Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62351
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Central European Institute of Technology, Masaryk University

Summary

Vi presenterer en protokoll for lamellforberedelse av dypfryste biologiske prøver ved kryofokusert ionstrålemikromaskinering for høyoppløselige strukturelle studier av makromolekyler in situ med kryo-elektrontomografi. Den presenterte protokollen gir retningslinjer for fremstilling av høykvalitets lameller med høy reproduserbarhet for strukturell karakterisering av makromolekyler inne i Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

I dag er kryo-elektrontomografi (cryo-ET) den eneste teknikken som kan gi næratomiske oppløsningsstrukturdata på makromolekylære komplekser in situ. På grunn av den sterke samspillet mellom en elektron med saken, er høyoppløselige cryo-ET-studier begrenset til prøver med en tykkelse på mindre enn 200 nm, noe som begrenser anvendbarheten av kryo-ET bare til de perifere områdene i en celle. En kompleks arbeidsflyt som består av utarbeidelse av tynne cellulære tverrsnitt ved kryofokusert ionstrålemikromaskinering (cryo-FIBM) ble introdusert i løpet av det siste tiåret for å muliggjøre innsamling av kryo-ET-data fra det indre av større celler. Vi presenterer en protokoll for fremstilling av cellulær lamell fra en prøve vitrified ved å stupe frysing ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som et prototypisk eksempel på en eukaryotisk celle med bred utnyttelse i cellulær og molekylærbiologisk forskning. Vi beskriver protokoller for vitrifisering av S. cerevisiae i isolerte flekker av noen få celler eller en kontinuerlig monolayer av cellene på et TEM-rutenett og gir en protokoll for lamellforberedelse ved kryo-FIB for disse to prøvene.

Introduction

Nyere teknologisk og programvareutvikling har gjort elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) av vitrifiserte biologiske prøver en av de viktigste teknikkene i strukturell biologi forskning i det siste tiåret1,2. Utarbeidelsen av et eksemplar for kryo-EM består vanligvis av påføring av et renset protein eller et kompleks av protein med nukleinsyre på prøvebæreren (TEM-rutenett), etterfulgt av fjerning av det meste av væsken med et filterpapir, og dypp frysing av rutenettet med det gjenværende tynne laget av en prøve i flytende etan eller propan3. . Prøven er dermed festet i et tynt lag (vanligvis <80 nm) av amorf buffer i en fullt hydrert tilstand, ved nesten innfødte forhold, og uten behov for kjemisk fiksering eller tungmetallkontrast. Avbildning av den strukturelt homogene prøven i transmisjonselektronmikroskopet resulterer deretter i data som kan brukes til bestemmelse av makromolekylets tredimensjonale struktur ved nesten atomisk oppløsning ved hjelp av en enkelt partikkelanalyseprotokoll2. En slik in vitrostruktur tilsvarer representasjonen av makromolekylet under forholdene og behandlingen som brukes under prøvepreparering. Selv om strukturene som bestemmes under in vitro-forholdene vanligvis tilsvarer makromolekylets fullt funksjonelle tilstand, vil evnen til å bilde romlige relasjoner mellom ulike makromolekyler inne i cellen gi en ekstra funksjonell kontekst til strukturdataene.

Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) brukes til å rekonstruere 3D-volumer av pleomorfiske gjenstander eller makromolekylære komplekser in situ4,5. Fordelen med cryo-ET er at den tredimensjonale informasjonen oppnås ved å forestille seg en enkelt enhet. Imidlertid er oppløsningen der individuelle makromolekylære komplekser eller organeller observeres, svært begrenset. Derfor er gjennomsnitt av makromolekylene (sub-tomogram gjennomsnitt, STA) med samme struktur fra et større antall tomogrammer nødvendig for å nå 4-8 Å-oppløsningsmodeller fra cryo-ET-dataene6,7. Det har nylig blitt vist at kryo-ET og STA også kan brukes til å bestemme høyoppløselige strukturer av makromolekylære maskiner som ribosomer i sammenheng med det cellulære miljøet7. Bruken av transmisjonselektronmikroskopi er imidlertid begrenset av prøvetykkelsen. Generelt er dette ikke et problem for enpartikkel cryo-EM der optimalisering av vitrifiseringsforholdene til slutt kan resultere i innebygging av prøven i et tynt lag med is. På den annen side er de fleste cellene faktisk ikke elektron gjennomsiktige for 300 keV elektronstrålen. Den uelastiske gjennomsnittlige frie banen i vitrifiserte biologiske prøver for de 300 keV-elektronene er ca. 395 nm8, noe som betyr at kryo-ET-studier er begrenset til cellulær periferi for de fleste cellene.

Ulike teknikker ble utviklet for å tynne prøven ned til en tilstrekkelig tykkelse for kryo-ET. Cryo-ultramikrotomi benytter mekanisk kutting av prøven med en diamantkniv ved flytende nitrogentemperatur (-196 °C) for å gi 60-80 nm tykke seksjoner egnet for kryo-ET9,10,11. Flere inndelinger kan klargjøres fra en enkelt celle, og dataanalysen kan til slutt produsere 3D-strukturinformasjon for den største delen av cellen. Den mekaniske kuttingen kan imidlertid forårsake flere artefakter, for eksempel buede seksjoner, sprekker eller prøvekomprimering, noe som kan påvirke den resulterende strukturen og forutinnta cryo-ET-dataene10,11,12. Kryofokusert ionstrålemikromaskinering (cryo-FIBM) representerer en alternativ tilnærming der et tynt cellulært avsnitt fremstilles ved gradvis ablasjon av prøven ved hjelp av en fokusert stråle av Ga + ioner (FIB) i en flertrinnsprosess, noe som kan resultere i 80-300 nm tykt cellulært tverrsnitt (lamella)13,14,15 . I motsetning til kryo-ultramikrotomi fremstilles bare en lamell fra en enkelt celle, som representerer ~ 0,3-3% av volumet, og mikromaskinering av flere celler er vanligvis nødvendig for å finne en region av interesse i det fresede tverrsnittet. I tillegg er gjennomstrømningen av hele arbeidsflyten i dag fortsatt ganske lav, ofte begrenset til 6-8 høykvalitets lameller fra en 8-timers cryo-FIBM-økt. På den annen side er cryo-FIBM-tverrsnittene blottet for kompresjonsartefakter og gir passende innspill for høyoppløselig kryo-ET. Videre er overføringen av lamellen til prøvebæreren for kryo-ET ikke nødvendig, da prøven beholdes på TEM-rutenettet under hele lamellforberedelsesprosessen, og det samme rutenettet kan deretter overføres til TEM. Vi forventer at gjennomstrømningen av cryo-FIBM vil bli betydelig forbedret snart, hovedsakelig fra tilgjengeligheten av programvare for uovervåket lamell fresing16,17 og utnyttelse av FIBer som opererer på prinsippet om charge-couple plasma, som vil ha råd til raskere materialblasjon.

Saccharomyces cerevisiae (gjær) er eukaryote celler av sfærisk form og diameter på ~ 2-5 μm. Takket være sin størrelse, tilgjengelighet, genetikk, generasjonstid og enkel manipulasjon, blir gjæren grundig studert som en eukaryotisk modellorganisme i cellulær og molekylærbiologisk forskning som ligner Escherichia coli, som er godt studert som en prokaryotisk modellorganisme i bakteriologi. Gjæren kan lett dyrkes i suspensjon og en høy mengde celler genereres på kort tid (doblingstid 1 - 2 timer). Enda viktigere er at gjær deler en kompleks intern cellulær struktur med dyre- og planteceller samtidig som det beholder et lite genom som består av et lavt innhold av ikke-kodende DNA. Strukturell karakterisering av gjærproteomet fra høyoppløselige in situ-data kan dermed bidra til å gi en mekanistisk beskrivelse av den omfattende mengden funksjonelle data som er tilgjengelige i litteraturen.

Heri gir vi en omfattende protokoll for anskaffelse av in situ cryo-ET-data på gjærprøven, som dekker alle trinn fra prøvedyrkingen ned til kryo-FIBM lamellpreparatet, og prøveoverføringen til TEM for kryo-ET datainnsamling.

Protocol

1. Dyrking og tilberedning av Saccharomyces cerevisiae celler for vitrifisering

  1. Forbered flytende vekstmedium for Saccharomyces cerevisiae.
    1. Autoklaver en 500 ml glassflaske for fremstilling av vekstmedium.
    2. Vei 2,2 g gjærekstrakt (1,1%) og 4,4 g Peptone (2,2%) og bland i 200 ml vann.
    3. Steriliser ved autoklavering i 15 min ved 121 °C.
    4. Vei 10 g glukosepulver og bland i 50 ml vann for å få 20% glukoseoppløsning. Før løsningen gjennom et 0,2 μm filter og oppbevar den ved 4 °C.
  2. Forbered solid medium for Saccharomyces cerevisiae.
    1. Vei 4 g agarpulver og bland med 200 ml vekstmedium.
    2. Steriliser i en autoklav i 15 min ved 121 °C.
    3. Avkjøl mediet til 40-50 °C og tilsett 20 ml 20% steril glukose (tilberedt i forrige trinn). Hell ~20 ml av hele mediet i Petri-fatet og la det størkne ved omgivelsestemperatur.
    4. Pakk agarplatene i parafilm for å beskytte mot tørking og oppbevar ved 4 °C.
  3. Kultur Saccharomyces cerevisiae i suspensjon
    MERK: Protokollen er optimalisert for fremstilling av en prøve for kryo-FIBM fra en suspensjon av cellelinjen Saccharomyces cerevisiae stamme BY4741 [ATCC 4040002] eller lignende stammer.
    1. Autoklaver en 50 ml Erlenmeyer (eller lignende) kolbe.
    2. Arbeid i en hette eller laminær strømningsboks. Pipette 10 ml av vekstmediet til en steril 50 ml Erlenmeyer-kolbe.
    3. Suppler mediet med 1 ml filtrert 20% glukose. Velg en koloni av gjær fra en agarplate med en steril, engangs inokulasjonssløyfe (1-10 μL).
    4. Plasser Erlenmeyer-kolben i inkubatoren og kulturen ved 30 °C med agitasjon (150-200 o/min) til den eksponentielle fasen er nådd (ca. 7 timer).
      MERK: Vi har observert at den eksponentielle fasen nås etter ~ 15 timer når kolonier plukkes fra agarplater som har blitt dyrket ved omgivelsestemperatur i 4 uker. Se også Merknad nedenfor.
  4. Kultur Saccharomyces cerevisiae på en agarplate fra glyserol lager.
    1. Bruk en ny agarplate fra oppbevaringen på 4 °C.
    2. Ta S. cerevisiae-lageret fra -80 °C dypfryseren og legg den i et frysestativ for å unngå fullstendig opptining av lageret.
    3. Skrap av og overfør en liten kultur med en steril inokulasjonssløyfe (1-10 μL) til 50 μL vekstmedium. Bland ordentlig.
    4. Overfør hele volumet av blandet S. cerevisiae kultur og spred med en steril spredningspinne over overflaten av agarplaten.
    5. Inkuber ved 30 °C i ca. 48 timer til koloner med 1,5-2 mm diameter dannes.
      MERK: Det anbefales å dyrke koloniene ferskt før eksperimentet. Kolonier eldre enn 1 uke vil kreve en lengre periode for dyrking i flytende medier for å nå den eksponentielle vekstfasen.
  5. Kultur Saccharomyces cerevisiae på en agarplate.
    1. Bruk tilberedte agarplater med voksne S. cerevisiae kolonier.
    2. Pipette 10 ml steril vekstmedium og 1 ml filtrert 20% glukose til en 50 ml Erlenmeyer kolbe.
    3. Velg en koloni av S. cerevisiae kultur med en steril inokulasjonssløyfe og bland med et vekstmedium i en kolbe.
    4. Inkuber 50 minutter ved 30 °C med agitasjon (150-200 o/min).
    5. Fortynn suspensjonskulturen ti ganger med vekstmediet og spre 50 μL suspensjon på en agarplate med en steril spredningspinne.
    6. Inkuber ved 30 °C i ca. 48 timer til 1,5-2 mm kolonier observeres.
    7. Pakk kantene på Petri-parabolen med parafilm for å forhindre at den tørker. Oppbevars ved romtemperatur og bruk i maksimalt 4 uker.
  6. Forbered Saccharomyces cerevisiae for dypfrysing i celleklynger.
    1. Forbered S. cerevisiae cellekulturen i henhold til protokollen i avsnittet Dyrking av Saccharomyces cerevisiae i suspensjon (Avsnitt 1.3) og inkuber ~ 7 h ved 30 °C med agitasjon (150-200 o/min).
    2. Mål OD av S. cerevisiae celle suspensjon kultur ved 600 nm ved hjelp av en UV / Vis spektrofotometer.
    3. Konsentrer celleopphenget til OD600 = 1.
  7. Forbered S. cerevisiae for dykkfrysing i en cellemonolayer.
    1. Forbered S. cerevisiae cellekultur i henhold til protokollen i avsnittet Dyrking av Saccharomyces cerevisiae suspensjon cellekultur og inkubere ~ 7 h ved 30 °C med agitasjon (150-200 rpm).
    2. Mål OD av S. cerevisiae celle suspensjon kultur ved 600 nm ved hjelp av en UV / Vis spektrofotometer.
    3. Overfør cellene i medium til sentrifugerøret og spinn forsiktig i 2 minutter med en relativ sentrifugalkraft (900 x g).
    4. Kast mediet fra cellepellet ved pipettering.
    5. Tilsett friskt medium til cellepellet. Beregn medievolumet for å få en cellesuspensjon på OD600 som tilsvarer 30 til 60.
    6. Tilsett glyserol (50% lagerløsning) til cellefjæringen til en endelig konsentrasjon på 5% kort tid før vitrifisering.
      MERK: Glyserol fungerer som et beskyttelsesmiddel, noe som forbedrer kvaliteten på isen i områdene mellom cellene. Glyserol legges til celler bare kort tid før vitrifisering for å minimere opptaket i cellen.

2. Vitrifisering av Saccharomyces cerevisiae-prøven

  1. Glødeutladning TEM-gitter med karbonfilmsiden vendt opp i 30-45 s (trykk: 6-9 Pa, strøm: 7 mA).
  2. Sett vitrifiseringsroboten til følgende parametere: temperatur: 18 °C, fuktighet: 100 %, flekktid: 6 s, ventetid: 5 s, blottingssyklus: 1x og blolotkraft: 5.
    MERK: Blolotkraft er en instrumentspesifikk verdi, og optimale flekker kan variere mellom forskjellige maskiner. Den optimale verdien for et bestemt stempel må bekreftes eksperimentelt.
  3. Forbered flytende etan for vitrifisering.
  4. Monter den ikke-absorberende overflateputen på blottingsputen som vender mot prøven. Bruk filterpapiret til den andre blottingsputen.
  5. Velg det glødeladede rutenettet med pinsettene og monter pinsettene på det dype fryseinstrumentet.
  6. Påfør 3,5 μL S. cerevisiae suspensjon på karbonsiden av rutenettet inne i stempelklimakammeret. Bland ordentlig før hver applikasjon på rutenettet.
  7. Dypp fryse gitteret inn i flytende etan.
  8. Overfør nettet fra flytende etan til LN2. Oppbevar gitter med vitrifiserte celler under LN2-forhold, eller monter dem i TEM-gitterkassetten for lasting i FIB-SEM-mikroskopet.

3. Montering av TEM-gitter i gitterkassetten

MERK: Arbeidsflyten som er beskrevet her, bruker TEM-rutenettene som er montert i rutenettkassetten for å lette prøvehåndtering og overføring mellom SEM- og TEM-mikroskoper. Patronenheten består av en C-ring, et TEM-rutenett og en C-klipsring. Andre alternativer er tilgjengelige når du arbeider med instrumentering fra andre mikroskopprodusenter. Arbeidsstasjonen for montering av rutenettkassetter er fylt med LN2. LN2-nivået dekker rutenettboksen med TEM-gitteret, men monteringen av TEM-gitteret i patronen utføres i LN2-damper. Det anbefales på det sterkeste å bruke en beskyttende ansiktsmaske eller skjold under vitrifiseringsprosedyren for å forhindre forurensning fra å puste til prøven. Ikke arbeid med verktøyene som har akkumulert isforurensning.

  1. Sett sammen arbeidsstasjonen for montering av gitterkassetten og klargjør tørre verktøy for klipping.
  2. Kjøl ned arbeidsstasjonen med LN2. Avkjøl klippeverktøyene til LN2-temperaturen.
  3. Plasser en rutenettboks med en vitrifisert prøve i monteringsarbeidsstasjonen.
  4. Plasser et TEM-rutenett med prøven med celler vendt ned til C-ringen og fest med en C-klips.
  5. Plasser de klipte patronene i rutenettboksen og lukk dem ordentlig.
  6. Oppbevar patroner i LN2 Dewar eller last dem inn i FIB-SEM-mikroskopet.

4. Lasting og manipulering av prøven til FIB-SEM mikroskopet

MERK: Instruksjonene ble skrevet for bruk av dual-beam mikroskop Versa 3D utstyrt med PP3010 cryo-FIB / SEM forberedelsessystem. Alternative løsninger kan kreve forskjellige spesifikke parametere; Det generelle konseptet med arbeidsflyten bør imidlertid fortsatt være gyldig.

  1. Avkjøl mikroskopet ned til flytende nitrogentemperatur.
    1. Pump mikroskopkammeret og tilberedningskammeret (hvis det finnes) til et høyt vakuum før starten av nedkjølingen (< 4 x 10-4 Pa) for å forhindre forurensningsvekst.
    2. Sett nitrogengassstrømmen til 5 L/min for tilberedningskammeret, mikroskopstadiet og mikroskopets antikontaminator. Vent til alle komponenter når en temperatur på < -180 °C.
      MERK: FIB-SEM mikroskopoppsettet som brukes i denne studien, bruker avkjølt nitrogengass for å kjøle ned scenen og antikontamineatoren. Andre systemer kan bruke en annen metode for scenekjøling. Kammertrykket når ~ 3 x10 -5 Pa når scenen og antikontamineatoren er ved -190 °C på instrumentet som brukes her. Vekstraten til hydrokarbonkontamineringslaget på overflaten av lamellen med det eksperimentelle oppsettet som brukes i denne studien er ~ 15 nm / time.
  2. Legg gitterkassetten med prøven i mikroskopet.
    1. Monter og avkjøl lastestasjonen til LN2-temperaturen.
    2. Plasser romfergen (prøveholderen), gitterboksen med prøven, rutenettboksåpneren og pinsettene i den avkjølte lastestasjonen.
    3. Overfør nettkassetten forsiktig med prøven vendt opp i romfergen.
    4. Vri skyttelbussen på innsiden av lastestasjonen til lasteposisjonen.
    5. Last inn i mikroskopet.
  3. Eventuelt belegge prøven med metallbeskyttende lag.
    MERK: En sterk ladeeffekt kan observeres ved avbildning av frossent hydrert biologisk materiale SEM. I tillegg induserer avbildning av biologiske prøver med FIB (selv ved lave strømmer) rask prøveskade. Derfor kan et ekstra belegg av prøven utføres inne i FIB-SEM mikroskopet, for å beskytte prøveoverflaten.
    1. Deponer det beskyttende laget med organometallisk platina ved gassinjeksjonssystemet (GIS).
      1. Sett prøven til eusentrisk høyde (tilfeldighetspunkt for avbildning med elektroner og ioner).
      2. Vipp scenen tilbake til 45° (prøve vippet 90° i forhold til elektronstråle).
      3. Flytt scenen i z-aksen4 mm under den eusentriske høyden.
      4. Sett GIS-nålen til 26–30 °C.
      5. Deponer ~300-1000 nm av det organometalliske platinalaget til rutenettet med den biologiske prøven (tilsvarer 30-120 s av GIS-avsetningen).
        MERK: Vi bruker vanligvis GIS i 30 s for prøver med små cellulære klynger og 45 s for prøver med en monolayer av cellene.
    2. Sputter belegge prøveoverflaten med et ledende metalllag.
      1. Deponer ~10 nm av metalllaget (Ir, Au, Pt) til rutenettet med en biologisk prøve.
  4. Angi mikroskopparametere for lamellpreparatet
    1. For FIB, bruk følgende parametere: høyspenning = 30 kV, strøm = 10 pA (bildebehandling), 10 pA–3 nA (FIB-fresing)
    2. For SEM, bruk følgende parametere: høy spenning = 2-5 kV, spotstørrelse = 4,5, strøm = 8-27 pA.
    3. Sett skannerotasjonen til 180° for begge bjelkene.
    4. Still inn trinnvinkelen: fresevinkel 6-11° (tilsvarer trinnvinkel på 13°–18° for prøvefergen med forvinkel på 45° og FIB/SEM mikroskop med 52° vinkel mellom SEM- og FIB-kolonne).

5. Forberedelse av Saccharomyces cerevisiae lamell

  1. Kontroller rutenettkvaliteten og velg en passende klynge av Saccharomyces cerevisiae.
    1. Kontroller at TEM-rutenettet er ordentlig flekkete fra begge sider uten ekstra vann rundt celleklyngen eller på baksiden av rutenettet.
      MERK: For å sjekke baksiden av rutenettet, drei scenen til -10° og bilde rutenettet med FIB.
    2. Velg de optimale celleklyngene for lamellpreparat i henhold til følgende anbefalinger.
      1. Plasser celleklyngene i rutenettet i midten. Freseområdet bør ikke strekke seg utenfor torget med dimensjoner 1100 x 1100 μm plassert i midten av rutenettet (550 μm i hver retning fra rutenettet).
      2. Plasser celleklyngene i den sentrale delen av rutenettet uten overlapping til rutenettlinjen.
      3. Plasser celleklyngene i rutenettet med kompakt hullet karbonfolie uten sprekker.
      4. Påse at klyngen ikke er omgitt av isforurensning.
  2. Velg den optimale freseposisjonen i Saccharomyces cerevisiae monolayer.
    1. Kontroller at rutenettlinjene rundt cellemonolayet på den merkede rutenettplassen er synlige.
    2. Velg den optimale posisjonen i det cellulære monolayeret i henhold til følgende anbefalinger. De valgte områdene for fresing bør oppfylle følgende kriterier:
      1. Ha interesseområdet i nettsenteret. Freseområdet bør ikke strekke seg utenfor kvadratet av dimensjoner 1100 x 1100 μm plassert i rutenettet (550 μm i hver retning fra midten av rutenettet).
      2. Ha interesseområdet i den sentrale delen av rutenettet uten overlapping med rutenettlinjen.
      3. Ikke omgi cellemonolayeren med isforurensning.
  3. Forbered S. cerevisiae lamell med kryo-FIB.
    MERK: Fresemønsteret genereres og midtstilles i forhold til interesseområdet. Cryo-FIBM utføres sekvensielt med flere fresetrinn utført med forskjellige FIB-innstillinger. Lamellen med omtrent 2 μm tykkelse er i utgangspunktet malt med høy strøm (0,3-3 nA). Lamellen blir deretter gradvis tynnet til 500 nm. Finfresingstrinnet ved lave strømmer (10-30 pA) brukes til å fullføre lamellen til ~ 100-200 nm tykkelse.
    1. Sett en region av interesse (ROI) til eusentrisk høyde og lagre denne posisjonen.
      MERK: Tilfeldighetspunktet må bestemmes og lagres for hver posisjon separat. Den eusentriske høyden stilles inn ved å vippe scenen til 0° og sentrering på avkastningen ved å flytte scenen i x- og y-retningen. Scenen vippes deretter til 25° og avkastningen bringes tilbake til midten av det skannede området ved å endre trinn z-akseposisjonen. Til slutt vippes scenen tilbake til 13°–18° for fresing.
    2. Definer et rektangulært fresemønster over avkastningen med skanneretningen Topp til Bunn.
    3. Definer et rektangulært fresemønster under avkastningen med skanneretningen Bunn til Topp.
    4. Definer det inaktive rektangulære fresemønsteret som dekker interesseområdet for en grov estimering av lamelltykkelsen. Dette mønsteret er ikke malt under lamellforberedelse.
    5. Merk alle mønstre og angi lamellbredden (x dimensjon). Bredden på fresemønsteret bør ikke overstige 2/3 av klyngebredden. Dette tilsvarer i de fleste tilfeller 8-15 μm.
    6. Angi parametere for grove fresetrinn
      1. FIB strøm: 0,3–3,0 nA ; endelig lamell tykkelse: 1,5-2 μm; bredden på FIBM-området: 8-12 um; trinn-tilt: 13-17°; varighet: 8 minutter; aktive fresemønstre: øvre og nedre.
      2. FIB strøm: 0,3–1,0 nA; endelig lamell tykkelse: 1 μm; bredden på FIBM-området: 7,5-11,5 μm; trinn-tilt: 13-17°; varighet: 8 minutter; aktive fresemønstre: øvre og nedre.
      3. FIB strøm: 100–300 pA; endelig lamell tykkelse: 0,5 μm ; bredden på FIBM-området: 7,5-11,5 μm; trinn-tilt: 13-17°; varighet: 8 minutter; aktive fresemønstre: øvre og nedre.
      4. FIB strøm: 30–100 pA; endelig lamell tykkelse: 0,3 μm ; bredden på FIBM-området: 7,5-11,5 μm; trinn-tilt: 13-17°; varighet: 8 minutter; aktive fresemønstre: øvre og nedre.
    7. Angi parametere for det fine fresetrinnet:
      1. FIB strøm: 10–30 pA; endelig lamell tykkelse: <0.2 um; bredden på FIBM-området: 7-11 μm; trinn-tilt: 13-17° (+1°); varighet: 12 minutter; aktive fresemønstre: øvre.
        MERK: De grove fresetrinnene (5.3.6) utføres sekvensielt for hver lamell. I motsetning følger det fine fresetrinnet (5.3.7) ikke direkte den grove fresingen, men fine fresetrinn utføres sekvensielt for alle lamellene på slutten av økten for å minimere hydrokarbonforurensningen på lamelloverflaten. En ekstra +1° trinnvinkel brukes under fint fresetrinn for å øke ensartetheten til lamelltykkelsen over lengden.

6. Overføring av Saccharomyces cerevisiae lamell til cryo-TEM

  1. Forbered en ordentlig tørket Dewar og fyll den med LN2.
  2. Fjern prøvene med lameller fra FIB/SEM-mikroskopet under kryoforhold, overfør dem til en gitterboks, og lagre dem i en LN 2-lagringsdewar for langtidslagring. Alternativt kan du laste rutenettene direkte inn i cryo-TEM.
  3. Riktig orientering av lamellen i forhold til kryo-TEM-trinn vippeaksen er viktig (se tilhørende video kl. 8:10 for mer informasjon). Forsikre deg om at freseretningen til forberedt lamell er vinkelrett på kryo-TEM-trinn vippeaksen.
  4. For-vipp cryo-TEM-scenen for å kompensere for lamellvinkelen i forhold til rutenettplanet og samle tilt-serien ved hjelp av dosesymmetrisk skjema19.
    MERK: Størrelsen på forvinkelen (vanligvis 6–8 °) bestemmes av vinkelen mellom TEM-rutenettplanet og FIB-retningen under mikromaskinering. Plasseringen av lamellfrontkanten i bildet i cryo-TEM kan brukes til å bestemme tegnet på forvinkelen. For det må følelsen av mikroskopstadiumrotasjonen være kjent. I vårt eksperimentelle oppsett tilsvarer plasseringen av forkanten av lamellen på høyre side av bildet tatt i nanoprobe SA-modus negativ pre-tilt.

Representative Results

Saccharomyces cerevisiae-kulturen ble høstet midt i den eksponentielle vekstfasen. Vi utarbeidet to typer prøver der cellene enten ble fordelt som små klynger av flere celler over overflaten av TEM-rutenettet (Figur 1A,C) eller dannet et kontinuerlig monolag over individuelle rutenett firkanter av TEM-rutenettet (Figur 1B,D). Den diskriminerende faktoren for utarbeidelsen av prøven med enten distinkte celle holmer eller cellulær monolayer er konsentrasjonen av cellekulturen som brukes på TEM-rutenettet. Den høstede cellekulturen var konsentrert til OD600 = 1,0 for det tidligere tilfellet, eller til HENHOLDSVIS OD600 = 30 til 60 for sistnevnte tilfelle. Prøven for fremstilling av cellulær monolayer ble ytterligere supplert med 5% v / v glyserol før vitrifisering. Glyserolen er kritisk for vitrifiseringen av bufferløsningen, som fyller plassen mellom cellene (figur 2) da refleksjonene fra den krystallinske bufferen kan være skadelige for riktig posisjonssporing og fokusering under kryo-ET-datainnsamling.

I tillegg ble gjærfjæringskulturen blottet mot det ikke-absorberende materialet som PTFE blotting pad eller den tilpassede 3D-trykte puten laget av FlexFill 98A-materiale. Blotting papiret ble plassert bare på baksiden av rutenettet med hensyn til prøveapplikasjonen (back-blotting). Back-blotting strategien anbefales for suspensjon kultur stupe frysing som blotting med filterpapir fra begge sider resulterer i vedheft av cellene til blotting papir (Figur 1E).

Protokollen som er beskrevet her, benytter TEM-rutenett som er klippet i gitterkassetten, som danner stabil støtte for nettet og letter prøvehåndteringen av prøven etter vitrifiseringen. Dette fremtvinger en nødvendighet av at andre prøveholdere og skyttelbusser i FIB/SEM- og TEM-mikroskop kan godta en slik nettkassett.

Ved overføring av prøven til FIB/SEM-mikroskopet ble prøven først belagt med et lag på 0,3–1,0 μm metylcyklopentadienyl platina ved hjelp av mikroskopgassinjeksjonssystemet (GIS). Et ekstra lag av det uorganiske iridiumet ble sputtert på prøveoverflaten for å herde GIS-laget og gjøre overflaten ledende. Lamellene ble malt i flere trinn (figur 3) der (I) fresestrømmen, (II) lamellbredden og (III) avstanden til freseområdet over og under prøvene ble redusert trinnvis. Det siste fresetrinnet ("polering") ble utført ved lav strøm (10-30 pA) bare fra oversiden av lamellen og med prøven tilbøyelig med ytterligere 1° mot Ga + -bjelken. Utnyttelse av den beskrevne protokollen har i gjennomsnitt resultert i 8-10 lameller forberedt på to TEM-rutenett innen en 6-8 timers økt.

