1005-WB-R-S Organoids handling

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
  4. DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
  9. Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
  18. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
  27. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
  32. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).

Tags

Biologi tarmorganoid apicobasal polaritet tarmmonomerer cellekulturmembranindsatser polaritetsinversion modeller
Kultur metoder til at studere apikale-specifikke interaktioner ved hjælp af tarmorganoid modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stroulios, G., Stahl, M., Elstone,… More

Stroulios, G., Stahl, M., Elstone, F., Chang, W., Louis, S., Eaves, A., Simmini, S., Conder, R. K. Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models. J. Vis. Exp. (169), e62330, doi:10.3791/62330 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter