Summary
Et citizen science-prosjekt ble designet for å rekruttere innbyggere i San Diego til å samle inn miljøprøver for SARS-CoV-2. En flerspråklig nettbasert plattform ble opprettet for datainnsending ved hjelp av et brukervennlig grensesnitt for mobilenheter. Et laboratorieinformasjonsstyringssystem la til rette for innsamling av tusenvis av geografisk mangfoldige prøver med resultatsporing i sanntid.
Abstract
For å kontrollere samfunnsoverføringen av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) under den globale pandemien i 2020, implementerte de fleste land strategier basert på direkte menneskelig testing, ansiktsbelegg og overflatedesinfeksjon. Under forutsetning av at hovedveien for overføring inkluderer aerosoler og respiratoriske dråper, har arbeidet med å oppdage SARS-CoV-2 i fomitter fokusert på steder mistenkt for høy prevalens (f.eks. sykehusavdelinger, cruiseskip og massetransportsystemer). For å undersøke tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 på overflater i bymiljøet som sjelden rengjøres og sjelden desinfiseres, ble 350 borgere vervet fra det større San Diego County. Totalt samlet disse borgerforskerne inn 4080 prøver. En online plattform ble utviklet for å overvåke levering og henting av prøvetakingssett, samt for å samle inn prøvedata. Prøvetakingssettene ble for det meste bygget av forsyninger tilgjengelig i pandemistresset butikker. Prøver ble behandlet ved hjelp av reagenser som var enkle å få tilgang til til tross for den tilbakevendende forsyningsmangelen. Metodene som ble brukt var svært følsomme og motstandsdyktige mot inhibitorer som ofte er til stede i miljøprøver. De foreslåtte eksperimentelle design- og prosesseringsmetodene lyktes med å engasjere mange borgerforskere som effektivt samlet prøver fra forskjellige overflateområder. Arbeidsflyten og metodene som er beskrevet her er relevante for å kartlegge bymiljøet for andre virus, som er av folkehelsehensyn og utgjør en trussel for fremtidige pandemier.
Introduction
SARS-CoV-2 antas å hovedsakelig overføres via innånding av forurensede aerosoler og dråper fra direkte kontakt med infiserte personer1,2,3,4. I de første fasene av den globale COVID-19-pandemien fokuserte imidlertid arbeidet med å kontrollere overføringen av SARS-CoV-2 sterkt på desinfisering av overflater, håndvask og desinfisering. Ved utgangen av 2020, overføringsretningslinjer fra Verdens helseorganisasjon (WHO)5 og U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC)6 anses luftbåren overføring en fare hovedsakelig når de er i nær kontakt (<2 m) med en smittet person eller i nærvær av aerosolgenererende medisinske prosedyrer. Selvinokulering etter kontakt med forurensede overflater eller innånding av aerosoliserte fomitter er ennå ikke utelukket som en overføringsvei for SARS-CoV-2.
COVID-19 tilfeller har blitt rapportert der luftbåren overføring virker usannsynlig7,8. SARS-CoV-2 virioner forblir smittsomme på kobber i opptil 8 timer, på papp og rustfritt stål i opptil 24 timer, og på plast i opptil 48 timer9. I cruiseskipshytter ble SARS-CoV-2 RNA oppdaget 17 dager etter at passasjerene hadde gått7. Luft- og overflateprøver fra sykehus og massetransittsystemer har testet positivt for SARS-CoV-2 og andre koronavirus8,10,11,12,13,14. En studie utført på den ytre emballasjen av Halloween-godteri håndtert av asymptomatiske og moderate / mildt symptomatiske COVID-19-pasienter, konkluderte med at kombinasjonen av håndvask av håndtereren og vasking av godteri med håndsåpe reduserte SARS-CoV-2 RNA til under terskelnivåer15.
Flere metoder for SARS-CoV-2-diagnostikk er publisert basert på sanntids omvendt transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)16,17, omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP)11,18,19,20,21og CRISPR-Cas-teknologier18,19,22,22 , 22 , 23. De fleste krever RNA-ekstraksjonssett som ofte er mangelvare i perioder med betydelig global etterspørsel, og svært få har blitt brukt til miljøscreening av viruset24. Påvisning av SARS-CoV-2 RNA ved bruk av RT-LAMP har vist seg å være over 83% konkordans til bruk av RT-qPCR. Videre resulterte RT-LAMP i 25% reduksjon i inkonklusive resultater sammenlignet med RT-qPCR15.
RT-LAMP er en enkel teknikk som bruker en omvendt transkripsjon for å syntetisere cDNA fra en RNA-mal25, etterfulgt av en DNA-polymerase med sterk strandforskyvningsaktivitet som syntetiserer DNA ved konstant temperatur (dvs. isotermisk forsterkning)26. Høyere spesifisitet av viral genomdeteksjon oppnås ved å bruke fire eller seks primere som gjenkjenner seks eller åtte regioner av mål-DNA. Forsterkning er initiert fra en intern primer og gir en semi-dobbeltstrenget DNA-struktur. Den ledende tråden forsterkes deretter av en ytre primer. Disse forsterkningene gjentas for de omvendte primerne. Interne og ytre primere i begge ender har et internt omvendt selv komplementært område som danner en løkke i forsterkningsproduktet26,27. I isotermisk strandforskyvning genererer asynkron DNA-syntese høye mengder forsterket produkt der kontinuerlig polymerisering forsterker signalet på så få som 10 kopier per reaksjon11,20,28. Den kolorimetriske RT-LAMP-blandingen er svakt bufret og bruker fenolrød som pH-indikator. Som polymerase inkorporerer et nukleotid, frigjør det en proton, og nok protoner vil endre pH i løsningen samt fargen fra rosa til gul11,20,28,29.
RT-LAMP ble utviklet for påvisning av myggbårne sykdommer i perifere helseinstitusjoner som mangler fullt utstyrte laboratorier25 og for rask påvisning av andre RNA-virus som humant immunsviktvirus30. De mest sårbare populasjonene i epidemiske utbrudd – i henhold til WHO-definisjonen – mangler ofte tilstrekkelige økonomiske ressurser og riktig utstyr til å utføre deteksjon (FNs globale folkehelseagenda). I den nåværende SARS-CoV-2-pandemien har forsyninger som vattpinner og reagenser av medisinsk kvalitet for RNA-ekstraksjonssett ikke vært i stand til å møte global etterspørsel, spesielt i ikke-produksjonsland. Den foreslåtte protokollen brukte en guanidinium thiocyanate (GITC)-basert råolje RNA-ekstraksjon, som effektivt bevarte RNA på en kaldkjedet uavhengig måte og reduserte utholdenheten til inhibitorer fra prøven betydelig. Videre er GITC-kloroformutvinningsprotokollen basert på separasjon av RNA fra DNA og proteiner etterfulgt av den respektive nedbøren, slik at utvinning av det meste av det genetiske materialet. Disse fordelene oppveier de potensielle farene ved at borgerforskere håndterer kjemikaliet hvis det iverksettes tiltak for å informere dem om risikoen på riktig måte.
Den foreslåtte arbeidsflyten bruker materialer og reagenser som er til generell bruk. Det krever utstyr som er tilgjengelig i grunnleggende, ofte landlige, laboratoriemiljøer. Disse metodene er billige, svært motstandsdyktige mot inhibitorer som ofte finnes i miljøprøver eller prøver som ikke kan behandles med ekstraksjonssett, og eliminerer behovet for en høypresisjons termosykler. Denne studien presenterer en rørledning for prøvetaking og påvisning av SARS-CoV-2 fra miljøreservoarer på ofte berørte og sjelden desinfiserte overflater av husholdninger og bymiljøet.
Protocol
Se materiallisten for en detaljert liste over reagenser og forsyninger, inkludert katalognumre, produsent og tilsvarende kostnader.
1. Prøvetaking av bymiljøet
- Citizen forsker oppsøkende
- Rekrutter borgerforskere ved hjelp av en direkte og tydelig oppfordring til handling utgitt via lokale og sosiale medier. Opprett et håndtak på sosiale medier (f.eks. #swab4corona) for å koble emnet på tvers av innhold på sosiale medier.
- Opprett en e-postkonto for direkte kommunikasjon mellom laboratorieteamet og hver borgerforsker, administrert av en person som snakker flytende hovedspråkene i interesseområdet (f.eks. spansk og engelsk for San Diego County).
- Bygg en sikker nettbasert prøvehåndteringsplattform (SMP) for å fungere som en database, et laboratorieinformasjonsstyringssystem (LIMS) og for å kommunisere med borgerforskere.
MERK: SMP gir et sentralisert sted der brukere ber om et sett, får tilgang til eksempelsamlingsprotokoller, sender inn eksempelmetadata og ber om henting for fullførte eksempelsett. - Opprett en kobling til SMP (f.eks. https://demo.covidsample.org/) (figur 1) for enkeltpersoner som skal søke om å delta i miljøprøvetakingsarbeidet ved å svare på biosikkerhetsrelaterte spørsmål som er angitt i et elektronisk skjema.
- Sikker tilgang til SMP ved hjelp av et programmeringsgrensesnitt for godkjenningsprogram som er tilrettelagt av en skydatamaskintjenesteleverandør. Gi godkjente brukere tilgang til SMP.
MERK: Se litteraturen for en beskrivelse av OAuth 2.0-protokollen31 for godkjenning og autorisasjon. Det gir en friksjonsfri påloggingsprosess for frivillige fra borgerforskere. Det gjør det også mulig for brukere å logge på med en eksisterende konto, noe som eliminerer behovet for å opprette en tilpasset påloggingsløsning og administrere brukerlegitimasjon, noe som sparer betydelig tid og oppmuntrer til deltakelse. Ifølge nylige rapporter har den gratis e-posttjenesten som er tilgjengelig for den valgte skydatatjenesteleverandøren omtrent 1,5 milliarder månedlige aktive e-postbrukere; å kreve en e-postkonto fra denne tjenesteleverandøren for deltakelse anses ikke som en nedslående faktor. - Forklar målet med studien og biosikkerhetshensynene til borgerforskerne ved SMP før de ber om sitt første sett. Tilby en flerspråklig plugin for å aktivere navigering på alle språkene som er tilgjengelige fra en flerspråklig nevral maskinoversettelsestjeneste tilrettelagt av en skydataleverandør.
- Inkluder grafikk- og audiovisuelle protokoller i prøvetakingsdelen på engelsk og spansk.
- Tilordne en unik identifikator til hvert sett, og utform brukergrensesnittet for å bruke knapper koblet til eksempel-ID for å effektivisere dataregistreringsprosessen (figur 1A).
- Bruk en programvare for planlegging av leveringsrute med en mobil enhet som skal brukes av sjåfører til å optimalisere leverings-/henteruter og varsle borgerforskere om nøyaktige estimerte ankomsttider.
- Bygg LIMS-plattformen på en PHP-webtjenestestakk, og vær vert for den på en kommersiell hostingplattform (foreslått operativsystem, webserverprogramvare og databaseprogramvare er spesifisert i materialtabellen).
- Gi et sikkert nettbasert applikasjonsgrensesnitt for å gjøre det mulig for laboratoriepersonell å administrere data raskt og enkelt i LIMS. Gi datavisualisering ved hjelp av et datadiagramprogramprogrammeringsgrensesnitt tilrettelagt av en skydatatjenesteleverandør.
- Visualiser geografiske data ved hjelp av et geospatialt programmeringsgrensesnitt tilrettelagt av en skydataleverandør. Lagre dataene som sendes til LIMS gjennom SMP for å lette (1) sentralisert lagring av prosjektdata; (2) sporing av arbeidsflyter for prøve-/databehandling; og (3) styring av logistikken av prøvesettdistribusjon til borgerforskere.
- Sikre innsendte metadata ved hjelp av anbefalte fremgangsmåter (f.eks. https://demo.covidsample.org/).
- Forhåndslastingsinformasjon, for eksempel eksempel eksempelpakke-ID, eksempel-ID, dato, klokkeslett og GPS-koordinater (Global Positioning System) (automatisk samlet inn fra et bilde av området) for å aktivere samsvar mellom datatyper og minimere brukerens innsending av feilaktige eller manglende data (figur 1B). Inkluder følgende felt som skal fylles manuelt og raskt (<1 min) som er fylt av borgerforskeren: dato og klokkeslett for innsamling, en kort beskrivelse av stedet og et bilde av prøvetakingsstedet.
- Desinfiser alle opplastede data, og valider for datatype. Valider for eksempel bildedata som er lastet opp av brukere for å velge .jpg filer, gi dem nytt navn med eksempel-ID for rask tilknytning til eksemplet, og lagre opplastede bilder på et eget sikkert sted som ikke er tilgjengelig for brukere.
- Aktiver alternativet for å be om levering og henting av sett når alle prøver (16) er fullført. I tillegg aktiverer du alternativet for å be om at et nytt sett leveres ved henting av det forrige (figur 1A).
MERK: For frivillige som foretrekker en ikke-nettbasert plattform og for de som er bekymret for å avsløre GPS-plasseringen sin (f.eks. medlemmer av samfunnet som er bekymret for deres migrasjonsstatus), kan sett leveres på et avtalt møtested og frivillige bedt om å registrere en skriftlig versjon av datainnsamlingen. For kommunikasjon mellom laboratoriet og hver medborgerforsker, ha et tospråklig medlem av prosjektet tilgjengelig for telefonsamtaler og tekster.
- Vattpinne til Corona
- Identifiser et epidemiologisk relevant tidsvindu for prøvetakingsinnsatsen.
- Bygg et sett som inneholder alle prøvetakingsutstyrene, inkludert nødvendig personlig verneutstyr (dvs. maske, hansker), en prøvetakingsprotokoll og biosikkerhetsrelevant informasjon (figur 2). Forhåndsetikett hvert rør med den tilordnede unike identifikatoren (eksempel-ID).
- Vattpinne desinfiserte sjelden overflater som er utsatt for aerosoliserte fiender i husholdninger og urbane omgivelser.
- Bruk den medfølgende masken offentlig og et nytt par hansker for innsamling av hver prøve for å unngå krysskontaminering. Etter å ha fullført prøvetakingen, bruk den medfølgende hånddesinfeksjonsmiddelet.
- Fukt en 1 cm2 polyesterabsorberende vattpinne (f.eks. moppputer) med et vaskemiddel (f.eks. 0,5 % natriumddecylsulfat (SDS)) for å inaktivere viruset ved å forstyrre konvolutten og stabilisere den nakne RNA ved å fremkalle utfoldelse av RNases32.
- Vattpinne en overflate på 10 cm2. Hjulpet av en tannpirker, senk hver prøvepinne helt ned i det tilsvarende forhåndsmerkede røret som inneholder 200 μL guanidiniumtiocyanatoppløsning (GITC). Oppbevar rør ved 4 °C til de transporteres til laboratoriet. Når prøvene kommer til laboratoriet, oppbevar dem ved -80 °C.
MERK: GITC er giftig irriterende; unngå kontakt med huden. GITC-løsning er enkel å forberede fra vanlige laboratoriekjemikalier, for oppskriften se33,34. Det inaktiverer viruset, stabiliserer RNA ved å denaturing RNases34,35,36, og stabiliserer prøver ved romtemperatur. Settet inkluderer imidlertid ispakker for å holde prøvene kalde uten å måtte bruke husholdningskjøleskap til lagring.
2. SARS-CoV-2 deteksjon
- Total RNA-isolasjon
- Desinfiser overflater, utstyr og pipettorer med en løsning på 2 mM kobbersulfat og 3% hydrogenperoksid; etterfulgt av en løsning på 10% blekemiddel, 90 mM natriumbikarbonat, 5% SDS og 2,5% NaOH. Tørk grundig med destillert vann etterfulgt av 75% etanol.
MERK: Disse løsningene er et alternativ til de kommersielt tilgjengelige løsningene. - Tine prøver på is. Virvelprøver i 2 min ved middels hastighet.
- Hvis du vil øke hastigheten på screeningen, behandler du prøvene i utvalg. Hvis et basseng er positivt, trekker du ut RNA for hver prøve uavhengig av hverandre for å finne de positive prøvene. Kombiner prøvene fra hvert prøvesett (totalt 16) i 2 utvalg på 8 prøver.
MERK: Å ha 8 prøver per basseng betyr at bare 2 bassenger må behandles per sett. Hvis et utvalg er positivt, behandles de enkelte prøvene på nytt for individuell RT-LAMP-analyse. Dette reduserer tid, kostnader og reagenser. - Basseng 50 μL av hver av 8 prøver i et mikrosenterrør (totalt volum 400 μL); den gjenværende prøven ved -80 °C. Tilsett 0,2 volumer (80 μL) kloroform, virvel i 15 s, og inkuber deretter i 20 minutter ved 4 °C. Sentrifuge ved 13.000 × g i 20 min ved 4 °C.
- Overfør det vandige (klare væske) laget til et nytt mikrosenterrør. Oppbevar det gjenværende grensesnittet og den rosa væsken i -80 °C fryseren; disse fraksjonene inneholder DNA og proteiner33,36.
- Tilsett et likt volum isopropanol (~200 μL) og 2,6 μL glykogenkoprecipitant (15 mg ml-1)37. Bland godt, og inkuber ved -20 °C i minst 1 time, etterfulgt av 4 °C i 10 minutter for å utfelle RNA.
MERK: Protokollen kan settes på pause her ved å inkubere prøver ved -20 °C over natten i stedet for 1 time. - Sentrifuge ved 13.000 × g i 20 min ved 4 °C. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Resuspend pellet i 50 μL av dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann, og legg til et likt volum (50 μL) RNase-fri 5 M ammoniumacetat og 2,5 volumer (250 μl) av 100% etanol7,38.
MERK: Ammoniumioner hemmer polynukleotid kinase hvis det brukes i en nedstrømsprosess38. Blandingen utfeller RNA mens du forlater deoksynukleoside tripfosfater og oligosakkarider i løsning38. - Bland godt, og inkuber ved -20 °C i minst 1 time, etterfulgt av 4 °C i 10 minutter for å utfelle RNA.
MERK: Protokollen kan settes på pause her ved å inkubere prøver ved -20 °C over natten i stedet for 1 time. - Sentrifuge ved 13.000 × g i 20 min ved 4 °C. Vask pelletsen med 1 ml kaldt (-20 °C), nylaget 75% etanol. Sentrifuge ved 8000 × g i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatanten med en P10-pipette for å unngå å forstyrre pelletsen.
- Lufttørk pelletsen i 10-15 min til det ikke er gjenværende etanol. Resuspend pellet i 50 μL DEPC-behandlet vann, tilsett 5 μL 10x DNase buffer + 1μL DNase (2 Enheter μL-1), og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Tilsett 0,1 volumer (5,6 μL) DNase inaktiveringsreagens, inkuber ved romtemperatur i 5 minutter, og bland forsiktig hvert minutt. Sentrifuge ved 13.000 × g i 2 min, og overfør supernatant til et nytt rør (~ 50 μL). Plasser røret på is umiddelbart mens du forbereder RT-qPCR- eller RT-LAMP-reaksjonene, eller oppbevar det i en -20 °C fryser.
MERK: Utfør RNA Isolation i et amlikonfritt rom for å unngå overføringsforurensning.
- Desinfiser overflater, utstyr og pipettorer med en løsning på 2 mM kobbersulfat og 3% hydrogenperoksid; etterfulgt av en løsning på 10% blekemiddel, 90 mM natriumbikarbonat, 5% SDS og 2,5% NaOH. Tørk grundig med destillert vann etterfulgt av 75% etanol.
- Multiplex omvendt transkripsjon sløyfe-mediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP)
- Forbered en 20X primerblandingsløsning (tabell 1) for hvert sett med primere (tabell 2). Forbered RT-LAMP reaksjonsblandingen (tabell 3) ved romtemperatur med 10% overskytende volum for å ta hensyn til pipetteringstap.
MERK: Den kolorimetriske LAMP 2X-masterblandingen med antarktisk termolabil uracil-DNA glykosylase (UDG) forhindrer forsterkning av DNA-forurensning fra tidligere reaksjoner20,28. - Virvel og spinn ned blandingen. Dispenser 20 μL av blandingen i hvert reaksjonsrør: prøve, spiked, positiv kontrollog negativ kontroll. Inkuber reaksjonene i rørene ved romtemperatur i 10 minutter slik at UDG kan virke på potensiell overførselsforurensning.
- Tilsett 5 μL RNA i prøvereaksjonen, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopier) syntetisk SARS-CoV-2 RNA til piggreaksjonen, 2,5 μL (450 kopier) syntetisk SARS-CoV-2 RNA-reaksjon på den positive kontrollreaksjonen og 5 μL H2O til den negative kontrollreaksjonen. Bland godt, og spinn ned reaksjonene; tine alle RNA på is.
- Mens termosyklisten, eller vannbadet, oppvarmes til 65 °C, må alle reaksjoner forbli ved romtemperatur. UDG vil bli inaktivert ved >50 °C. Plasser reaksjonene i termosykleren (bruk varmelokk), inkuber ved 65 °C i 40 minutter, og la reaksjonene nå romtemperatur (~22 °C i 5 minutter), eller avkjøl på is i 1 min. Analyser resultatene ved hjelp av den kolorimetriske funksjonen (enkel observasjon) eller ved å kjøre produktene i en agarose gel.
MERK: Selv om grensen for deteksjon (LOD) er 10 eksemplarer per reaksjon, øker deteksjonsfrekvensen etter hvert som kopinummeret nærmer seg 500 eksemplarer per reaksjon (figur 3A). For kolorimetrisk observasjon, vær oppmerksom på at et negativt resultat er indikert med rosa (pH = 8,8), mens et positivt resultat er indikert med gul (pH = 5) (Figur 3B). Det kolorimetriske alternativet unngår åpningen av RT-LAMP-rørene etter forsterkning, noe som vil redusere volumet av RT-LAMP-produktene i arbeidsmiljøet og overleveringsforurensning. For gelelektroforese, lag en 1,5% agarose gel med 1X DNA gel flekk i 0,5% Tris / Borate / EDTA (TBE) buffer. Last 25 μL av reaksjonen + 5 μL 6X lastefargestoff i hver brønn. Kjør gelen på 100 V i 60 min. En molekylær markør er ikke nødvendig, da positive prøver viser et stigemønster (Figur 3C).
- Forbered en 20X primerblandingsløsning (tabell 1) for hvert sett med primere (tabell 2). Forbered RT-LAMP reaksjonsblandingen (tabell 3) ved romtemperatur med 10% overskytende volum for å ta hensyn til pipetteringstap.
Representative Results
Prøver samlet inn av borgerforskere for påvisning av SARS-CoV-2. I løpet av en 8-måneders periode (midten av mars til den tredje uken i november 2020) ble 482 borgere godkjent for å delta i dette prosjektet, hvorav 350 (73%) ba om et sett. Totalt ble det levert 362 sett (dvs. noen deltakere ba om flere sett), og 246 (70%) ble returnert (Figur 4A,B). Alle de 4080 prøvene i disse settene ble behandlet. Innsamlingssteder ble fordelt over Nordkysten, Nord-Sentral, Sentral og Sørlige distrikter i fylket, samt noen få i de østlige distriktene (Figur 4A). Disse distriktene har den høyeste befolkningstettheten i San Diego County og de mest dokumenterte COVID-19-tilfellene, som rapportert av San Diego Human Health Service Agency39.
Borgere ba om henting av de fleste samplede sett (dvs. gjennomsnittlig suksessrate: 70,4%). Hver dag ble det bedt om 1-16 sett, og 0-14 sett ble returnert til laboratoriet (Figur 4B). En undersøkelse av borgerforskerne viste at samlingen av et komplett sett (16 prøver) tok 1-3 timer fordelt over et gjennomsnitt på 8 dager (Figur 4A og Tabell 4). Det store flertallet av settene var komplette (91,1 %), noe som betyr at de inneholdt en vattpinne inne i alle de 16 prøverørene, og de tilsvarende prøvedataene ble lastet opp til LIMS (Figur 4A og Tabell 4).
Påvisning av SARS-CoV-2 ved hjelp av GITC-kloroformutvinning og multipleks omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP). For den kolorimetriske RT-LAMP-analysen ble to sett med primere11,20,28 brukt til å målrette nukleocapsid (N2) og konvoluttgenene (E1) (tabell 2). Sekvensene anerkjent av disse primerne er i samme region som primerne og sondene godkjent av CDC40 og EU41 for menneskelig diagnose av COVID-19 av RT-qPCR. Disse resultatene bekrefter det Zhang et al.28 beskrev, der tilsetning av 60 mM guanidinhydroklorid til reaksjonen øker LOD når den kjøres i multipleks. LOD med en frekvens på 100% var 500 eksemplarer per 25 μL reaksjon (Figur 3A,B). I den kolorimetriske RT-LAMPen endret positive prøver farge fra rosa til gult på grunn av et pH-skift fra ~8 til 5,5 (figur 3B). Da reaksjonen ble oransje ved lave kopitall, ble prøver kjørt i en 1,5% agarose gel for å bekrefte at disse var positive og resulterte i et stigelignende mønster (Figur 3C). RT-LAMP ble brukt til å oppdage SARS-CoV-2 i samlede RNA-prøver.
For å kontrollere for falske negativer på grunn av reaksjonshemmere ble hver prøve testet i en ekstra reaksjon pigget med 500 kopier av syntetisk SARS-CoV-2. Positive samlede prøver ble forlatt ved å isolere RNA for hver enkelt prøve i bassenget og kjøre i en RT-LAMP-reaksjon for å bestemme identiteten til den positive prøven. Gjenkjenningsresultatene ble deretter lastet opp til LIMS der den unike prøve-IDen ble paret med informasjonen på dato, klokkeslett, GPS-koordinater, nettsted og bilde av prøven.
Sanntids og tradisjonelle RT-PCR-metoder: hemming av prøveforurensninger. For å velge den beste metoden som passer for den foreslåtte deteksjonsrørledningen, ble andre RNA-forsterkningsmetoder testet med miljøprøver samlet inn av en pilotkohort av borgerforskere. Eksempler på resultatene av hver av disse metodene er presentert i figur 5 for å skildre deres følsomhet overfor miljøhemmere og bakgrunnssignalstøy ved lave virale kopinummerkonsentrasjoner.
Seks RT-qPCR-formuleringer (Materialfortegnelse) godkjent av CDC og WHO ble testet for påvisning av viruset på miljøprøver. Protokoller ble fulgt i henhold til produsentens instruksjoner samt CDC-retningslinjer for påvisning av SARS-CoV-2 i kliniske innstillinger40. Reaksjoner som inneholdt ulike konsentrasjoner av syntetiske SARS-CoV-2 RNA-kontroller ble pigget inn i swabbed-overflateprøver etter rå RNA-isolasjon. Alle masterblandinger var følsomme for hemmere ved LOD-konsentrasjoner av den positive kontrollen (figur 5A).
For å omgå hemmere av disse sanntidsteknologiene ble et tradisjonelt RT-PCR-system testet. Et ett-trinns RT-PCR-system (Materialfortegnelse) ble brukt til å forsterke nukleocapsid-genet ved hjelp av primersettene N1, N2og konvoluttgenet ved hjelp av primersettet E1 godkjent av henholdsvis CDC (USA) og ECDC (EU) . Protokoller ble fulgt i henhold til produsentens instruksjoner samt CDC-retningslinjer for påvisning av SARS-CoV-2 i kliniske innstillinger40. Primeren setter N1 og N2 designet av CDC gir et ~ 70 bp produkt; Positive tall med lav kopi skiller seg imidlertid ikke fra bakgrunnsstøyen for forsterkning av den negative kontrollen (Figur 5B), som introduserte falske positiver i resultatene. Produktet av E1-primerne hadde et svakt signal ved lavt kopinummer (figur 5B), og introduserte falske negativer i resultatene. Videre var RT-PCR-metoden som ble testet fortsatt følsom for hemmere som finnes i miljøprøvene (data ikke vist).
Andre metoder er utviklet for å oppdage svært små mengder målsekvens. En av disse metodene er Rolling Circle Amplification (RCA), hvorpå anerkjennelse av målsekvensen, RNA eller DNA, av en bestemt lineær sonde, en ligase sirkulariserer malen. Ved hjelp av primere designet for å hybridisere med sonden, forsterker en DNA-polymerase med strandforskyvningsaktivitet sonden i en isotermisk reaksjon42. Det er sonden som identifiserte målet, som forsterkes, og ikke målsekvensen, noe som gjør denne metoden svært følsom43. Wang et al.44 publiserte en RCA-protokoll for direkte deteksjon av SARS-CoV-1 RNA. Metoden ble endret for å bruke primere som er spesifikke for SARS-CoV-2. Dessverre, i ikke-malkontrollen (NTC), sirkulariserer og gir sonden produkt i fravær av RNA-mal, selv når du bruker et bredt utvalg av ligaer, inkludert en SNP-sensitiv ligase. I mangel av ligaer viste ikke NTC forsterkning fra den lineariserte sonden (Figur 5C).
Figur 1: Nettbasert prøvetakingsplattform med grensesnitt for eksempelinnsamlingsdata for mobile enheter. (A) Et nettsted, som inneholder en flerspråklig plugin, ble opprettet for å formidle samspillet mellom laboratoriet og borgerforskerne. Plattformen ble brukt til eksempelpakkelevering / henteforespørsel og eksempeldatainnsending. Plattformen inneholdt detaljerte engelske / spanske grafiske og audiovisuelle prøvetakingsprotokoller. (B) Visning av mobilenheter som brukes til å laste opp eksempeldata: dato, klokkeslett, GPS-koordinater, eksempelområdebeskrivelse og et bilde av samlingsområdet. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; GPS = Globalt posisjoneringssystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prøvesamlingssett. Borgerforskere mottok en kjøler som inneholdt to ispakker, et sikkerhetsdatablad for å informere frivillige om farene ved å håndtere GITC-løsningen, en detaljert prøvetakings- og maskebærende protokoll, en KN95-maske, en avfallspose, en sprayflaske med hånddesinfeksjonsmiddel, en sprayflaske med 0,5% SDS, 16 par hansker, en liten pose med 16 tannpirkere og 16 polyesterpinner, 16 forhåndsmerkede mikrocentrifugerør som inneholder 200 μL GITC-løsning, en boks som inneholder prøvetakingsrørene og en pose som brukes som sekundærbeholder for rørboksen i tilfelle søl. Forkortelser: GITC = guanidinium thiocyanate; SDS = natrium dodecylsulfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Multiplekset omvendt transkripsjonSløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP) analyse. Multipleksede reaksjoner ved hjelp av primere for SARS-CoV-2 nukleocapsid (N2) og konvoluttgener (E1) for å oppdage så få som 10 kopier av viruset i reaksjonen. Syntetisk SARS-CoV-2 RNA ble brukt som positiv kontroll. (A) Frekvens for deteksjon i multipleks kolorimetrisk RT-LAMP av SARS-CoV-2 ved forskjellige genomkopieringsnumre per reaksjon. Gjennomsnittsverdien av fem replikerer i rosa. (B) Grense for deteksjon (LOD) av SARS-CoV-2 i multipleks kolorimetrisk RT-LAMP; gul = positiv (pH ~5); rosa = negativ (pH ~8). (C) Stigemønster av positive SARS-CoV-2 RT-LAMP reaksjoner i 1,5% agarose gel elektroforese. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; rxn = reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Plassering av prøvetakingssett for borgerforskere i San Diego County og suksessrate for forespurte sett. (A) Oransje prikker representerer plasseringen av 1 prøvetakingssett, som inneholder 16 prøver. Det blå sektordiagrammet viser prosentandelen sett som tok forskjellige dager fra de ble levert til borgerforskerne til da de ble returnert til laboratoriet. Antall dager i parentes. Diagrammet for oransje sektor viser prosentandelen av sett med forskjellig antall fullførte prøver fra totalt 16 utvalg. Antall fullførte prøver som inneholder en vattpinne inne i prøverøret og tilsvarende prøvetakingsdata lastet opp til LIMS i parentes. (B) Prosentandel av sett som ble returnert til laboratoriet (prikker), og totalt antall forespurte sett (barer), i forhold til datoen da settet ble forespurt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Alternative SARS-CoV-2 RNAdetection-metoder. (A) RT-qPCR deteksjon av SARS-CoV-2 nukleocapsid (N) gen ved hjelp av primer sett N2. Samlede miljøprøver toppet med 900 (grønn) eller 9 (oransje) kopier av SARS-CoV-2. Positive kontroller av de samme kopinumrene i blått. Pil indikerer nedgangen i fluorescensdeteksjon av lavt kopinummer positiv kontroll når miljøprøven er til stede. (B) Tradisjonell RT-PCR-deteksjon av SARS-CoV-2. Topp: RT-PCR-produkter av nukleocapsid genet ved hjelp av primer sett N1 og N2. Et svakt bakgrunnssignal observeres i kontroll uten mal. Bunn: RT-PCR-produkter av konvoluttgenet ved hjelp av primersett E1. Svært lavt signal observeres ved LOD-konsentrasjonen. Blå piler viser forventet positivt produkt: (topp) ~ 70 bp og (bunn) 113 bp i 2% agarose gel elektroforese. (C) RCA for SARS-CoV-2 RNA. Sirkulær sonde forsterker i nærvær av ligaer og fravær av RNA-mal (NTCcir); i fravær av ligase og RNA mal lineær sonde forsterker ikke (NTClin). Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2; RFU = relative fluorescensenheter; bp = basispar; rxn = reaksjon; MM = molekylær markør; RT-PCR = omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon; RT-qPCR = sanntids kvantitativ RT-PCR; RCA = rullende sirkelforsterkning; NTC= kontroll uten mal. LOD = deteksjonsgrense; rxn = reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| grunning | 20x konsentrasjon (μM) | 1x konsentrasjon (μM) |
| Fip | 32 | 1.6 |
| BIP | 32 | 1.6 |
| F3 | 4 | 0.2 |
| B3 | 4 | 0.2 |
| LøkkeF | 8 | 0.4 |
| GjentaB | 8 | 0.4 |
Tabell 1: Formulering for 20X RT-LAMP primerblanding. I RT-LAMP-reaksjonen gjenkjenner 6 primere 8 regioner av det målrettede DNA-et. Forkortelser: omvendt transkripsjon loop-mediert isotermisk forsterkning; FIP = fremre indre primer; BIP = bakover indre primer; F3 = fremoverforskyvning primer; B3 = bakoverforskyvning primer; LoopF = fremover sløyfe primer; LoopB = bakoversløyfeprimer.
| grunning | sekvens | mål | Produktstørrelse | |||
| RT-LAMPE9,18,19 | ||||||
| E1-F3 | TGAGTACGAACTTATGTACTCAT | E | stigelignende mønster | |||
| E1-B3 | TTCAGATTTTTAACACGAGAGT | |||||
| E1-FIP | ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTTCGTTCGGAAGAGACAG | |||||
| E1-BIP | TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT | |||||
| E1-LøkkeB | GCGCTTCGATTGTGTGCGT | |||||
| E1-LøkkeF | CGCTATTAACTATTAACG | |||||
| N2-F3 | ACCAGGAACTAATCAGACAAG | N | ||||
| N2-B3 | GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT | |||||
| N2-FIP | TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC | |||||
| N2-BIP | CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA | |||||
| N2-LøkkeF | GGGGGCAAATTGTGCAATTTG | |||||
| N2-løkkeB | CTTCGGGAACGTGGTTGACC | |||||
| RT-qPCR38 | ||||||
| 2019-nCoV_N1-F | GACCCCAAAATCAGCGAAAT | N | 72 bp | |||
| 2019-nCoV_N1-R | TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG | |||||
| 2019-nCoV_N1-P | 5'-FAM-ACC CCG KATT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3' | |||||
| 2019-nCoV_N2-F | TTACAAACATTGGCCGCAAA | N | 67 bp | |||
| 2019-nCoV_N2-R | GCGCGACATTCCGAAGAA | |||||
| 2019-nCoV_N2-P | 5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3' | |||||
| RT-PCR39 | ||||||
| E1_Sarbeco_F | ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT | E | 113 bp | |||
| E1_Sarbeco_R | ATATTGCAGCAGTACGCACACACA | |||||
Tabell 2: Primere som brukes til RT-LAMP, RT-qPCR og RT-PCR. Primersekvenser, målgen, forventet produktstørrelse og tilsvarende referanse er oppført. Forkortelser: RT-LAMP = omvendt transkripsjon loop-mediert isotermisk forsterkning; RT-PCR = omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon; bp = basispar; RT-qPCR = sanntids kvantitativ RT-PCR; E1 = konvoluttgen; N2 = nukleocapsid gen; F = fremoverprimer; R = omvendt primer; P = Sonde ; FIP = fremre indre primer; BIP = bakover indre primer; F3 = fremoverforskyvning primer; B3 = bakoverforskyvning primer; LoopF = fremover sløyfe primer; LoopB = bakoversløyfeprimer.
| Reagent | Volum (μL) |
| WarmStart Kolorimetrisk LAMPE 2X Master Mix med UDG | 12.5 |
| N2 Primer Mix (20x) | 1.25 |
| E1 Primer Mix (20x) | 1.25 |
| Guanidinhydroklorid (600 mM)* | 2.5 |
| Mål RNA | 5 |
| Nukleasefri H2O | 2.5 |
| Totalt volum | 25 |
Tabell 3: Reaksjonsmasterblanding for multipleks kolorimetrisk RT-LAMP. (*) Guanidinhydroklorid har vist seg å øke følsomheten og hastigheten på reaksjonen ved en ukarakterisert mekanisme28. Forkortelser: LAMP = loop-mediert isotermisk forsterkning; UDG = uracil-DNA glykosylase; N2 = nukleocapsid gen; E1 = konvoluttgen; DEPC = dietylpyrokarbonat.
| Godkjente borgere | Borgere som ba om et sett | Leverte sett | Returnerte samplede sett | Dager dedikert til prøvetaking | % fullførte sett | % Ufullstendige sett | Behandlede prøver | |
| 482 | 72.6% (350/482) | 362 | 70.4% (255/362) | bety | 8 | 91.1 (224/246) | 8.9 (22/246) | 4,080 |
| Median | 3 | |||||||
Tabell 4:Swabbing for SARS-CoV-2 etter tallene. Oppsøkende og prøvetaking av suksessrater. Forkortelse: SARS-CoV-2 = alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2.
Discussion
Borgerforskerens engasjement. Borgerforskere ble rekruttert til vattpinneflater i hele San Diego County for å prøve og oppdage tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 i bymiljøet. De fleste leverte prøvetakingssett (70 %) ble returnert til laboratoriet, og av disse var nesten alle prøver fullført (91%) (Figur 3A,B og Tabell 4). Frivillige kan enkelt be om levering/henting av sett gjennom den nettbaserte plattformen, og programvaren for planlegging av leveringsrute varslet borgerforskere om estimerte ankomsttider, begge sannsynligvis betydelige faktorer for den observerte suksessen. Gjennomsnittstiden fra da settet ble levert til borgerforskeren til da det ble returnert til laboratoriet var 8 dager, med en median på 3 dager og en rekkevidde på 1-64 dager (Figur 3A og Tabell 4). Hyppigere påminnelser til frivillige vil sannsynligvis redusere denne forsinkelsen.
Datainnsamlingsplattformen ble vellykket brukt av et stort flertall av brukerne (73%) (Tabell 4). Mens innsatsen til borgerforskerne ikke ble målt, viste felttester at datainnsamlingsplattformen reduserte innsatsen og tiden som kreves for å fullføre prøveinnsamlingen betydelig. Dermed oppmuntret reduksjon av mengden bokføring borgerforskerengasjement. Den nettbaserte plattformen hadde til hensikt å overvinne demografiske begrensninger ved å tilby en flerspråklig nevral maskinoversettelsestjeneste og ved å tilby grafiske og audiovisuelle protokoller på engelsk og spansk. Dette var bare delvis vellykket ettersom færre prøver ble samlet inn fra både South Bay og North County hvor det meste av fylkets latinamerikanske / latino befolkning bor45. Disse områdene inneholdt også 63% (1700 tilfeller per 100,000) av de totale COVID-19-tilfellene i San Diego County med høyest utbredelse av sykdommen46 og sykehusinnleggelser (62%)47,48. Selv om de fleste prøvene kom fra Central County, ble det samlet inn et representativt antall fra de mest COVID-19-berørte distriktene, og bare en liten brøkdel av prøvene var positive, noe som tyder på at overflatereservoarene til SARS-CoV-2 i bymiljøet er relativt sjeldne.
Eksempelbehandling. Prøvetaking av vattpinner ble fuktet med SDS, som inaktiverte viruset ved å forstyrre konvolutten og stabiliserte den nakne RNA ved å utfolde RNases32. Praktisk under oppsamlingen renset vaskemiddelet i vattpinnen den prøvede overflaten. Miljøprøver inneholder ofte svært små mengder RNA. For å maksimere utvinningen ble RNA-isolasjon utført ved hjelp av en GITC-basert, kolonnefri, rå utvinningsmetode. GITC, et sterkt chaotropisk middel, forstyrrer hydrogenbindingene som opprettholder proteinfolding (dvs. hydrofob effekt). Denne handlingen resulterer i inaktivering av viruspartikler, og RNA forblir stabil på grunn av hemming av RNAses34,35,36. GITC-løsningen opprettholdt stabiliteten til RNA-prøvene uten strenge hensyn i kjølekjeden, noe som gjorde det mulig for innbyggerne å opprettholde prøvene ved romtemperatur hvis en fryser for de medfølgende ispakkene ikke var tilgjengelig. For å redusere den potensielle faren dette reagenset utgjør når direkte hud- eller slimhinnekontakt oppstår, ble innbyggerne gjort oppmerksomme på disse risikoene ved å inkludere et materiell sikkerhetsdatablad som er gitt i settet, og en advarselsforsegling ble plassert i esken som inneholder rørene.
Den rå GITC-kloroformutvinningsmetoden hjalp til med å gjenopprette spor av RNA fra vattpinnene, og som vist ved forsterkning av spikede prøver, fortsatte inhibitorer sjelden i prøvene etter utvinning. Prøver, som var negative for SARS-CoV-2 og ikke viste noen RT-LAMP-hemming, representerte sanne negativer eller hadde et lavere kopinummer enn LOD med 100% frekvens. Omvendt innebærer påvisning av viral RNA på en overflate ikke direkte risiko for overføring gjennom kontakt, da virusets infektivitet fra positive prøver må testes. Rask screening av miljøet, ikke begrenset av tilgjengeligheten av sofistikerte forsyninger eller høyt kvalifisert personell, er avgjørende for å vurdere om overflater utgjør et viralt reservoar og for bedre direkte forebygging og inneslutning.
RT-LAMP ble valgt for å være den beste metoden som passer for den foreslåtte deteksjonsrørledningen. Det viste seg å være en rask og billig metode som var svært motstandsdyktig mot de fleste av de gjenværende inhibitorene og like følsomme og spesifikke som andre RT-qPCR-metoder. På grunn av deres bruk i kliniske omgivelser under SARS-CoV-2-pandemien, ble tilgjengeligheten av RT-qPCR-sett påvirket av global etterspørsel. Videre var RT-qPCR-teknikker - selv de som er formulert for å motstå inhibitorer - følsomme for stoffer som finnes i miljøprøvene samlet inn av en pilotkohort av borgerforskere, selv etter bruk av andre vanlige strategier for å redusere hemmerkonkurransen for enzymbinding49. Disse funnene er bekreftet av en nylig studie som sammenlignet begge metodene for å oppdage SARS-CoV-2 på vattpinneprøver fra godteri håndtert av COVID-19-pasienter og fant over 83% resultatkonkordans, med 25% lavere hemming i prøver analysert av RT-LAMP15. Videre reduserte GITC-kloroform råoljeutvinning, kombinert med RT-LAMP, kostnadene for reagenser og forsyninger med 42% sammenlignet med RNA-kit ekstraksjon og RT-qPCR (Materialliste).
Denne metoden tillot høy gjennomstrømningsanalyse av tusenvis av overflatepinneprøver. Opptil 80 bassenger, som representerer 640 prøver, ble behandlet på 2 dager fra RNA-ekstraksjon til SARS-CoV-2-deteksjon av RT-LAMP. Den foreslåtte protokollen er semikantiv, begrenset til påvisning av viral RNA, og indikerer ikke tilstedeværelsen av infektive viruspartikler. Videre analyse er nødvendig for å vurdere risikoen for overføring av SARS-CoV-2 fra infiserte fomitter tilstede på de vattlagte overflatene.
Denne studien presenterer en protokoll for raskt å sette opp en teststrategi som inkluderer en effektiv arbeidsflyt når du står overfor en helsekrise med en smittsom sykdom. Den foreslåtte prøvetakingsprotokollen er enkel og bruker forsyninger som vanligvis finnes i husholdninger, og virusdeteksjonsmetoden utføres på utstyr som er tilgjengelig i grunnleggende laboratorieinnstillinger som et vannbad i stedet for en termocycler. Kostnadene for RT-LAMP-reagenser er betydelig lavere enn de som trengs for RT-qPCR og mindre utsatt for scenarier med høy global etterspørsel. Denne studien fungerer som et rammeverk for vurdering av miljømessige virale reservoarer i fremtidige epidemiutbrudd og globale pandemier.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at det ikke finnes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Etterforskerne av Viral Information Institute (VII), Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin og Dr. Jennifer Smith for å ha tatt seg tid til å samle inn mange prøver. Vi takker også Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre og Dr. Sarah Allard fra barneavdelingen ved School of Medicine University of San Diego California (UCSD) for å legge til rette for positive kontroller og nyttige tilbakemeldinger. Vi takker Stacey Carota (SDSU College of Sciences) og Gina Spidel (SDSU) for logistisk støtte og Juan Rodríguez for kunsten og den grafiske utformingen av prøvetakingsprotokollen. Vi takker alle deltakere for deres engasjement og engasjement for dette prosjektet i svært vanskelige tider. Dette arbeidet ble støttet av en sjenerøs donasjon fra Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) og National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Award Number: 2030479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMP, LIMS, and community outreach: | |||
| Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
| Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
| Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
| Database software | MySQL | ||
| Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
| Free email service | Google Email | ||
| Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
| Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
| Online form | Google Form | ||
| Operating system | Linux | ||
| Web and database development | Big Rose Web Design | ||
| Web server software | Apache | ||
| Sampling kit: | |||
| Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
| Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
| Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
| Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
| Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
| KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
| Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
| 30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
| RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
| Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
| Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
| Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
| Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
| Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
| Trizol RNA extraction: | |||
| Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
| GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
| Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
| Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
| Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
| Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
| RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
| RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
| Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
| WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
| Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
| Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
| Kit for RNA extraction: | |||
| QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
| RT-qPCR: | |||
| Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
| qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
| QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
| QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
| UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
| Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
| RT-PCR: | |||
| SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
| Lab cleanup: | |||
| DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
| RNAZap | Invitrogen | AM9780 | |
References
- Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
- Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730 (2020).
- Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
- Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
- Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
- How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
- Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
- Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
- Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
- Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
- Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
- Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437 (2018).
- Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
- Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074 (2020).
- Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
- Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
- Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
- Broughton, J. P., et al.
- Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
- Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
- Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
- Notomi, T., et al.
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
- Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Wallace, D. M.
- COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
- CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
- Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045 (2020).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
- Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
- Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
- Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
- COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
- COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
- COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
