Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Published: November 20, 2021 doi: 10.3791/62351
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Central European Institute of Technology, Masaryk University

Summary

Vi presenterar ett protokoll för lamella beredning av dopp frysta biologiska exemplar genom cryo-fokuserade jonstråle micromachining för högupplösta strukturella studier av makromolekyler på plats med cryo-elektron tomografi. Det presenterade protokollet innehåller riktlinjer för beredning av högkvalitativa lameller med hög reproducerbarhet för strukturell karakterisering av makromolekyler inuti Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Idag är cryo-elektrontomografi (cryo-ET) den enda tekniken som kan ge nära atomupplösning strukturella data om makromolekylära komplex på plats. På grund av den starka interaktionen mellan en elektron och materian är högupplösta cryo-ET-studier begränsade till exemplar med en tjocklek av mindre än 200 nm, vilket begränsar tillämpligheten av cryo-ET endast till perifera regioner i en cell. Ett komplext arbetsflöde som omfattar beredning av tunna cellulära tvärsnitt genom kryofokuserad jonstrålemikromachining (cryo-FIBM) introducerades under det senaste decenniet för att möjliggöra förvärv av cryo-ET-data från de större cellernas inre. Vi presenterar ett protokoll för beredning av cellulära lameller från ett prov vitrified genom dopp frysning med hjälp av Saccharomyces cerevisiae som ett prototypiskt exempel på en eukaryotic cell med bred användning i cellulär och molekylärbiologi forskning. Vi beskriver protokoll för vitrifiering av S. cerevisiae i isolerade fläckar av några celler eller en kontinuerlig monolayer av cellerna på ett TEM rutnät och ger ett protokoll för lamella beredning av cryo-FIB för dessa två prover.

Introduction

Den senaste tekniska utvecklingen och mjukvaruutvecklingen har gjort elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) av förrikade biologiska exemplar till en av de viktigaste teknikerna inom strukturbiologisk forskning under det senaste decenniet1,2. Beredningen av ett prov för kryo-EM består vanligtvis av applicering av ett renat protein eller ett komplex av protein med nukleinsyra på provbäraren (TEM-gallret), följt av avlägsnande av det mesta av vätskan med ett filterpapper, och doppa fryspunkten av nätet med det återstående tunna skiktet av ett prov i flytande etan eller propan3 . Provet är således fixerat i ett tunt skikt (vanligtvis <80 nm) av amorf buffert i helt hydratiserat tillstånd, vid nästan inhemska förhållanden och utan behov av kemisk fixering eller tungmetallkontrast. Avbildning av det strukturellt homogena provet i transmissionselektronmikroskopet resulterar sedan i data som kan användas för bestämning av makromolekylens tredimensionella struktur med nära atomupplösning med hjälp av ett enda partikelanalysprotokoll2. En sådan in vitro-struktur motsvarar makromolekylens representation under de förhållanden och den behandling som används under provberedningen. Även om de strukturer som bestäms under in vitro-förhållandena vanligtvis motsvarar makromolekylens fullt funktionella tillstånd, skulle förmågan att avbilda rumsliga relationer mellan olika makromolekyler inuti cellen ge ett ytterligare funktionellt sammanhang till strukturdata.

Cryo-elektrontomografi (cryo-ET) används för att rekonstruera 3D-volymer av pleomorfa objekt eller makromolekylära komplex på plats4,5. Fördelen med cryo-ET är att den tredimensionella informationen erhålls genom att avbilda en enda entitet. Den upplösning vid vilken enskilda makromolekylära komplex eller organeller observeras är dock mycket begränsad. Därför är medelvärdet av makromolekylerna (sub-tomogram genomsnitt, STA) med samma struktur från ett större antal tomograms nödvändigt för att nå 4-8 Å upplösningsmodeller från cryo-ET-data6,7. Det har nyligen visat sig att cryo-ET och STA också kan tillämpas för att bestämma högupplösta strukturer av makromolekylära maskiner som ribosomer i samband med cellmiljön7. Användningen av transmissionselektronmikroskopi begränsas dock av provexemplarets tjocklek. I allmänhet är detta inte ett problem för enpartikel cryo-EM där optimering av vitrifieringsförhållandena så småningom kan resultera i inbäddning av provet i ett tunt lager is. Å andra sidan är de flesta cellerna i själva verket inte elektron transparenta för 300 keV elektronstrålen. Den oelastiska genomsnittliga fria vägen i de förglasade biologiska exemplaren för de 300 keV-elektronerna är cirka 395 nm8, vilket innebär att cryo-ET-studier är begränsade till cellulär periferi för de flesta cellerna.

Olika tekniker utvecklades för att tunna ut provet till en tillräcklig tjocklek för cryo-ET. Cryo-ultramicrotomy använder mekanisk skivning av provet med en diamantkniv vid vätskekvävetemperaturen (-196 °C) för att ge 60-80 nm tjocka sektioner lämpliga för cryo-ET9,10,11. Flera avsnitt kan förberedas från en enda cell och dataanalysen kan så småningom producera 3D-strukturell information för större delen av cellen. Den mekaniska skivningen kan dock orsaka flera artefakter som böjda sektioner, sprickor eller provkomprimering, vilket kan påverka den resulterande strukturen och fördomen cryo-ET-data10,11,12. Cryo-fokuserad jonstrålemikromachining (cryo-FIBM) representerar ett alternativt tillvägagångssätt där en tunn cellulär sektion framställs genom gradvis ablation av provet med hjälp av en fokuserad stråle av Ga + joner (FIB) i en flerstegsprocess, vilket kan resultera i 80-300 nm tjockt cellulärt tvärsnitt (lamella)13,14,15 . I motsats till kryo-ultramicrotomy, endast en lamella är beredd från en enda cell, som representerar ~ 0,3-3% av dess volym, och mikromachining av flera celler är vanligtvis nödvändigt för att hitta en region av intresse för det frästa tvärsnittet. Dessutom är genomströmningen av hela arbetsflödet idag fortfarande ganska låg, ofta begränsad till 6-8 högkvalitativa lameller från en 8-timmars cryo-FIBM-session. Å andra sidan saknar cryo-FIBM-tvärsnitten några kompressionsartefakter och ger lämplig ingång för högupplöst cryo-ET. Dessutom är det inte nödvändigt att överföra lamellen till provbäraren för kryo-ET eftersom provet förvaras på TEM-nätet under hela lamellberedningsprocessen och samma rutnät därefter kan överföras till TEM. Vi förväntar oss att genomströmningen av cryo-FIBM kommer att förbättras avsevärt snart, främst från tillgång till programvara för oövervakad lamellfräsning16,17 och användning av FIB som arbetar enligt principen om laddningsparplasma, vilket kommer att ge snabbare materialablation.

Sackaromyces cerevisiae (jäst) är eukaryota celler av sfärisk form och diameter på ~2-5 μm. Tack vare sin storlek, tillgänglighet, genetik, generationstid och enkel manipulering studeras jästen i stor utsträckning som en eukaryota modellorganism i cellulär och molekylärbiologisk forskning som liknar Escherichia coli, som är väl studerad som en prokaryota modellorganism i bakteriologi. Jästen kan lätt odlas i suspension och en hög mängd celler genereras på kort tid (fördubblingstid 1 - 2 timmar). Ännu viktigare är att jäst delar en komplex intern cellulär struktur med djur- och växtceller samtidigt som den behåller ett litet genom som består av ett lågt innehåll av icke-kodande DNA. Strukturell karakterisering av jäst proteome från högupplösta in situ data kan således bidra till att ge en mekanistisk beskrivning för den omfattande mängden funktionella data som finns tillgängliga i litteraturen.

Häri tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för förvärv av in situ cryo-ET-data om jästprovet, som täcker alla steg från provodlingen ner till kryo-FIBM-lamellaberedningen och provöverföringen till TEM för kryo-ET-datainsamling.

Protocol

1. Odling och beredning av Saccharomyces cerevisiae celler för vitrifiering

  1. Förbered flytande tillväxtmedium för Saccharomyces cerevisiae.
    1. Autoklav en 500 mL glasflaska för beredning av tillväxtmedium.
    2. Väg 2,2 g jästextrakt (1,1%) och 4,4 g Peptone (2,2%) och blanda i 200 ml vatten.
    3. Sterilisera genom autoklavering i 15 min vid 121 °C.
    4. Väg 10 g glukospulver och blanda i 50 ml vatten för att få 20% glukoslösning. För lösningen genom ett filter på 0,2 μm och förvara den vid 4 °C.
  2. Förbered fast medium för Saccharomyces cerevisiae.
    1. Väg 4 g agarpulver och blanda med 200 ml tillväxtmedium.
    2. Sterilisera i en autoklav i 15 min vid 121 °C.
    3. Kyl mediet till 40-50 °C och tillsätt 20 ml 20% steril glukos (beredd i föregående steg). Häll ~20 ml av hela mediet i Petri-skålen och låt det stelna vid omgivningstemperatur.
    4. Linda in agarplattorna i parafilm för att skydda mot torkning och förvara vid 4 °C.
  3. Kultur Sackaromyces cerevisiae i suspension
    OBS: Protokollet är optimerat för beredning av ett prov för cryo-FIBM från en suspension av cellinjen Saccharomyces cerevisiae stam BY4741 [ATCC 4040002] eller liknande stammar.
    1. Autoklav en 50 ml Erlenmeyer (eller liknande) kolv.
    2. Arbeta i en huva eller laminär flödeslåda. Pipett 10 ml av tillväxtmediet till en steril 50 ml Erlenmeyerkolv.
    3. Komplettera mediet med 1 ml filtrerad 20% glukos. Välj en koloni jäst från en agarplatta med en steril engångsinokuleringsslinga (1-10 μL).
    4. Placera Erlenmeyerkolven i inkubatorn och kulturen vid 30 °C med omrörning (150–200 varv/min) tills exponentiell fas har uppnåtts (cirka 7 timmar).
      OBS: Vi har observerat att den exponentiella fasen uppnås efter ~15 h när kolonier plockas från agarplattor som har odlats vid omgivningstemperatur i 4 veckor. Se även Anmärkning nedan.
  4. Kultur Sackaromyces cerevisiae på en agarplatta från glycerolbuljong.
    1. Använd en ny agarplatta från 4 °C-förvaringen.
    2. Ta S. cerevisiae-beståndet från -80 °C djupfrys och placera det i ett frysställ för att undvika fullständig upptining av beståndet.
    3. Skrapa av och överför en liten kultur med en steril inokuleringsslinga (1-10 μL) till 50 μL tillväxtmedium. Blanda ordentligt.
    4. Överför hela volymen av blandad S. cerevisiae-kultur och sprid med en steril spridningspinne över agarplattans yta.
    5. Inkubera vid 30 °C i cirka 48 timmar tills kolonier med diametern 1,5–2 mm bildas.
      OBS: Det är lämpligt att odla kolonierna nyligen före experimentet. Kolonier äldre än 1 vecka kommer att kräva en längre period för odling i flytande medier för att nå den exponentiella tillväxtfasen.
  5. Kultur Sackaromyces cerevisiae på en agarplatta.
    1. Använd beredda agarplattor med odlade S. cerevisiae kolonier.
    2. Pipett 10 ml sterilt tillväxtmedium och 1 ml filtrerad 20% glukos till en 50 ml Erlenmeyerkolv.
    3. Välj en koloni av S. cerevisiae kultur med en steril inokuleringsslinga och blanda med ett tillväxtmedium i en kolv.
    4. Inkubera 50 minuter vid 30 °C med omrörning (150-200 varv/min).
    5. Späd suspensionskulturen tio gånger med tillväxtmediet och sprid 50 μL suspension på en agarplatta med en steril spridningspinne.
    6. Inkubera vid 30 °C i cirka 48 timmar tills 1,5-2 mm kolonier observeras.
    7. Linda in petriskålens kanter med parafilm för att förhindra att den torkar. Förvara i rumstemperatur och använd i högst 4 veckor.
  6. Förbered Saccharomyces cerevisiae för doppfrysning i cellkluster.
    1. Förbered S. cerevisiae cellkulturen enligt protokollet i avsnittet Odling av Saccharomyces cerevisiae i suspension (avsnitt 1.3) och inkubera ~7 h vid 30 °C med agitation (150-200 rpm).
    2. Mät OD för S. cerevisiae cell suspension kultur vid 600 nm med hjälp av en UV/Vis spektrofotometer.
    3. Koncentrera cellupphängningen till OD600 = 1.
  7. Förbered S. cerevisiae för dykfrysning i en cellmonoskikt.
    1. Förbered S. cerevisiae cellkultur enligt protokollet i avsnittet Odling av Saccharomyces cerevisiae suspension cellkultur och inkubera ~7 h vid 30 °C med agitation (150-200 rpm).
    2. Mät OD för S. cerevisiae cell suspension kultur vid 600 nm med hjälp av en UV/Vis spektrofotometer.
    3. Överför cellerna i medium till centrifugröret och snurra försiktigt i 2 minuter med en relativ centrifugalkraft (900 x g).
    4. Kassera mediet från cellpelleten genom pipetting.
    5. Tillsätt färskt medium till cellpelleten. Beräkna volymen av medium för att få en cellupphängning på OD600 som motsvarar 30 till 60.
    6. Tillsätt glycerol (50% stamlösning) till cellupphängningen till en slutlig koncentration på 5% strax före vitrifiering.
      OBS: Glycerol fungerar som ett skyddsmedel, vilket förbättrar isens kvalitet i regionerna mellan cellerna. Glycerol tillsätts till celler först strax före vitrifiering för att minimera dess upptag i cellen.

2. Vitrifiering av Saccharomyces cerevisiae exemplaret

  1. Glödurladdning TEM-galler med kolfilmsidan vänd uppåt i 30-45 s (tryck: 6-9 Pa, ström: 7 mA).
  2. Ställ in vitrifieringsroboten på följande parametrar: temperatur: 18 °C, luftfuktighet: 100%, fläcktid: 6 s, väntetid: 5 s, blottingcykel: 1x och fläckkraft: 5.
    OBS: Blot-kraft är ett instrumentspecifikt värde och optimala blotkraftvärden kan skilja sig åt mellan olika maskiner. Det optimala värdet för en viss kolv måste bekräftas experimentellt.
  3. Förbered flytande etan för vitrifiering.
  4. Montera den icke-absorberande ytdynan på blottingdynan som vetter mot provet. Använd filterpapperet för den andra blottingplattan.
  5. Välj det glödutloppade gallret med pincetten och montera pincetten på dykfrysningsinstrumentet.
  6. Applicera 3,5 μL S. cerevisiae suspension på kolsidan av nätet inuti kolvens klimatkammare. Blanda ordentligt före varje applikation på rutnätet.
  7. Doppa gallret i den flytande etanen.
  8. Överför gallret från flytande etan till LN2. Förvara galler med förstorade celler under LN2-förhållanden eller montera dem i TEM-gallerpatronen för laddning i FIB-SEM-mikroskopet.

3. Montering av TEM-galler i nätpatronen

Obs: Arbetsflödet som beskrivs här använder TEM-näten monterade i nätkassetten för att underlätta provhantering och överföring mellan SEM- och TEM-mikroskop. Patronenheten består av en C-ring, ett TEM-rutnät och en C-klippring. Andra alternativ finns tillgängliga när du arbetar med instrumentering från andra mikroskoptillverkare. Arbetsstationen för nätpatronenheten är fylld med LN2. LN2-nivån täcker gallerboxen med TEM-galler, men monteringen av TEM-näten i patronen utförs i LN2-ångor. Det rekommenderas starkt att bära en skyddande ansiktsmask eller sköld under vitrifieringsproceduren för att förhindra att kontaminering andas till provet. Arbeta inte med de verktyg som har ackumulerad isförorening.

  1. Sätt ihop arbetsstationen för nätpatronenheten och förbered torra verktyg för urklipp.
  2. Kyl ner monteringsarbetsstationen med LN2. Kyl urklippsverktygen till LN2-temperaturen.
  3. Placera en rutnätslåda med ett förfört prov i monteringsarbetsplatsen.
  4. Placera ett TEM-rutnät med provet med celler vända nedåt mot C-ringen och säkra med en C-klämma.
  5. Placera de urklippta patronerna i gallerboxen och stäng ordentligt.
  6. Förvara patroner i LN2 Dewar eller ladda dem i FIB-SEM-mikroskopet.

4. Lastning och manipulering av provet till FIB-SEM-mikroskopet

OBS: Instruktionerna skrevs för användning av dubbelstrålemikroskopet Versa 3D utrustad med beredningssystemet PP3010 cryo-FIB/SEM. Alternativa lösningar kan kräva olika specifika parametrar. Det allmänna konceptet för arbetsflödet bör dock fortfarande vara giltigt.

  1. Kyl ner mikroskopet till den flytande kvävetemperaturen.
    1. Pumpa mikroskopkammaren och förberedelsekammaren (om sådan finns) till ett högt vakuum innan nedkylningen börjar (< 4 x 10-4 Pa) för att förhindra föroreningstillväxt.
    2. Ställ in kvävegasflödet på 5 L/min för beredningskammaren, mikroskopsteget och mikroskopantikontaminatorn. Vänta tills alla komponenter når en temperatur på < -180 °C.
      OBS: Fib-SEM-mikroskopuppsättningen som används i denna studie använder kyld kvävegas för att kyla ner dess stadium och antikontaminator. Andra system kan använda en annan metod för stegkylning. Kammartrycket når ~3 x 10-5 Pa när scenen och antikontaminatorn är på -190 °C på instrumentet som används här. Tillväxttakten för kolväteföroreningsskiktet på lamellens yta med den experimentella inställning som används i denna studie är ~ 15 nm / timme.
  2. Ladda nätpatronen med provexemplaret i mikroskopet.
    1. Montera och kyl laststationen till LN2-temperaturen.
    2. Placera skytteln (provhållaren), gallerboxen med provexemplaret, gallerboxöppnaren och pincetten i den kylda laststationen.
    3. Överför försiktigt nätpatronen med provexemplaret uppåt i skytteln.
    4. Vänd skytteln inuti laststationen till lastläget.
    5. Ladda i mikroskopet.
  3. Täck provet med metallskyddande skikt som tillval.
    OBS: En stark laddningseffekt kan observeras vid avbildning av fruset hydratiserat biologiskt material SEM. Dessutom inducerar avbildning av biologiska prover med FIB (även vid låga strömmar) snabba provskador. Därför kan en extra beläggning av provet utföras inuti FIB-SEM-mikroskopet för att skydda provexemytan.
    1. Deponera skyddsskiktet med organometallisk platina genom gasinsprutningssystemet (GIS).
      1. Ställ in provet på eucentrisk höjd (tillfällighetspunkt för avbildning med elektroner och joner).
      2. Luta scenen tillbaka till 45° (provet lutade 90° i förhållande till elektronstrålen).
      3. Flytta scenen i z-axeln4 mm under eucentrisk höjd.
      4. Ställ in GIS-nålen på 26–30 °C.
      5. Deponering ~300-1000 nm av det organometalliska platinaskiktet till gallret med det biologiska provet (motsvarar 30–120 s av GIS-nedfallet).
        OBS: Vi applicerar vanligtvis GIS för 30 s för prover med små cellkluster och 45 s för prover med ett monolager av cellerna.
    2. Sputter täcker provytan med ett ledande metallskikt.
      1. Deponering ~10 nm av metallskiktet (Ir, Au, Pt) till gallret med ett biologiskt prov.
  4. Ställ in mikroskopparametrar för lamellberedningen
    1. För FIB, använd följande parametrar: hög spänning = 30 kV, ström = 10 pA (bildbehandling), 10 pA-3 nA (FIB-fräsning)
    2. För SEM, använd följande parametrar: hög spänning = 2–5 kV, dekorstorlek = 4,5, ström = 8–27 pA.
    3. Ställ in skanningsrotationen på 180° för båda balkarna.
    4. Ställ in scenlutningen: fräsvinkel 6-11° (motsvarar steglutning på 13°–18° för provskytteln med förlutning på 45° och FIB/SEM mikroskop med 52° vinkel mellan SEM och FIB-kolonnen).

5. Förberedelse av Saccharomyces cerevisiae lamella

  1. Kontrollera rutnätets kvalitet och välj ett lämpligt kluster av Saccharomyces cerevisiae.
    1. Kontrollera att TEM-nätet är ordentligt blottat från båda sidor utan extra vatten runt cellklustret eller på baksidan av gallret.
      OBS: För att kontrollera baksidan av rutnätet, rotera scenen till -10° och avbilda rutnätet med FIB.
    2. Välj de optimala cellkluster för lamellpreparat enligt följande rekommendationer.
      1. Placera cellkluster i rutnätscentret. Fräsområdet bör inte sträcka sig utanför torget med måtten 1100 x 1100 μm placerade i mitten av gallret (550 μm i varje riktning från rutnätets centrum).
      2. Placera cellkluster i den centrala delen av rutnätsramen utan överlappning till rutnätsfältet.
      3. Placera cellkluster i gallrets kvadrat med kompakt hålig kolfolie utan sprickor.
      4. Se till att klustret inte är omgivet av isförorening.
  2. Välj den optimala fräspositionen i Saccharomyces cerevisiae monoskikt.
    1. Se till att rutnätsstängerna som omger cellmonageraren på den markerade rutnätstorget är synliga.
    2. Välj den optimala positionen i cellulära monoskiktet enligt följande rekommendationer. De utvalda fräsarea områdena bör uppfylla följande kriterier:
      1. Ha den region som är av intresse i rutnätscentret. Fräsområdet bör inte sträcka sig utanför kvadraten av måtten 1100 x 1100 μm placerad i rutnätscentret (550 μm i varje riktning från mitten av gallret).
      2. Ha den region som är av intresse i den centrala delen av rutnätstorget utan överlappning med rutnätsfältet.
      3. Omge inte cellmonageraren med isförorening.
  3. Förbered S. cerevisiae lamella med cryo-FIB.
    OBS: Fräsmönstret genereras och centrerats i förhållande till intresseområdet. Cryo-FIBM utförs sekventiellt med flera frässteg som utförs vid olika FIB-inställningar. Lamellen med ungefär 2 μm tjocklek fräss initialt med hög ström (0,3–3 nA). Lamellen tunnas sedan gradvis ut till 500 nm. Finfräsningssteget vid låga strömmar (10-30 pA) används för att slutföra lamellen till ~100-200 nm tjocklek.
    1. Ställ in en intresseregion (ROI) på eucentrisk höjd och spara denna position.
      OBS: Den sammanträffande punkten måste bestämmas och sparas för varje position separat. Den eucentriska höjden ställs in genom att luta scenen till 0° och centrera på ROI genom att flytta scenen i x- och y-riktningen. Scenen lutas sedan till 25° och ROI förs tillbaka till mitten av det skannade området genom att ändra scenen z-axelposition. Slutligen lutas scenen tillbaka till 13°–18° för fräsning.
    2. Definiera ett rektangulärt fräsmönster ovanför AVKASTNINGEN med en genomsökningsriktning överifrån och ned.
    3. Definiera ett rektangulärt fräsmönster under AVKASTNINGEN med en skanningsriktning nedifrån och upp.
    4. Definiera det inaktiva rektangulära fräsmönstret som täcker det område som är av intresse för en grov uppskattning av lamelltjockleken. Detta mönster fräss inte under lamellaberedning.
    5. Markera alla mönster och ställ in lamellbredden (x dimension). Fräsmönstrets bredd får inte överstiga 2/3 av klustrets bredd. Detta motsvarar i de flesta fall 8–15 μm.
    6. Ange parametrar för grova frässteg
      1. FIB ström: 0,3–3,0 nA ; slutlig lamelltjocklek: 1,5–2 μm; BREDD PÅ FIBM-området: 8-12 um; scenlutning: 13-17°; Varaktighet: 8 minuter. aktiva fräsmönster: övre och nedre.
      2. FIB aktuell: 0,3–1,0 nA; Slutlig lamelltjocklek: 1 μm; BREDD PÅ FIBM-området: 7,5-11,5 μm; scenlutning: 13-17°; Varaktighet: 8 minuter. aktiva fräsmönster: övre och nedre.
      3. FIB aktuell: 100–300 pA; Slutlig lamelltjocklek: 0,5 μm; BREDD PÅ FIBM-området: 7,5-11,5 μm; scenlutning: 13-17°; Varaktighet: 8 minuter. aktiva fräsmönster: övre och nedre.
      4. FIB aktuell: 30–100 pA; Slutlig lamelltjocklek: 0,3 μm; BREDD PÅ FIBM-området: 7,5-11,5 μm; scenlutning: 13-17°; Varaktighet: 8 minuter. aktiva fräsmönster: övre och nedre.
    7. Ange parametrar för finfräsningssteget:
      1. FIB-ström: 10–30 pA; Slutlig lamelltjocklek: <0,2 um; BREDD PÅ FIBM-området: 7-11 μm; scenlutning: 13-17° (+1°); Varaktighet: 12 minuter. aktiva fräsmönster: övre.
        OBS: De grova frässtegen (5.3.6) utförs sekventiellt för varje lamell. Däremot följer finfräsningssteget (5.3.7) inte direkt grovfräsningen, men fina frässteg utförs sekventiellt för alla lameller i slutet av sessionen för att minimera kolväteföroreningen på lamellytan. En extra +1° steglutning används under finfräsningssteg för att öka lamelltjocklekens enhetlighet över dess längd.

6. Överföring av Saccharomyces cerevisiae lamella till cryo-TEM

  1. Förbered en ordentligt torkad Dewar och fyll den med LN2.
  2. Lossa proverna med lameller från FIB/SEM-mikroskopet under kryoförhållanden, överför dem till en nätbox och förvara dem i en LN2-lagring Dewar för långtidslagring. Alternativt kan du ladda gallret direkt i cryo-TEM.
  3. Korrekt orientering av lamellen i förhållande till cryo-TEM-scenens lutningsaxel är viktig (se medföljande video kl. 8:10 för mer information). Se till att fräsriktningen för beredda lameller är vinkelrät mot cryo-TEM-scenens lutningsaxel.
  4. Luta kryo-TEM-stadiet före lutningen för att kompensera för lamelllutningen i förhållande till gallerplanet och samla in tilt-serien med dossymmetriskt schema19.
    OBS: Förlutningsskalan (vanligtvis 6–8°) bestäms av vinkeln mellan TEM-rutnätsplanet och FIB-riktningen under mikromachining. Lamellens framkantsposition i bilden i cryo-TEM kan användas för att bestämma tecknet på förlutningsvinkeln. För det måste känslan av mikroskopstegsrotationen vara känd. I vår experimentella installation motsvarar positionen för lamellens framkant på höger sida av bilden som är tagen i nanoprobe SA-läge negativ förlutning.

Representative Results

Saccharomyces cerevisiae kultur skördades i mitten av exponentiell tillväxt fas. Vi förberedde två typer av exemplar där cellerna antingen distribuerades som små kluster av flera celler över ytan av TEM-rutnätet(figur 1A,C)eller bildade ett kontinuerligt monoskikt över enskilda rutnätsrutor i TEM-rutnätet(figur 1B,D). Den diskriminerande faktorn för beredning av provet med antingen distinkta cell holmar eller cellulära monoskikt är koncentrationen av cellkulturen som tillämpas på TEM-rutnätet. Den skördade cell kultur var koncentrerad till OD600 = 1,0 för det tidigare fallet, eller till OD600 = 30 till 60 för det senare fallet, respektive. Provet för beredning av cellulära monolayer kompletterades ytterligare med 5% v/v glycerol före vitrification. Glycerol är avgörande för vitrifieringen av buffertlösningen, som fyller utrymmet mellan cellerna (figur 2) eftersom reflektionerna från den kristallina bufferten kan vara skadliga för korrekt positionsspårning och fokusering under cryo-ET-datainsamling.

Dessutom var jäst suspensionskulturen blottad mot det icke-absorberande materialet som PTFE blotting pad eller den anpassade 3D-tryckta dynan av FlexFill 98A-material. Blotting-papperet placerades endast på baksidan av gallret med avseende på provappliceringen (back-blotting). Back-blotting-strategin rekommenderas för suspensionskulturen att frysa eftersom blotting med filterpapperet från båda sidor resulterar i vidhäftning av cellerna till blotting-papperet (Figur 1E).

Protokollet som beskrivs här använder TEM-galler klippta i rutnätspatronen, som utgör stabilt stöd för rutnätet och underlättar provhantering av provet efter vitrifieringen. Detta kräver att andra provhållare och skyttlar i FIB/SEM- och TEM-mikroskop kan acceptera en sådan nätpatron.

Vid överföring av provet till FIB/SEM-mikroskopet belades provet först med ett 0,3–1,0 μm lager metylcyklopentadienyl platina med hjälp av mikroskopgasinsprutningssystemet (GIS). Ett extra lager av det oorganiska iridium sputtered på provytan för att härda GIS skiktet och göra ytan ledande. Lamellerna maldes i flera steg (figur 3) där I) fräsströmmen, II) lamellbredden och III) avståndet mellan fräsområdet ovanför och under proverna minskades stegvis. Det slutliga frässteget ("polering") utfördes vid låg ström (10-30 pA) endast från lamellens övre sida och med provet lutat med ytterligare 1° mot Ga+-balken. Utnyttjande av det beskrivna protokollet har i genomsnitt resulterat i 8-10 lameller beredda på två TEM-rutnät inom en 6-8 timmars session.

TEM-näten med lamellerna överfördes därefter till ett transmissionselektronmikroskop. Lamellerna screenades först och endast de som visade minimal gardinning (artefakter som härrör från ojämn fräsning över lamellytan), låg ytkontamineringsnivå och god cellulär kontrast (vanligtvis observerad för lameller med <200 nm tjocklek) valdes för förvärv av cryo-ET-data. Dessutom kasserades lameller som innehåller sprickor över hela längden från datainsamlingen. I allmänhet var cirka 50% av de lameller som överfördes till TEM lämpliga för datainsamling. Tilt-serien samlades in på den direkta elektrondetektorn efter GIF K2 med den energivalande slitsen inställd på 20 eV. Datainsamlingen utfördes i SerialEM programvara18 och tilt serien samlades in med hjälp av en dos symmetriskschema 19 med lutning intervallet ±60° och ökning av 3°. Data förvärvades vid förstoringen motsvarande pixelstorleken 3,47 A/px. Den totala dosen på 65 e/Å2 fördelades jämnt över de enskilda delramarna. Tiltbilderna samlades in som en uppsättning av tre ramar, som därefter korrigerades för rörelse- och strålningsskador under datainsamling med MotionCor220-programmet. Parametrar för kontrastöverföringsfunktionen uppskattades med Ctffind421. Tiltserien bearbetades i eTomo18. Korrigerings spårnings rutinen användes för att justera bilderna. Tomogrammet rekonstruerades med hjälp av en viktad bakåtprojektionsalgoritm efter 2x binning av bilderna och filtrerades därefter med SIRT-liknande filter (inställt på 8 iterationer) i IMOD18. Tomogramsegmenteringen utfördes manuellt i Amira programvara22. De rekonstruerade tomogrammen ger en högupplöst representation av jästens cellulära interiör och gör det möjligt för oss att observera organeller som vacuoles eller mitokondrier på en hög detaljnivå eller studera makromolekylära komplex som mikrotubuler eller nukleära porkomplex på plats och under nästan inhemska förhållanden ( figur4).

Figure 1
Bild 1: FIB- och SEM-bilder av vitrified S. cerevisiae
FIB (A) och SEM (C) bilder av de små jästklustren förstorade på TEM-nätet. FIB (B) och SEM (D) bilder av jästen som bildar ett kontinuerligt monoskikt på gallrets yta. Provet var belagt med GIS och Irridium lager före imaging. Skalstängerna i panelerna A-B motsvarar 10 μm. Jästprovet är blottat mot icke-absorberande material som PTFE eller FlexFill 98A (grön) och med blottingpapperet placerat från baksidan av gallret (vitt, E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: S. cerevisiae lamellae
En TEM-bild av en lamell mikromachined från provet med kontinuerlig monolayer jäst över gallret yta. De reflektioner som observerades mellan cellerna innehöll felaktigt förstorat medium/buffert (A, markerat med röda cirklar). En TEM-bild av lamell som genereras på jästen förstoras till ett kontinuerligt monoskikt med tillsats av 5% glycerol i mediet/bufferten (B). Skalstången motsvarar 2 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Arbetsflödet Cryo-FIBM
Schematisk skildring av lamellfräsningsprocessen. De första grova frässtegen utförs vid höga FIB-strömmar från båda sidor av det trevande lamellläget (markerat i grönt) medan det slutliga poleringssteget endast utförs från ovansidan och vid låg FIB-ström (markerad i orange, se medföljande video vid 6:33). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Jästorganeller och makromolekylära komplex avbildade av kryo-ET
Skivor av de rekonstruerade tomogrammen som visar en vacuole (A, skalstång: 200 nm), ribosomer (B, skalstång: 200 nm), en parakryltalinkärna av peroxisom(C,skalstång: 100 nm), mikrotubule (vit pil) i närheten av oidentifierad fibrös struktur (svart pil, D,skalstång: 100 nm), detaljer om flera mikrotubuler (E, skalstång: 50 nm), ett kärnmembran med porer som indikeras av pilar (F, skalstång 200nm), mitokondrion (G,H, skalstång: 100 nm, pilarna indikerar individuell cristae), en bunt oidentifierade filamentösa strukturer (I, skalstång: 100 nm). Panelerna B, C, D, E, G innehåller en del av tomogram som framställs av små kluster av celler, medan de delar av tomogram som samlats in på lameller från ett monoskikt av cellerna visas i panelerna A, F, H, I. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Beredningen av cellulära prover för cryo-ET är ett komplext arbetsflöde som kräver användning av flera avancerade instrument. Exempel kvaliteten kan äventyras under varje förberedelse steg som påverkar genom flödet för hela protokollet. Dessutom utgör behovet av provöverföring mellan enskilda instrument ytterligare en risk för kontaminering av prover eller avvitrifiering. Därför är optimering av enskilda steg i arbetsflödet för prov förberedelse av stor betydelse för att öka genomströmningen och reproducerbarheten för arbetsflödet för lamella förberedelse. Protokollet som presenteras här beskriver optimerade beredningen av Saccharomyces cerevisiae för strukturell karakterisering av makromolekylära komplex på plats av cryo-ET.

Protokollet beskriver beredningen av två typer av jästprover som huvudsakligen skiljer sig åt i cellernas koncentration på TEM-nätet. Båda jästproverna gav högkvalitativa lameller för kryo-ET och val av provtyp kan göras i enlighet med målen för den specifika studien. Jästen bildar isolerade kluster av få celler slumpmässigt utspridda över rutnätsytan i det första fallet, medan det finns ett kontinuerligt monoskikt av celler på TEM-rutnätets yta för den andra provtypen. Den förstnämnda är lämplig för snabb lamellberedning tack vare den lilla volymen av materialet som måste fräsas bort. Den slutliga lamellen är ganska kort och innehåller därför endast 2-4 cellulära tvärsnitt. De områden som lämpar sig för provberedning är slumpmässigt fördelade över rutnätsytan, inklusive rutnätsrutorna, vilket delvis kan begränsa automatiseringen av arbetsflödet för lamellaberedning. Den senare typen av provexemplar kräver användning av större strömmar under den inledande fräsfasen för att behålla den totala frästiden. Dessutom är denna typ av prov mer benägna att artefakter som härrör från ojämn fräsning (ridå). Därför sputteras GIS på provytan under en 50% längre period än i fallet med provet med små cellulära kluster för att bilda ett tjockare skyddsskikt. Därefter sputteras provet med ytterligare ett lager Iridium (alternativt platina eller guld) för att härda GIS-skiktet, göra det styvare och öka provytans ledningsförmåga. FIBM av ytterligare områden på varje sida av lamellen (~ 2-5 μm från lamellkanten) under det första steget i den grova lamellfräsningen befanns fördelaktigt för att minska antalet brutna lameller troligen på grund av minskad spänning i det slutliga tvärsnittet23. Den slutliga lamellen är lång och innehåller ~ 10 cellulära tvärsnitt, vilket ökar antalet regioner som är lämpliga för cryo-ET. Felaktig vitrifiering av mediet eller bufferten mellan cellerna kan lätt dämpas genom tillsats av kryoskyddsmedlet till buffertlösningen (5% glycerol som används i denna studie). Eftersom de flesta av rutorna är lämpliga för lamellaberedning är provet med celler organiserade i ett kontinuerligt monoskikt väl lämpat för oövervakad lamellberedning.

En annan viktig aspekt i lamellaberedningsarbetsflödet är överföringen till transmissionselektronmikroskopet och korrekt placering av lamellen till mikroskopstegets lutningsaxel. Optimalt är lamellens huvudaxel vinkelrät mot mikroskopets lutningsaxel som ger spårning och fokusering på höjden av det avbildade området och förhindrar att lamellkanterna skyddar synfältet i höga lutningsvinklar. Vid insamling av cryo-ET-data med dossymmetriskt schemaska 18 provet först roteras i mikroskopet för att kompensera för lamellens lutning med avseende på gallerplanet.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansierat av Horisont 2020-programmet i Europeiska kommissionen, och CIISB:s forskningsinfrastruktur, ett Instruct-ERIC Centre (LM2018127). Vi erkänner stödet från Thermo Fisher Scientific Brno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Himedia MB053
Glucose PENTA 12020-31000
Glycerol Merck G5516-1L
ethane Messer 1007
LN2 Lineq LN2-1L
Peptone Merck P5905-1KG
Saccharomyces cerevisiae ATCC 201388 strain BY4741
Tweezers Dumont T539
Yeast extract Duchefa Biochemie Y1333.1000
Disposable
Blotting papers Ted Pella 47000-10
C-clip ThermoScientific 9432 909 97551
C-clip ring ThermoScientific 9432 909 97561
Spreading sticks Merck Z376779-1PAK
Sterile inoculation loops BRAND BR452201-1000EA
Sterile plastic Petri dishes Sigma SIAL0166
TEM grids Quantifoil 4420G-XA
Equipment
Autoclave Systec 101291545
balances BEL M124A
Cryo-FIB/SEM microscope ThermoScientific 1006123
Cryo-TEM microscope ThermoScientific 9432 057 03301
Laminar flow box Telstar AH5
Plasma cleaner Gatan 955.82001
Shaking incubator New Brunswick M1282-0002
UV/VIS spectrophotometer WPA S800
Vitrification robot ThermoScientific 9432 053 50621

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMullan, G., Faruqi, A., Clare, D., Henderson, R. Comparison of optimal performance at 300keV of three direct electron detectors for use in low dose electron microscopy. Ultramicroscopy. 147, 156-163 (2014).
  2. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, (2018).
  3. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124, 3-4 (1981).
  4. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
  5. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  6. Schur, F. K. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  7. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369, 554-557 (2020).
  8. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204, 38-44 (2018).
  9. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P. O., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biology. 148, 131-135 (2004).
  10. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150, 109-121 (2005).
  11. Pierson, J., et al. Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box. Journal of Structural Biology. 169, 219-225 (2010).
  12. Dubochet, J., et al. How to "read" a vitreous section. Methods in Cell Biology. 79, 385-406 (2007).
  13. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4449-4454 (2012).
  14. Schaffer, M., et al. Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation for Imaging Vitreous Cells by Cryo-electron Tomography. Bio-protocol. 5, (2015).
  15. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  16. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural Biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  17. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-eletron tomography. eLife. e52286, (2020).
  18. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  19. Hagen, W. J., Wan, W., Briggs, J. A. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197, 191-198 (2017).
  20. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  21. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).
  22. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. , 749-767 (2005).
  23. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208, 107389 (2019).

Tags

Biokemi nummer 177
Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining <em>av Saccharomyces cerevisiae</em> för Cryo-Electron Tomography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravcová, J., Pinkas, M.,… More

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (177), e62351, doi:10.3791/62351 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter