Summary
En borger videnskab projekt var designet til at rekruttere San Diego beboere til at indsamle miljøprøver for SARS-CoV-2. Der blev oprettet en flersproget webbaseret platform til indsendelse af data ved hjælp af en brugervenlig grænseflade til mobilenheder. Et laboratorieinformationsstyringssystem lettede indsamlingen af tusindvis af geografisk forskelligartede prøver med sporing af resultater i realtid.
Abstract
For at kontrollere overførsel af alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) under den globale pandemi i 2020 implementerede de fleste lande strategier baseret på direkte menneskelig testning, ansigtsbeklædning og overfladedesinficering. Under forudsætning af, at hovedtransmissionsvejen omfatter aerosoler og luftvejsdråber, har bestræbelserne på at detektere SARS-CoV-2 hos fomiter fokuseret på steder, der mistænkes for høj prævalens (f.eks. hospitalsafdelinger, krydstogtskibe og massetransportsystemer). For at undersøge tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 på overflader i bymiljøet, der sjældent rengøres og sjældent desinficeres, blev 350 borgere hyret fra det større San Diego County. I alt indsamlede disse borgerforskere 4.080 prøver. En online platform blev udviklet til at overvåge levering og afhentning af prøvetagningssæt samt til at indsamle prøvedata. Prøvetagningssættene blev for det meste bygget af forsyninger, der var tilgængelige i pandemisk stressede butikker. Prøver blev behandlet ved hjælp af reagenser, der var lette at få adgang til på trods af den tilbagevendende forsyningsmangel. De anvendte metoder var meget følsomme og modstandsdygtige over for hæmmere, der almindeligvis findes i miljøprøver. De foreslåede eksperimentelle design- og behandlingsmetoder havde succes med at engagere adskillige borgerforskere, der effektivt indsamlede prøver fra forskellige overfladearealer. De arbejdsgange og metoder, der er beskrevet her, er relevante for at undersøge bymiljøet for andre vira, som er af folkesundhedsmæssig interesse og udgør en trussel for fremtidige pandemier.
Introduction
SARS-CoV-2 menes hovedsagelig at blive overført via indånding af forurenede aerosoler og dråber fra direkte kontakt med inficerede personer1,2,3,4. I de indledende faser af den globale COVID-19-pandemi fokuserede bestræbelserne på at kontrollere transmissionen af SARS-CoV-2 imidlertid stærkt på desinfektion af overflader, håndvask og desinficering. Ved udgangen af 2020 anså transmissionsretningslinjer fra Verdenssundhedsorganisationen (WHO)5 og de amerikanske centre for sygdomskontrol og forebyggelse (CDC)6 luftbåren transmission for en fare hovedsageligt, når de var i tæt kontakt (<2 m) med en inficeret person eller i nærværelse af aerosolgenererende medicinske procedurer. Selvforgiftning efter kontakt med forurenede overflader eller indånding af aerosoliserede fomites er endnu ikke udelukket som en overførselsvej for SARS-CoV-2.
Covid-19-tilfælde er blevet rapporteret , hvor luftbåren transmission forekommer usandsynlig7,8. SARS-CoV-2 virions forbliver infektiøse på kobber i op til 8 timer, på pap og rustfrit stål i op til 24 timer og på plast i op til 48 timer9. I krydstogtskibskabiner blev SARS-CoV-2 RNA opdaget 17 dage efter, at passagererne var afgået7. Luft - og overfladeprøver fra hospitaler og massetransitsystemer er testet positive for SARS-CoV-2 og andre coronavirus8,10,11,12,13,14. En undersøgelse udført på den ydre emballage af Halloween slik håndteres af asymptomatiske og moderat / mildt symptomatisk COVID-19 patienter, konkluderede, at kombinationen af håndvask af håndtereren og vask af slik med håndsæbe reduceret SARS-CoV-2 RNA til undertærskelværdierne 15.
Flere metoder til SARS-CoV-2 diagnostik er blevet offentliggjort baseret på real-time reverse-transskription polymerase kædereaktion (RT-qPCR)16,17, reverse-transskription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP)11,18,19,20,21, og CRISPR-Cas teknologier18,19,22,23. De fleste kræver RNA-ekstraktionssæt, der ofte er en mangelvare i perioder med betydelig global efterspørgsel, og meget få er blevet brugt til miljøscreening af virussen24. Det er påvist, at detektionen af SARS-CoV-2 RNA ved hjælp af RT-LAMP er over 83 % konkordans til at bruge RT-qPCR. Desuden resulterede RT-LAMP i en reduktion på 25 % i de ufyldestgørende resultater sammenlignet med RT-qPCR15.
RT-LAMP er en simpel teknik, der bruger en omvendt transcriptase til at syntetisere cDNA fra en RNA-skabelon25, efterfulgt af en DNA-polymerase med stærk strandforskydningsaktivitet, der syntetiserer DNA ved konstant temperatur (dvs. isotermisk forstærkning)26. Højere specificitet af viral genomdetektering opnås ved at bruge fire eller seks primere, der genkender seks eller otte regioner i mål-DNA'et. Forstærkning er indledt fra en intern primer og giver en semi-dobbelt-strandede DNA-struktur. Den ledende streng forstærkes derefter af en ydre primer. Disse forstærkninger gentages for de omvendte primere. Interne og ydre primere i begge ender har et internt omvendt selv komplementært sted , der danner en løkke i forstærkningsproduktet26,27. I isotermisk strengforskydning genererer asynkron DNA-syntese store mængder forstærket produkt, hvor kontinuerlig polymerisering forstærker signalet på så få som 10 kopier pr. reaktion11,20,28. Den colorimetric RT-LAMP mix er svagt buffered og bruger phenol rød som en pH-indikator. Da polymerase indeholder et nukleotid, frigiver det en proton, og nok protoner vil ændre opløsningens pH-kode såvel som dens farve fra pink til gul11,20,28,29.
RT-LAMP blev udviklet til påvisning af myggebårne sygdomme i perifere sundhedsfaciliteter, der mangler fuldt udstyredelaboratorier 25 og til hurtig påvisning af andre RNA-vira som human immundefektvirus30. De mest sårbare befolkningsgrupper i epidemiudbrud — i henhold til WHO's definition — mangler ofte tilstrækkelige økonomiske ressourcer og det rette udstyr til at udføre detektion (FN's globale folkesundhedsdagsorden). I den nuværende SARS-CoV-2-pandemi har forsyninger som svaberprøver af medicinsk kvalitet og reagenser til RNA-ekstraktionssæt ikke været i stand til at imødekomme den globale efterspørgsel, især i ikke-fremstillingslande. Den foreslåede protokol anvendte en guanidiniumthocyanat (GITC)-baseret rå RNA-ekstraktion, som effektivt bevarede RNA'et på en koldkædet uafhængig måde og reducerede persistensen af hæmmere fra prøven betydeligt. Desuden er GITC-chloroformekstraktionsprotokollen baseret på adskillelsen af RNA fra DNA og proteiner efterfulgt af den respektive nedbør, hvilket muliggør genvinding af det meste af det genetiske materiale. Disse fordele opvejer de potentielle farer for borgerforskere, der håndterer kemikaliet, hvis der træffes foranstaltninger til at informere dem på passende vis om risiciene.
Den foreslåede arbejdsgang bruger materialer og reagenser, der er til generel brug. Det kræver udstyr, der er tilgængeligt i grundlæggende, ofte landlige, laboratorieindstillinger. Disse metoder er billige, meget modstandsdygtige over for hæmmere, der ofte findes i miljøprøver eller prøver, der ikke kan behandles med ekstraktionssæt, og eliminerer behovet for en højpræcisions termocykel. Denne undersøgelse præsenterer en rørledning til prøveudtagning og påvisning af SARS-CoV-2 fra miljøreservoirer på almindeligt berørte og sjældent desinficerede overflader af husstande og bymiljøet.
Protocol
Se materialeoversigten for at få en detaljeret liste over reagenser og forsyninger, herunder katalognumre, producent og tilsvarende omkostninger.
1. Udtagning af stikprøver i bymiljøet
- Borgerforsker opsøgende arbejde
- Rekruttér borgerforskere ved hjælp af en direkte og klar opfordring til handling, der frigives via lokale og sociale medier. Opret et håndtag til sociale medier (f.eks. #swab4corona) for at forbinde emnet på tværs af indhold på sociale medier.
- Opret en e-mail-konto til direkte kommunikation mellem laboratorieteamet og hver borgerforsker, der administreres af en person, der taler de vigtigste sprog i interesseregionen (f.eks. spansk og engelsk for San Diego County).
- Opbyg en sikker webbaseret prøvestyringsplatform (SMP), der skal fungere som en database, et LIMS (Laboratory Information Management System), og for at kommunikere med borgerforskere.
BEMÆRK: SMP giver en central placering, hvor brugerne anmoder om et sæt, får adgang til eksempelindsamlingsprotokoller, indsender eksempelmetadata og anmoder om afhentning af fuldførte prøvesæt. - Opret et link til SMP (f.eks. https://demo.covidsample.org/) (figur 1) for enkeltpersoner, der ansøger om at deltage i miljøprøvetagningsindsatsen ved at besvare biosikkerhedsrelaterede spørgsmål, der er specificeret i en onlineformular.
- Sikker adgang til SMP ved hjælp af en authentication application programming interface, der er lettet af en udbyder af cloudcomputertjenester. Giv godkendte brugere adgang til SMP.
BEMÆRK: Se litteraturen for at få en beskrivelse af OAuth 2.0-protokol31 til godkendelse og godkendelse. Det giver en gnidningsløs sign-in proces for borger videnskabsmand frivillige. Det giver også brugerne mulighed for at logge på med en eksisterende konto, hvilket eliminerer behovet for at oprette en brugerdefineret logonløsning og administrere brugerlegitimationsoplysninger, hvilket sparer en betydelig mængde tid og tilskynder til deltagelse. Ifølge nylige rapporter har den gratis e-mail-tjeneste, der er tilgængelig for den valgte cloud-computertjenesteudbyder, ca. 1,5 milliarder månedlige aktive e-mail-brugere; at kræve en e-mail-konto fra denne tjenesteudbyder for deltagelse betragtes ikke som en afskrækkende faktor. - Forklar formålet med undersøgelsen og biosikkerhed overvejelser til borgerne forskere på SMP, før de anmoder om deres første kit. Giv et flersproget plugin for at muliggøre navigation på et af de sprog, der er tilgængelige fra en flersproget oversættelsestjeneste til neurale maskiner, der er lettet af en cloud-computerudbyder.
- I afsnittet om grafiske og audiovisuelle prøver skal du medtage grafiske og audiovisuelle protokoller på engelsk og spansk.
- Tildel et entydigt id til hvert sæt, og design brugergrænsefladen for at bruge knapper, der er knyttet til eksempel-id'et, for at strømline dataindtastningsprocessen (Figur 1A).
- Brug en planlægningssoftware til leveringsruten sammen med en applikation på en mobilenhed, der skal bruges af chauffører til at optimere leverings-/afhentningsruter, og giv borgerne besked om nøjagtige anslåede ankomsttider.
- Byg LIMS-platformen på en PHP-webtjenestestak, og host den på en kommerciel hostingplatform (foreslået operativsystem, webserversoftware og databasesoftware er angivet i materialeoversigten).
- Giv en sikker webbaseret programgrænseflade, der gør det muligt for laboratoriemedarbejdere at administrere data hurtigt og nemt i LIMS. Levere datavisualisering ved hjælp af en datadiagramprogramprogrammeringsgrænseflade, der er lettet af en udbyder af cloudcomputertjenester.
- Visualiser geospatiale data ved hjælp af en geospatial programmeringsgrænseflade, der er lettet af en cloudcomputertjenesteudbyder. Lagre de data, der indsendes til LIMS gennem SMP for at lette (1) centraliseret lagring af projektdata; 2) sporing af arbejdsgange for stikprøver/databehandling og (3) forvaltning af logistikken i distribution af prøvesæt til borgerforskere.
- Sikre indsendte metadata ved hjælp af bedste fremgangsmåder (f.eks. https://demo.covidsample.org/).
- Forudindlæsningsoplysninger som eksempelsæt-id, eksempel-id, GPS-koordinater (Global Positioning System) (automatisk indsamlet fra et billede af webstedet) for at muliggøre overholdelse af datatyper og minimere brugerens indsendelse af fejlagtige eller manglende data (Figur 1B). Medtag følgende felter, der skal udfyldes manuelt og hurtigt (<1 min.), der er udfyldt af borgerforskeren: dato og klokkeslæt for indsamlingen, en kort beskrivelse af placeringen og et billede af prøveudtagningsstedet.
- Desinficer alle overførte data, og valider for datatype. Valider f.eks. billeddata, der er overført af brugerne, for at vælge .jpg filer, omdøb dem med eksempel-id for hurtig tilknytning til eksemplet, og gem overførte billeder på en separat sikker placering, der ikke er tilgængelig for brugerne.
- Aktivér muligheden for at anmode om levering og afhentning af pakke, når alle prøver (16) er afsluttet. Derudover skal du aktivere muligheden for at anmode om et nyt sæt, der skal leveres ved afhentning af det forrige(Figur 1A).
BEMÆRK: For frivillige, der foretrækker en ikke-webbaseret platform og for dem, der er bekymrede for at afsløre deres GPS-placering (f.eks. medlemmer af det berørte samfund om deres migrationsstatus), kan kits leveres på et aftalt mødested, og frivillige bliver bedt om at registrere en skriftlig version af dataindsamlingen. For kommunikation mellem laboratoriet og hver borger videnskabsmand, har en tosproget medlem af projektet til rådighed for telefonopkald og tekster.
- Vatpind til Corona
- Identificer et epidemiologisk relevant tidsvindue for prøveudtagningsindsatsen.
- Byg et sæt, der indeholder alle prøvetagningsforsyninger, herunder de nødvendige personlige værnemidler (dvs. maske, handsker), en prøveudtagningsprotokol og biosikkerhedsrelevante oplysninger (figur 2). Forudetiker hvert rør med den tildelte entydige identifikator (Eksempel-id).
- Vatpind sjældent desinficeret overflader, der udsættes for aerosoliserede fomites i husholdninger og bymiljøet.
- Bær den medfølgende maske offentligt og et nyt par handsker til indsamling af hver prøve for at undgå krydskontaminering. Når prøveudtagningen er afsluttet, skal du bruge den medfølgende håndsprit.
- Våd en 1 cm2 polyesterabsorberende vatpind (f.eks. moppepuder) med et vaskemiddel (f.eks. 0,5% natrium dodecyl sulfat (SDS)) for at inaktivere virussen ved at forstyrre dens kuvert og stabilisere det nøgne RNA ved at fremkalde udfoldelse af RNases32.
- Svaber en overflade på 10 cm2. Med hjælp fra en tandstikker nedsænkes hver prøvepind fuldstændigt i det tilsvarende formærkede rør, der indeholder 200 μL guanidiniumthocyanatopløsning (GITC). Rør opbevares ved 4 °C, indtil de transporteres til laboratoriet. Når prøverne ankommer til laboratoriet, opbevares de ved -80 °C.
BEMÆRK: GITC er et giftigt irritationsmokrat; undgå kontakt med huden. GITC løsning er enkel at forberede fra fælles laboratoriekemikalier, for opskriften se33,34. Det inaktiverer virussen, stabiliserer RNA ved denaturering af RNases34,35,36og stabiliserer prøver ved stuetemperatur. Sættet indeholder imidlertid isposer til at holde prøverne kolde uden at skulle bruge husholdningskøleskabe til opbevaring.
2. SARS-CoV-2 detektion
- Total RNA-isolation
- Desinficere overflader, udstyr og pipetter med en opløsning på 2 mM kobbersulfat og 3% hydrogenperoxid; efterfulgt af en opløsning på 10% blegemiddel, 90 mM natriumbicarbonat, 5% SDS og 2,5% NaOH. Tør grundigt med destilleret vand efterfulgt af 75% ethanol.
BEMÆRK: Disse løsninger er et alternativ til de kommercielt tilgængelige løsninger. - Tø prøver på is. Vortex prøver i 2 min ved medium hastighed.
- For at øge screeningens hastighed skal du behandle prøverne i puljer. Hvis en pulje er positiv, udtages RNA'et for hver prøve uafhængigt for at finde den eller de positive prøver. Prøverne fra hvert prøvetagningssæt (i alt 16) samles i 2 puljer på 8 prøver.
BEMÆRK: At have 8 prøver pr. pulje betyder, at kun 2 puljer skal behandles pr. Sæt. Hvis en pulje er positiv, genbehandles de enkelte prøver til individuel RT-LAMP-analyse. Dette reducerer tid, omkostninger og reagenser. - Pulje 50 μL af hver af 8 prøver i et mikrocentrifugerør (samlet volumen 400 μL) den resterende prøve ved -80 °C. Der tilsættes 0,2 bind (80 μL) kloroform, vortex i 15 s og inkuberes derefter i 20 min ved 4 °C. Centrifuge ved 13.000 × g i 20 min ved 4 °C.
- Overfør det vandige (klare væske) lag til et nyt mikrocentrifugerør. Den resterende grænseflade og den lyserøde væske opbevares i fryseren -80 °C. disse fraktioner indeholder DNA og proteiner33,36.
- Der tilsættes et lige stort volumen isopropanol (~200 μL) og 2,6 μL glykogen coprecipitant (15 mg mL-1)37. Bland godt, og inkuber ved -20 °C i mindst 1 time, efterfulgt af 4 °C i 10 minutter for at udfælde RNA.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her ved at inkubere prøver ved -20 °C natten over i stedet for 1 time. - Centrifuge ved 13.000 × g i 20 min ved 4 °C. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Pelletpen blev genbrugt i 50 μL diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet vand, og der tilsættes et lige stort volumen (50 μL) af RNase-fri 5 M ammoniumacetat og 2,5 volumener (250 μl) på 100% ethanol7,38.
BEMÆRK: Ammoniumioner hæmmer polynukleotidkinase , hvis de anvendes i en downstream-proces38. Blandingen udfælder RNA, samtidig med at deoxynukleoside triphosphater og oligosaccharider efterlades i opløsning38. - Bland godt, og inkuber ved -20 °C i mindst 1 time, efterfulgt af 4 °C i 10 minutter for at udfælde RNA.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her ved at inkubere prøver ved -20 °C natten over i stedet for 1 time. - Centrifuge ved 13.000 × g i 20 min ved 4 °C. Pelleten vaskes med 1 mL kulde (-20 °C), frisklavet 75% ethanol. Centrifuge ved 8.000 × g i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatanten med en P10-pipette for at undgå at forstyrre pelleten.
- Lufttørre pellet i 10-15 minutter, indtil der ikke er tilbageværende ethanol. Pelletpen blev genbrugt i 50 μL DEPC-behandlet vand, tilsættes 5 μL 10x DNase buffer + 1μL DNase (2 enheder μL-1) og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Der tilsættes 0,1 bind (5,6 μL) DNase inaktiveringsreagens, inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. og blandes forsigtigt hvert minut. Centrifuge ved 13.000 × g i 2 min. og overføre supernatant til et nyt rør (~50 μL). Røret anbringes straks på is, mens RT-qPCR- eller RT-LAMP-reaktionerne forberedes, eller der opbevares i en fryser på -20 °C.
BEMÆRK: Udfør RNA-isolering i et ampliconfrit rum for at undgå overførselsforurening.
- Desinficere overflader, udstyr og pipetter med en opløsning på 2 mM kobbersulfat og 3% hydrogenperoxid; efterfulgt af en opløsning på 10% blegemiddel, 90 mM natriumbicarbonat, 5% SDS og 2,5% NaOH. Tør grundigt med destilleret vand efterfulgt af 75% ethanol.
- Multiplex reverse-transskription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP)
- Forbered en 20X primer mix løsning (tabel 1) for hvert sæt primere (Tabel 2). Forbered RT-LAMP reaktionsblandingen (tabel 3) ved stuetemperatur med 10% overskydende volumen for at tage højde for pipettingtab.
BEMÆRK: Den kolorimetriske LAMP 2X masterblanding med Antarktis termolabile uracil-DNA glycosylase (UDG) forhindrer forstærkning af DNA-kontaminering fra tidligere reaktioner20,28. - Vortex og spin ned blandingen. Blandingens 20 μL dispenseres i hvert reaktionsrør: prøve, spids, positiv kontrolog negativ kontrol. Inkuber reaktionerne i rørene ved stuetemperatur i 10 minutter, så UDG kan virke på potentiel overførselsforurening.
- Der tilsættes 5 μL RNA til prøvereaktionen, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopier) syntetisk SARS-CoV-2 RNA til den spidse reaktion, 2,5 μL (450 kopier) syntetisk SARS-CoV-2 RNA til den positive kontrolreaktion og 5 μL H2O til den negative kontrolreaktion. Bland godt, og spin ned reaktionerne; tø alt RNA op på is.
- Mens termocyklen eller vandbadet opvarmes til 65 °C, skal alle reaktioner forblive ved stuetemperatur. UDG vil blive deaktiveret ved >50 °C. Reaktionerne anbringes i termocyklen (brug varmelåg), inkuberes ved 65 °C i 40 minutter, og reaktionerne kan nå stuetemperatur (~22 °C i 5 min. ) eller afkøles på is i 1 min. Analyser resultaterne ved hjælp af den kolorimetriske funktion (simpel observation) eller ved at køre produkterne i en agarosegel.
BEMÆRK: Selv om detektionsgrænsen (LOD) er 10 kopier pr. reaktion, øges hyppigheden af detektionen, når kopinummeret nærmer sig 500 kopier pr. reaktion (Figur 3A). Med hensyn til kolorimetrisk observation skal det bemærkes, at et negativt resultat er angivet med pink (pH = 8,8), mens et positivt resultat er angivet med gult (pH = 5) (Figur 3B). Den kolorimetriske mulighed undgår åbning af RT-LAMP-rørene efter forstærkning, hvilket vil reducere mængden af RT-LAMP-produkterne i arbejdsmiljøet og overførselsforurening. Til gelelektroforese fremstilles en 1,5% agarosegel med 1X DNA gelplet i 0,5% Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer. Der indlæses 25 μL af reaktionen + 5 μL 6X belastningsfarvningsfarve i hver brønd. Kør gelen ved 100 V i 60 min. En molekylær markør er ikke nødvendig, da positive prøver viser et stigemønster (Figur 3C).
- Forbered en 20X primer mix løsning (tabel 1) for hvert sæt primere (Tabel 2). Forbered RT-LAMP reaktionsblandingen (tabel 3) ved stuetemperatur med 10% overskydende volumen for at tage højde for pipettingtab.
Representative Results
Prøver indsamlet af borgerforskere til påvisning af SARS-CoV-2. I en 8-måneders periode (medio marts til den tredje uge af november 2020) blev 482 borgere godkendt til at deltage i dette projekt, hvoraf 350 (73 %) anmodet om et sæt. I alt 362 kits blev leveret (dvs. nogle deltagere anmodede om flere kits), og 246 (70%) blev returneret (figur 4A,B). Alle 4.080 prøver indeholdt i disse kits blev behandlet. Indsamlingsstederne blev fordelt over distrikterne North Coastal, North Central, Central og Southern i amtet samt nogle få i de østlige distrikter (Figur 4A). Disse distrikter har den højeste befolkningstæthed i San Diego County og de mest dokumenterede COVID-19 tilfælde, som rapporteret af San Diego Human Health Service Agency39.
Borgerne anmodede om afhentning af de fleste samplede kits (dvs. gennemsnitlig succesrate: 70,4%). Hver dag blev der anmodet om 1-16 sæt, og 0-14 kits blev returneret til laboratoriet (Figur 4B). En undersøgelse af borgerforskerne viste, at indsamlingen af et komplet sæt (16 prøver) tog 1-3 timer fordelt over et gennemsnit på 8 dage(figur 4A og tabel 4). Langt de fleste af sættene var komplette (91,1%), hvilket betyder, at de indeholdt en vatpind i alle 16 prøverør, og de tilsvarende prøvetagningsdata blev uploadet til LIMS(Figur 4A og Tabel 4).
Påvisning af SARS-CoV-2 ved hjælp af GITC-chloroformekstraktion og multiplex omvendt transskriptionsom loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-LAMP). Til den kolorometriske RT-LAMP-analyse blev to sæt primere11,20,28 brugt til at målrette nucleocapsid (N2) og kuvertgener (E1) (tabel 2). De sekvenser, der anerkendes af disse primere, er i samme region som primere og sonder godkendt af CDC40 og Den Europæiske Union (EU)41 til menneskelig diagnose af COVID-19 af RT-qPCR. Disse resultater bekræfter, hvad Zhang et al.28 beskrev, hvor tilsætning af 60 mM guanidinhydrochlorid til reaktionen øger LOD,når den køres i multiplex. LOD med en frekvens på 100% var 500 eksemplarer pr. 25 μL reaktion (figur 3A, B). I den kolorimetriske RT-LAMP skiftede positive prøver farve fra pink til gul på grund af et pH-skift fra ~8 til 5,5 (Figur 3B). Når reaktionen blev orange ved lav-kopi numre, prøver blev kørt i en 1,5% agarose gel for at bekræfte disse var positive og resulterede i en stige-lignende mønster (Figur 3C). RT-LAMP blev brugt til at detektere SARS-CoV-2 i puljede RNA-prøver.
For at kontrollere for falske negativer på grund af reaktionshæmmere blev hver prøve testet i en ekstra reaktion tilsat 500 kopier af syntetisk SARS-CoV-2. Positive puljeprøver blev afveget ved at isolere RNA'et for hver enkelt prøve i puljen og køre i en RT-LAMP-reaktion for at bestemme identiteten af den positive prøve. Detektionsresultaterne blev derefter uploadet til LIMS, hvor det unikke prøve-id blev parret med oplysningerne om dato, klokkeslæt, GPS-koordinater, sted og billede af prøven.
Realtids- og traditionelle RT-PCR-metoder: hæmning ved prøveforurenende stoffer. For at vælge den bedste metode, der passer til den foreslåede detektionsrørledning, blev andre RNA-forstærkningsmetoder testet med miljøprøver indsamlet af en pilotkohorte af borgerforskere. Eksempler på resultaterne af hver af disse metoder er præsenteret i figur 5 for at skildre deres følsomhed over for miljøhæmmere og baggrundssignalstøj ved lave koncentrationer af virale kopieringsnummer.
Seks RT-qPCR-formuleringer (Tabel over materialer), der er godkendt af CDC og WHO, blev testet til påvisning af virusset på miljøprøver. Protokoller blev fulgt i henhold til producentens anvisninger samt CDC retningslinjer for påvisning af SARS-CoV-2 i kliniske indstillinger40. Reaktioner, der indeholdt forskellige koncentrationer af syntetiske SARS-CoV-2 RNA-kontroller, blev tilsat podede overfladeprøver efter rå RNA-isolering. Alle masterblandinger var følsomme over for hæmmere ved LOD-koncentrationer af den positive kontrol (figur 5A).
For at omgå hæmmere af disse realtidsteknologier blev et traditionelt RT-PCR-system testet. Et 1-trins RT-PCR-system (Table of Materials) blev brugt til at forstærke nucleocapsid-genet ved hjælp af primersættene N1, N2og konvolutgenet ved hjælp af primersættet E1, der er godkendt af henholdsvis CDC (USA) og ECDC (EU) (tabel 2). Protokoller blev fulgt i henhold til producentens anvisninger samt CDC retningslinjer for påvisning af SARS-CoV-2 i kliniske indstillinger40. Primeren sæt N1 og N2 designet af CDC giver en ~ 70 bp produkt; Der skelnede imidlertid ikke mellem positive tal for lav kopi og den negative kontrols forstærkningsbaglyde (figur 5B),som indførte falske positiver i resultaterne. Produktet af E1-primerne havde et svagt signal ved lavkopieringsnummer (figur 5B), hvilket introducerede falske negativer i resultaterne. Desuden var den testede RT-PCR-metode stadig følsom over for hæmmere, der var til stede i miljøprøverne (data vises ikke).
Der er udviklet andre metoder til påvisning af meget små mængder målsekvens. En af disse metoder er Rolling Circle Amplification (RCA), hvorefter genkendelse af målsekvensen, RNA eller DNA, af en bestemt lineær sonde, en ligase cirkulæriserer skabelonen. Ved hjælp af primere designet til at hybridisere med sonden forstærker en DNA-polymerase med strandforskydningsaktivitet sonden i en isotermisk reaktion42. Det er sonden, der identificerede målet, som forstærkes, og ikke målsekvensen, hvilket gør denne metode meget følsom43. Wang et al.44 offentliggjorde en RCA-protokol til direkte påvisning af SARS-CoV-1 RNA. Metoden blev ændret for at bruge primere specifikke for SARS-CoV-2. Desværre, i ikke-skabelon kontrol (NTC), sonden cirkulæriserer og udbytter produkt i mangel af RNA skabelon, selv når du bruger en bred vifte af ligaser, herunder en SNP-følsomme ligase. I mangel af ligase udviste NTC ikke forstærkning fra den lineariserede sonde (Figur 5C).
Figur 1: Webbaseret prøvetagningsplatform med datagrænseflade til indsamling af prøver til mobile enheder. Platformen blev brugt til anmodning om levering/afhentning af prøvesæt og indsendelse af eksempeldata. Platformen indeholdt detaljerede engelsk/spanske grafiske og audiovisuelle prøveudtagningsprotokoller. (B) Visning af mobilenheder, der bruges til at uploade eksempeldata: dato, klokkeslæt, GPS-koordinater, beskrivelse af prøvested og et billede af indsamlingsstedet. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; GPS = Globalt positioneringssystem. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Prøveopsamlingssæt. Borgerforskere modtog en køler med to isposer, et sikkerhedsdatablad til at informere frivillige om farerne ved at håndtere GITC-løsningen, en detaljeret prøveudtagnings- og maske-iført protokol, en KN95-maske, en affaldspose, en sprayflaske med håndsprit, en sprøjteflaske med 0,5% SDS, 16 par handsker, en lille pose med 16 tandstikkere og 16 polyesterpinde, 16 formærkede mikrocentrifugerør indeholdende 200 μL GITC-opløsning, en kasse med prøvetagningsrørene og en pose, der bruges som sekundær beholder til rørkassen i tilfælde af spild. Forkortelser: GITC = guanidinium thiocyanat; SDS = natrium dodecyl sulfat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Multiplexed Reverse-Transskription Loop-Medieret Isotermisk forstærkning (RT-LAMP) assay. Multiplexerede reaktioner ved hjælp af primere til SARS-CoV-2 nucleocapsid (N2) og kuvert (E1) gener til at opdage så få som 10 kopier af virus i reaktionen. Syntetisk SARS-CoV-2 RNA blev brugt som positiv kontrol. (A) Hyppighed af detektion i multiplex kolorimetrisk RT-LAMP af SARS-CoV-2 ved forskellige genomkopinumre pr. reaktion. Gennemsnitsværdi på fem replikater i pink. b) detektionsgrænse (LOD) for SARS-CoV-2 i multixfarvemetrisk RT-LAMP gul = positiv (pH ~5); pink = negativ (pH ~8). (c) Stigemønster for positive SARS-CoV-2 RT-LAMP-reaktioner ved 1,5% agarosegelelektroforese. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; rxn = reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Placering af borgerforskerprøvesæt i San Diego County og succesrate for ønskede kits. (A) Orange prikker repræsenterer placeringen af 1 prøvesæt, som indeholder 16 prøver. Den blå cirkeldiagram viser den procentdel af kits, der tog forskellige dage fra, da de blev leveret til borgeren forskere til, da de blev returneret til laboratoriet. Antal dage i parentes. Det orange cirkeldiagram viser procentdelen af sæt med forskelligt antal fuldførte prøver fra i alt 16 prøver. Antal fuldførte prøver, der indeholder en vatpind inde i prøveglasset, og de tilsvarende prøvetagningsdata, der er overført til LIMS i parentes. (B) Procentdel af kits, der blev returneret til laboratoriet (prikker), og det samlede antal ønskede kits (barer), i forhold til den dato, hvor sættet blev anmodet om. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Alternative SARS-CoV-2 RNAdetection-metoder. (A) RT-qPCR-påvisning af SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) gen ved hjælp af primersæt N2. Samlede miljøprøver tilsat 900 (grønne) eller 9 (orange) kopier af SARS-CoV-2. Positive kontrolelementer i de samme kopinumre med blåt. Pilen angiver faldet i fluorescensdetektionen af positiv kontrol med lavt kopieringstal, når der er en miljøprøve til stede. (b) Traditionel RT-PCR-påvisning af SARS-CoV-2. Top: RT-PCR produkter af nucleocapsid genet ved hjælp af primer sæt N1 og N2. Der observeres et svagt baggrundssignal i kontrolelementet uden skabelon. Nederst: RT-PCR-produkter fra kuvertgenet ved hjælp af primersættet E1. Meget lavt signal observeres ved LOD-koncentrationen. Blå pile viser forventede positive produkt: (top) ~ 70 bp og (nederst) 113 bp i 2% agarose gel elektrophoresis. (C)RCA af SARS-CoV-2 RNA. Cirkulære sondeforstærkninger i nærværelse af ligase og fravær af RNA-skabelon (NTCcir); i mangel af ligase og RNA skabelon lineær sonde ikke forstærke (NTClin). Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; RFU = relative fluorescensenheder; bp = basispar; rxn = reaktion; MM = molekylmarkør; RT-PCR = polymerasekædereaktion ved omvendt transskription; RT-qPCR = kvantitativ RT-PCR i realtid; RCA = forstærkning af bølgecirkler; NTC= ikke-skabelonkontrol; LOD = detektionsgrænse; rxn = reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer | Koncentration på 20% (μM) | 1X Koncentration (μM) |
| Fip | 32 | 1.6 |
| BIP | 32 | 1.6 |
| F3 | 4 | 0.2 |
| B3 | 4 | 0.2 |
| LøkkeF | 8 | 0.4 |
| LøkkeB | 8 | 0.4 |
Tabel 1: Formulering til 20X RT-LAMP primer mix. I RT-LAMP-reaktionen genkender 6 primere 8 regioner af det målrettede DNA. Forkortelser: omvendt transskriberingssløjfe-medieret isotermisk forstærkning; FIP = fremad indre primer; BIP = baglæns indre primer; F3 = fremadgående forskydningsprimer; B3 = bagudrettet forskydningsprimer; LoopF = fremadgående sløjfeprimer; LoopB = baglæns sløjfeprimer.
| Primer | sekvens | mål | Produktstørrelse | |||
| RT-LAMPE9,18,19 | ||||||
| E1-F3 | TGAGTACGAACTTATGTACTCAT | ecstasy | stige-lignende mønster | |||
| E1-B3 | TTCAGATTTTTAACGAGAGT | |||||
| E1-FIP | 1984, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23. | |||||
| E1-BIP | 1984, S. 1773, 1777( 1975) 1975, S. 1777, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12. | |||||
| E1-LoopB | GCGCTTCGATTGTGCGT | |||||
| E1-LoopF | CGCTATTAACTATTAACG | |||||
| N2-F3 | ACCAGGAACTAATCAGACAAG | nielsen | ||||
| N2-B3 | 1984, S. 1973, s. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12. | |||||
| N2-FIP | 1984, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, KOMMISSIONEN MOD TYSKLAND, SML. 1979, S. 1773, PRÆMIS 23. | |||||
| N2-BIP | CGCATTGGCATGGAAGTCAATTTGATGGCACCTGTGTA | |||||
| N2-LoopF | GGGGGCAAATTGTGCAATTTG | |||||
| N2-LoopB | CTTCGGGAACGTGGTTGACC | |||||
| RT-qPCR38 | ||||||
| 2019-nCoV_N1-F | GACCCCAAAATCAGCGAAAT | nielsen | 72 bp | |||
| 2019-nCoV_N1-R | 1984, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, | |||||
| 2019-nCoV_N1-P | 5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3' | |||||
| 2019-nCoV_N2-F | TTACAAACATTGGCCGCAAA | nielsen | 67 bp | |||
| 2019-nCoV_N2-R | GCGCGACATTCCGAAGAA | |||||
| 2019-nCoV_N2-P | 5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3' | |||||
| RT-PCR39 | ||||||
| E1_Sarbeco_F | ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT | ecstasy | 113 bp | |||
| E1_Sarbeco_R | ATATTGCAGCAGTACGCACACA | |||||
Tabel 2: Primere, der bruges til RT-LAMP, RT-qPCR og RT-PCR. Primersekvenser, målgen, forventet produktstørrelse og tilsvarende reference er angivet. Forkortelser: RT-LAMP = sløjfemedieret isotermisk forstærkning med omvendt transskribering; RT-PCR = polymerasekædereaktion ved omvendt transskription; bp = basispar; RT-qPCR = kvantitativ RT-PCR i realtid; E1 = kuvertgen; N2 = nucleocapsid gen; F = fremad primer; R = omvendt primer; P = Sonde; FIP = fremad indre primer; BIP = baglæns indre primer; F3 = fremadgående forskydningsprimer; B3 = bagudrettet forskydningsprimer; LoopF = fremadgående sløjfeprimer; LoopB = baglæns sløjfeprimer.
| Reagens | Volumen (μL) |
| WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix med UDG | 12.5 |
| N2 Primer Mix (20x) | 1.25 |
| E1 Primer Mix (20x) | 1.25 |
| Guanidin hydrochlorid (600 mM)* | 2.5 |
| Mål RNA | 5 |
| Nuklease-fri H2O | 2.5 |
| Samlet volumen | 25 |
Tabel 3: Reaktionsmasterblanding til multiplexfarvet RT-LAMP. (*) Guanidin Hydrochlorid har vist sig at øge reaktionens følsomhed og hastighed ved hjælp af en ukarakteriseret mekanisme28. Forkortelser: LAMP = loop-medieret isotermisk forstærkning; UDG = uracil-DNA glycosylase; N2 = nucleocapsid gen; E1 = kuvertgen; DEPC = diethylpyrocarbonat.
| Godkendte borgere | Borgere, der har anmodet om et sæt | Leverede sæt | Returnerede samplede sæt | Dage dedikeret til prøvetagning | % komplette sæt | % ufuldstændige kits | Behandlede prøver | |
| 482 | 72.6% (350/482) | 362 | 70.4% (255/362) | betyde | 8 | 91.1 (224/246) | 8.9 (22/246) | 4,080 |
| median | 3 | |||||||
Tabel 4:Swabbing for SARS-CoV-2 af tallene. Opsøgende og prøvetagning succesrate. Forkortelse: SARS-CoV-2 = svær akut luftvejssyndrom coronavirus 2.
Discussion
Borger videnskabsmand engagement. Citizen forskere blev rekrutteret til at podning overflader i hele San Diego County at prøve og opdage tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 i bymiljøet. Størstedelen af de leverede prøvetagningssæt (70 %) blev returneret til laboratoriet, og af disse var næsten alle prøver færdige (91 %) (Figur3A,B og tabel 4). Frivillige kunne nemt anmode kit levering / afhentning gennem web-baseret platform, og levering rute-planlægning software anmeldt borger forskere af anslåede ankomsttidspunkter, både sandsynlige væsentlige faktorer for den observerede succes. Den gennemsnitlige tid fra det tidspunkt, hvor sættet blev leveret til borgerforskeren, til da det blev returneret til laboratoriet, var 8 dage med en median på 3 dage og et interval på 1-64 dage (figur 3A og tabel 4). Hyppigere påmindelser til frivillige vil sandsynligvis reducere denne forsinkelse tid.
Dataindsamlingsplatformen blev med succes brugt af et stort flertal af brugere (73 %) (Tabel 4) Mens borgerforskernes indsats ikke blev målt, viste felttest, at dataindsamlingsplatformen reducerede den indsats og tid, der kræves for at gennemføre prøveindsamlingen korrekt. Således tilskyndede en reduktion af mængden af bogføring borgerforsker engagement. Den webbaserede platform, der har til formål at overvinde demografiske begrænsninger ved at levere en flersproget oversættelsestjeneste for neurale maskiner og ved at levere grafiske og audiovisuelle protokoller på engelsk og spansk. Dette var kun delvis vellykket, da færre prøver blev indsamlet fra både South Bay og North County, hvor de fleste af amtets spansktalende / Latino befolkning bor45. Disse områder også husede 63% (1.700 tilfælde pr 100.000) af de samlede COVID-19 tilfælde i San Diego County med den højeste forekomst af sygdommen46 og antallet af indlæggelser (62%)47,48. Selv om de fleste af prøverne kom fra Central County, blev der indsamlet et repræsentativt antal fra de mest COVID-19-påvirkede distrikter, og kun en lille brøkdel af prøverne var positive, hvilket tyder på, at overfladereservoirer af SARS-CoV-2 i bymiljøet er relativt sjældne.
Prøvebehandling. Prøvetagningsprøver blev besyet med SDS, som inaktiverede virussen ved at forstyrre dens konvolut og stabiliserede det nøgne RNA ved at udfolde RNases32. Bekvemt under indsamlingen rensede vaskemidlet i vatpinden den prøvede overflade. Miljøprøver indeholder ofte meget små mængder RNA. For at maksimere genoprettelsen blev RNA-isolering udført ved hjælp af en GITC-baseret, kolonnefri, rå ekstraktionsmetode. GITC, et stærkt chaotropisk middel, forstyrrer de hydrogenbindinger, der opretholder proteinfoldning (dvs. hydrofobisk effekt). Denne handling resulterer i inaktivering af virale partikler, og RNA forbliver stabilt på grund af hæmningen af RNA'er34,35,36. GITC-opløsningen opretholdt stabiliteten af RNA-prøverne uden strenge koldkædede overvejelser, hvilket gjorde det muligt for borgerne at opbevare prøverne ved stuetemperatur, hvis der ikke var en fryser til rådighed for de medfølgende isposer. For at mindske den potentielle risiko, som dette reagens udgør, når der opstår direkte hud- eller slimhindekontakt, blev borgerne gjort opmærksomme på disse risici ved at medtage et materialesikkerhedsdatablad i sættet, og der blev anbragt en advarselsforsegling i kassen med rørene.
Den rå GITC-chloroformekstraktionsmetode understøttede genvinding af spor af RNA fra podeprøverne, og som det fremgår af forstærkningen af spidse prøver, fortsatte hæmmerne sjældent i prøverne efter ekstraktionen. Prøver, som var negative for SARS-CoV-2 og viste ingen RT-LAMP-hæmning, repræsenterede ægte negativer eller havde et lavere kopinummer end LOD ved 100% frekvens. Omvendt indebærer påvisning af viralt RNA på en overflade ikke direkte risiko for overførsel gennem kontakt, da virusets infektiøsitet fra positive prøver skal testes. Hurtig screening af miljøet, ikke begrænset af tilgængeligheden af avancerede forsyninger eller højt kvalificeret personale, er afgørende for at vurdere, om overflader udgør et viralt reservoir, og for bedre at kunne forebygge og begrænse forebyggelses- og indeslutningsindsatsen bedre.
RT-LAMP blev valgt som den bedste metode, der passer til den foreslåede detektionsrørledning. Det viste sig at være en hurtig og billig metode, der var meget modstandsdygtig over for de fleste af de resterende hæmmere og så følsom og specifik som andre RT-qPCR-metoder. På grund af deres brug i kliniske miljøer under SARS-CoV-2-pandemien blev tilgængeligheden af RT-qPCR-kits påvirket af den globale efterspørgsel. Desuden var RT-qPCR-teknikker - selv dem, der var formuleret til at modstå hæmmere - følsomme over for stoffer indeholdt i miljøprøver indsamlet af en pilotkohorte af borgerforskere, selv efter brugen af andre fælles strategier til at reducere hæmmerkonkurrencen for enzymbinding49. Disse fund bekræftes af en nylig undersøgelse, der sammenlignede begge metoder til at detektere SARS-CoV-2 på vatpindprøver fra slik håndteret af COVID-19-patienter og fandt over 83% resultatkonkordans, med 25% lavere hæmning i prøver analyseret af RT-LAMP15. Desuden reducerede GITC-chloroform crude extraction sammen med RT-LAMP omkostningerne til reagenser og forsyninger med 42% sammenlignet med RNA-kitudvinding og RT-qPCR (Table of Materials).
Denne metode gjorde det muligt at analysere tusindvis af overfladeprøveprøver med høj gennemløb. Op til 80 puljer, der repræsenterer 640 prøver, blev behandlet på 2 dage fra RNA-ekstraktion til SARS-CoV-2-detektion af RT-LAMP. Den foreslåede protokol er semikvantitativ, begrænset til påvisning af viralt RNA, og angiver ikke tilstedeværelsen af infektiøse virale partikler. Der er behov for yderligere analyse for at vurdere risikoen for overførsel af SARS-CoV-2 fra inficerede fomitter, der er til stede på de podede overflader.
Denne undersøgelse præsenterer en protokol til hurtigt at oprette en teststrategi, der omfatter en effektiv arbejdsgang, når man står over for en sundhedskrise med en smitsom sygdom. Den foreslåede prøveudtagningsprotokol er enkel og anvender forsyninger, der almindeligvis findes i husholdninger, og den virale detektionsmetode udføres på udstyr, der er tilgængeligt i grundlæggende laboratoriemiljøer, såsom et vandbad i stedet for en termocykel. Omkostningerne ved RT-LAMP reagenser er betydeligt lavere end dem, der er nødvendige for RT-qPCR og mindre modtagelige for scenarier med stor global efterspørgsel. Denne undersøgelse tjener som ramme for vurdering af miljømæssige virale reservoirer i fremtidige epidemiske udbrud og globale pandemier.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Viral Information Institute (VII) efterforskere, Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin, og Dr. Jennifer Smith for at tage sig tid til at indsamle mange prøver. Vi takker også Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre, og Dr. Sarah Allard fra afdelingen for pædiatri ved School of Medicine University of San Diego California (UCSD) for at lette positiv kontrol og nyttig feedback. Vi takker Stacey Carota (SDSU College of Sciences) og Gina Spidel (SDSU) for logistisk støtte og Juan Rodríguez for kunsten og det grafiske design af prøvetagningsprotokollen. Vi takker alle deltagere for deres engagement og engagement i dette projekt i meget vanskelige tider. Dette arbejde blev støttet af en generøs donation fra Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) og National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 tilskud (Award Number: 2030479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMP, LIMS, and community outreach: | |||
| Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
| Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
| Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
| Database software | MySQL | ||
| Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
| Free email service | Google Email | ||
| Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
| Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
| Online form | Google Form | ||
| Operating system | Linux | ||
| Web and database development | Big Rose Web Design | ||
| Web server software | Apache | ||
| Sampling kit: | |||
| Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
| Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
| Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
| Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
| Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
| KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
| Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
| 30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
| RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
| Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
| Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
| Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
| Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
| Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
| Trizol RNA extraction: | |||
| Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
| GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
| Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
| Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
| Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
| Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
| RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
| RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
| Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
| WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
| Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
| Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
| Kit for RNA extraction: | |||
| QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
| RT-qPCR: | |||
| Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
| qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
| QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
| QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
| UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
| Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
| RT-PCR: | |||
| SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
| Lab cleanup: | |||
| DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
| RNAZap | Invitrogen | AM9780 | |
References
- Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
- Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730 (2020).
- Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
- Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
- Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
- How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
- Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
- Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
- Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
- Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
- Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
- Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437 (2018).
- Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
- Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074 (2020).
- Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
- Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
- Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
- Broughton, J. P., et al.
- Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
- Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
- Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
- Notomi, T., et al.
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
- Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Wallace, D. M.
- COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
- CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
- Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045 (2020).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
- Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
- Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
- Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
- COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
- COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
- COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