TEM-gitteret med lamellene ble deretter overført til et transmisjonselektronmikroskop. Lamellene ble først screenet og bare de som viste minimal gardin (gjenstander som stammer fra ujevn fresing over lamelloverflaten), lavt overflateforurensningsnivå og god cellulær kontrast (vanligvis observert for lameller med <200 nm tykkelse) ble valgt for innsamling av kryo-ET-dataene. I tillegg ble lameller som inneholder sprekker over hele lengden kassert fra datainnsamling. Generelt var omtrent 50% av lamellene som ble overført til TEM egnet for datainnsamling. Tilt-serien ble samlet inn på post-GIF K2 direkte elektrondetektor med den energivalgende spalten satt til 20 eV. Datainnsamlingen ble utført i SerialEM programvare18 og tilt-serien ble samlet inn ved hjelp av en dose symmetrisk ordning19 med vippeområdet på ±60 ° og økningen på 3°. Dataene ble samlet inn ved forstørrelsen som tilsvarer pikselstørrelsen på 3,47 A/px. Den totale dosen på 65 e/Å2 ble jevnt fordelt over de enkelte underrammene. Vippebildene ble samlet inn som et sett med tre rammer, som senere ble korrigert for bevegelses- og strålingsskader under datainnsamling ved hjelp av MotionCor220-programmet. Parametere for kontrastoverføringsfunksjonen ble estimert ved hjelp av Ctffind421. Tilt-serien ble behandlet i eTomo18. Oppdateringssporingsrutinen ble brukt til å justere bildene. Tomogrammet ble rekonstruert ved hjelp av en vektet ryggprojeksjonsalgoritme etter 2x binning av bildene, og deretter filtrert ved hjelp av SIRT-lignende filter (satt til 8 gjentakelser) i IMOD18. Tomogramsegmenteringen ble utført manuelt i Amira-programvare22. De rekonstruerte tomogrammene gir en høyoppløselig representasjon av gjærens cellulære interiør og gjør det mulig for oss å observere organeller som vakuoler eller mitokondrier på et høyt detaljnivå eller studere makromolekylære komplekser som mikrotubuler, eller kjerneporkomplekser in situ og under nesten innfødte forhold (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: FIB- og SEM-bilder av vitrifisert S. cerevisiae
FIB- (A) og SEM (C) bilder av de små gjærklyngene vitrifisert på TEM-rutenettet. FIB- (B) og SEM (D) bilder av gjæren som danner en kontinuerlig monolayer på rutenettoverflaten. Prøven var belagt med GIS og Irridium lag før avbildning. Skalastolpene i paneler A-B tilsvarer 10 μm. Gjærprøven er blottet mot ikke-absorberende materiale som PTFE eller FlexFill 98A (grønn) og med blottingspapiret plassert fra baksiden av rutenettet (hvit, E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: S. cerevisiae lamell
Et TEM-bilde av en lamellmikromachined fra prøven med kontinuerlig monolayer gjær over rutenettoverflaten. Refleksjonene som ble observert mellom cellene inneholdt feil vitrifisert medium /buffer (A, uthevet med røde sirkler). Et TEM-bilde av lamell generert på gjæren vitrifisert til en kontinuerlig monolayer med tilsetning av 5% glyserol i mediet / bufferen (B). Skalastang tilsvarer 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Arbeidsflyt mellom Kryo og FIBM
Skjematisk skildring av lamellfreserprosessen. De første grove fresetrinnene utføres ved høye FIB-strømmer fra begge sider av den foreløpige lamellposisjonen (uthevet i grønt), mens det endelige poleringstrinnet bare utføres fra oversiden og ved lav FIB-strøm (uthevet i oransje, se tilhørende video kl. 6:33). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Gjærorganeller og makromolekylære komplekser avbildet av cryo-ET
Skiver av de rekonstruerte tomogrammer som viser en vakuol (A, skala bar: 200 nm), ribosomer (B, skala bar: 200 nm), en paracrystallin kjerne av peroksisom (C, skala bar: 100 nm), mikrotubule (hvit pil) i nærheten av uidentifisert fibrøst struktur (svart pil, D, skala bar: 100 nm), detaljer om flere mikrotubuler (E, skala bar: 50 nm), en kjernefysisk membran med porer angitt av piler (F, skala bar 200nm), mitokondrie (G, H, skala bar: 100 nm, pilene indikerer individuell cristae), en bunt av uidentifisert filamentøse strukturer (I, skala bar: 100 nm). Paneler B, C, D, E, G inneholder en del av tomogrammer fremstilt fra små klynger av celler, mens delene av tomogrammer samlet på lameller fra en monolayer av cellene er vist i panelene A, F, H, I. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Utarbeidelsen av cellulære prøver for cryo-ET er en kompleks arbeidsflyt som krever utnyttelse av flere avanserte instrumenter. Prøvekvaliteten kan kompromitteres under hvert forberedelsestrinn som påvirker gjennomstrømningen til hele protokollen. I tillegg utgjør nødvendigheten av prøveoverføringen mellom enkeltinstrumenter en ekstra risiko for prøvekontaminering eller devitrifisering. Derfor er optimalisering av individuelle trinn i arbeidsflyten for prøveforberedelse av høy betydning for å øke gjennomstrømningen og reproduserbarheten til lamellforberedelsesarbeidsflyten. Protokollen som presenteres her beskriver den optimaliserte forberedelsen av Saccharomyces cerevisiae for strukturell karakterisering av makromolekylære komplekser in situ ved cryo-ET.

Protokollen beskriver utarbeidelsen av to typer gjærprøver som hovedsakelig varierer i konsentrasjonen av cellene på TEM-rutenettet. Begge gjærprøvene ga lameller av høy kvalitet for kryo-ET, og valg av prøvetype kan gjøres i samsvar med målene i den aktuelle studien. Gjæren danner isolerte klynger av få celler tilfeldig spredt over rutenettoverflaten i det første tilfellet, mens en kontinuerlig monolayer av celler er til stede på TEM-rutenettoverflaten for den andre prøvetypen. Førstnevnte er egnet for rask lamellforberedelse takket være det lille volumet av materialet som må freses bort. Den endelige lamellen er ganske kort, og inneholder derfor bare 2-4 cellulære tverrsnitt. Områdene som er egnet for prøvepreparering, fordeles tilfeldig over rutenettoverflaten, inkludert rutenettplassene, noe som delvis kan begrense automatiseringen av lamellforberedelsesarbeidsflyten. Sistnevnte type prøve krever utnyttelse av større strømmer i den første fresefasen for å beholde den totale fresetiden. I tillegg er denne typen prøve mer utsatt for gjenstander som stammer fra ujevn fresing (gardiner). Derfor er GIS sputtered på prøveoverflaten i en 50% lengre periode enn i tilfelle av prøven med små cellulære klynger for å danne et tykkere beskyttende lag. Deretter sputteres prøven med et ekstra lag Iridium (alternativt platina eller gull) for å kurere GIS-laget, gjøre det stivere og øke prøveoverflatens ledningsevne. FIBM av ekstra områder på hver side av lamellen (~ 2-5 μm fra lamellkanten) under det første trinnet i den grove lamellfresingen ble funnet gunstig for å redusere antall ødelagte lameller mest sannsynlig på grunn av redusert spenning i det endeligetverrsnittet 23. Den endelige lamellen er lang og inneholder ~ 10 cellulære tverrsnitt, noe som øker antall regioner som passer for kryo-ET. Feil vitrifisering av mediet eller bufferen mellom cellene kan lett dempes ved tilsetning av kryo-beskytteren til bufferløsningen (5% glyserol som brukes i denne studien). Siden de fleste rutene er egnet for lamellpreparat, er prøven med celler organisert i en kontinuerlig monolayer godt egnet for uovervåket lamellforberedelse.

Et annet viktig aspekt i lamellforberedelsesarbeidsflyten er overføringen til transmisjonselektronmikroskopet og riktig posisjonering av lamellen til mikroskopstadiets vippeakse. Optimalt er lamellens hovedakse vinkelrett på mikroskopets vippeakse som gir sporing og fokusering på høyden av den avbildede regionen og forhindrer lamellkantene i å skjerme synsfeltet i høye vippevinkler. Ved innsamling av kryo-ET-data ved hjelp av dosesymmetrisk skjema, bør18 prøven i utgangspunktet roteres i mikroskopet for å kompensere for lamellens helling med hensyn til rutenettplanet.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen, og CIISB forskningsinfrastruktur, et Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Vi anerkjenner støtten fra Thermo Fisher Scientific Brno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Himedia MB053
Glucose PENTA 12020-31000
Glycerol Merck G5516-1L
ethane Messer 1007
LN2 Lineq LN2-1L
Peptone Merck P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae ATCC 201388 strain BY4741
Tweezers Dumont T539
Yeast extract Duchefa Biochemie Y1333.1000
Disposable
Blotting papers Ted Pella 47000-10
C-clip ThermoScientific 9432 909 97551
C-clip ring ThermoScientific 9432 909 97561
Spreading sticks Merck Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops BRAND BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes Sigma SIAL0166
TEM grids Quantifoil 4420G-XA
Equipment
Autoclave Systec 101291545
balances BEL M124A
Cryo-FIB/SEM microscope ThermoScientific 1006123
Cryo-TEM microscope ThermoScientific 9432 057 03301
Laminar flow box Telstar AH5
Plasma cleaner Gatan 955.82001
Shaking incubator New Brunswick M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer WPA S800
Vitrification robot ThermoScientific 9432 053 50621

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
  2. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
  3. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
  4. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
  5. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  6. Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  7. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
  8. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
  9. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
  10. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
  11. Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
  12. Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
  13. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
  14. Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
  15. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  16. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  17. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
  18. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  19. Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
  20. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  21. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
  22. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
  23. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).

Tags

Biokjemi utgave 177
Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av <em>Saccharomyces cerevisiae</em> for Cryo-Electron Tomography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravcová, J., Pinkas, M.,… More

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (177), e62351, doi:10.3791/62351 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter