Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/62379
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

Summary

פרויקט מדעי אזרחי תוכנן לגייס את תושבי סן דייגו לאסוף דגימות סביבתיות עבור SARS-CoV-2. פלטפורמה רב-לשונית מבוססת אינטרנט נוצרה לשליחת נתונים באמצעות ממשק מכשיר נייד ידידותי למשתמש. מערכת ניהול מידע במעבדה אפשרה איסוף של אלפי דגימות מגוונות גיאוגרפית עם מעקב אחר תוצאות בזמן אמת.

Abstract

כדי לשלוט בהעברת הקהילה של תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) במהלך המגפה העולמית 2020, רוב המדינות יישמו אסטרטגיות המבוססות על בדיקות אנושיות ישירות, כיסוי פנים וחיטוי משטחים. תחת ההנחה כי נתיב השידור העיקרי כולל אירוסולים וטיפות נשימה, המאמצים לאתר SARS-CoV-2 ב fomites התמקדו במקומות החשודים בשכיחות גבוהה (למשל, מחלקות בית חולים, ספינות שייט, ומערכות הסעת המונים). כדי לחקור את נוכחותם של SARS-CoV-2 על משטחים בסביבה העירונית כי הם לעתים רחוקות ניקה ורק לעתים רחוקות חיטוי, 350 אזרחים גויסו ממחוז סן דייגו רבתי. בסך הכל, מדענים אזרחיים אלה אספו 4,080 דגימות. פלטפורמה מקוונת פותחה כדי לפקח על משלוח ערכת דגימה ואיסוף, כמו גם לאסוף נתונים לדוגמה. ערכות הדגימה נבנו ברובן מאספקה הזמינה בחנויות לחוצות מגפה. דגימות עובדו באמצעות ריאגנטים שהיו קלים לגישה למרות המחסור החוזר ונשנה באספקה. השיטות בהן נעשה שימוש היו רגישות מאוד ועמידות בפני מעכבים הנמצאים בדרך כלל בדגימות סביבתיות. שיטות התכנון והעיבוד הניסיוניות המוצעות הצליחו לערב מדענים אזרחיים רבים שאספו ביעילות דגימות משטחים מגוונים. זרימת העבודה והשיטות המתוארות כאן רלוונטיות לסקר את הסביבה העירונית עבור וירוסים אחרים, אשר מהווים דאגה לבריאות הציבור ומהווים איום למגפות עתידיות.

Introduction

SARS-CoV-2 הוא חשב להיות מועבר בעיקר באמצעות שאיפה של אירוסולים מזוהמים טיפות ממגע ישיר עם אנשים נגועים1,2,3,4. עם זאת, בשלבים הראשונים של מגפת COVID-19 העולמית, המאמצים לשלוט בהעברת SARS-CoV-2 התמקדו מאוד בחיטוי משטחים, שטיפת ידיים וחיטוי. עד סוף 2020, הנחיות שידור מארגון הבריאות העולמי (WHO)5 והמרכזים האמריקניים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC)6 נחשבים שידור מוטס סכנה בעיקר כאשר במגע הדוק (<2 מ ') עם אדם נגוע או בנוכחות הליכים רפואיים מייצרי תרסיס. חיסון עצמי לאחר מגע עם משטחים מזוהמים או שאיפה של fomites תרסיס עדיין לא נשללו כמסלול של שידור של SARS-CoV-2.

דווח על מקרי COVID-19 שבהם שידור מוטס נראה לא סביר7,8. SARS-CoV-2 virions להישאר זיהומיות על נחושת עד 8 שעות, על קרטון ופלדת אל-חלד עד 24 שעות, ועל פלסטיק עד 48 שעות9. בבקתות ספינות תענוגות, SARS-CoV-2 RNA זוהה 17 ימים לאחר שהנוסעים יצאו7. דגימות אוויר ומשטח מבתי חולים ומערכות הסעת המונים נמצאו חיוביות לסארס-CoV-2 ולנגיף קורונה אחר8,10,11,12,13,14. מחקר שנערך על האריזה החיצונית של ממתקי ליל כל הקדושים שטופלו על ידי חולי COVID-19 אסימפטומטיים ומתונים/סימפטומטיים במקצת, הגיע למסקנה כי השילוב של שטיפת ידיים על ידי המטפל ושטיפת הממתקים עם סבון ידיים הפחית את ה- SARS-CoV-2 RNA לרמותסף נמוכות יותר 15.

מספר שיטות לאבחון SARS-CoV-2 פורסמו בהתבסס על תגובת שרשרת פולימראז הפוכה בזמן אמת (RT-qPCR)16,17, הגברה איזותרמית בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP)11,18,19,20,21, ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 ,19,22,22 , 20,ו CRISPR-Cas טכנולוגיות18, רובם דורשים ערכות מיצוי RNA שלעתים קרובות נמצאות במחסור בתקופות של ביקוש עולמי משמעותי, ומעט מאוד שימשו לבדיקה סביבתית של הנגיף24. הגילוי של SARS-CoV-2 RNA באמצעות RT-LAMP הוכח להיות מעל 83% קונקורדנטי לשימוש RT-qPCR. יתר על כן, RT-LAMP הביאה לירידה של 25% בתוצאות חד משמעיות בהשוואה ל- RT-qPCR15.

RT-LAMP היא טכניקה פשוטה המשתמשת שעתוק הפוך לסנתז cDNA מתבנית RNA25, ואחריו פולימראז DNA עם פעילות עקירת גדילים חזקה כי מסנתז DNA בטמפרטורה קבועה (כלומר, הגברה isothermal)26. ספציפיות גבוהה יותר של גילוי גנום ויראלי מושגת באמצעות ארבעה או שישה פרייומרים המזהים שישה או שמונה אזורים של ה- DNA היעד. הגברה מתחילה מפריימר פנימי ומניבה מבנה דנ"א דו-גדילי למחצה. הגדיל המוביל מוגבר לאחר מכן על ידי פריימר חיצוני. הגברות אלה חוזרות על עצמן עבור פריימרים הפוכים. פריימרים פנימיים וחיצוניים משני הקצה יש אתר פנימי הפוך משלים עצמי היוצר לולאה במוצר הגברה26,27. בתזוזת גדילים איסותרמית, סינתזת DNA אסינכרונית מייצרת כמויות גבוהות של מוצר מוגבר שבו פולמור מתמשך מגביר את האות של כמה 10 עותקים לכלתגובה 11,20,28. תערובת RT-LAMP הצבעונית היא מאגר חלש ומשתמשת באדום פנול כמחוון pH. כמו פולימראז משלב נוקלאוטידים, הוא משחרר פרוטון, מספיק פרוטונים ישנו את ה- pH של הפתרון, כמו גם את צבעו מוורוד לצהוב11,20,28,29.

RT-LAMP פותחה לגילוי מחלות המועברות על ידי יתושים במתקני בריאות היקפיים שאין בהם מעבדות מאובזרות25 ולזיהוי מהיר של נגיפי RNA אחרים כמו וירוס כשל חיסוני אנושי30. האוכלוסיות הפגיעות ביותר בהתפרצויות מגיפה – לפי הגדרת ארגון הבריאות העולמי – חסרות לעתים קרובות מספיק משאבים כלכליים ואת הציוד המתאים לביצוע איתור (סדר היום של האו"ם לבריאות הציבור העולמית). במגפת SARS-CoV-2 הנוכחית, אספקה כגון ספוגיות ברמה רפואית ריאגנטים עבור ערכות מיצוי RNA לא הצליחו לענות על הביקוש העולמי, במיוחד במדינות שאינן ייצור. הפרוטוקול המוצע השתמש בחילוץ RNA גולמי מבוסס guanidinium thiocyanate (GITC), אשר למעשה שימר את ה- RNA באופן עצמאי בשרשרת קרה והפחית באופן משמעותי את ההתמדה של מעכבים מהמדגם. יתר על כן, פרוטוקול החילוץ GITC-chloroform מבוסס על הפרדת RNA מ- DNA וחלבונים ואחריו המשקעים המתאימים, המאפשר התאוששות של רוב החומר הגנטי. יתרונות אלה עולים על הסיכונים הפוטנציאליים של מדענים אזרחיים המטפלים בכימיקל אם ננקטים אמצעים כדי ליידע אותם כראוי על הסיכונים.

זרימת העבודה המוצעת משתמשת בחומרים ובריאגנטים הנמצאים בשימוש כללי. זה דורש ציוד זמין בסיסי, לעתים קרובות כפרי, הגדרות מעבדה. שיטות אלה הן זולות, עמידות מאוד מעכבים נמצא לעתים קרובות דגימות סביבתיות או דגימות שלא ניתן לעבד עם ערכות החילוץ, ולחסל את הצורך תרמוציקלר דיוק גבוה. מחקר זה מציג צינור לדגימה וגילוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים על משטחים נפוצים שנגעו בהם ורק לעתים רחוקות מחוטאים של משקי הבית והסביבה העירונית.

Protocol

עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה מפורטת של ריאגנטים וחומרים מתכלים, כולל מספרי קטלוג, יצרן ועלויות תואמות.

1. דגימת הסביבה העירונית

  1. סיוע למדען אזרחי
    1. לגייס מדענים אזרחיים באמצעות קריאה ישירה וברורה לפעולה שפורסמו באמצעות מדיה מקומית וחברתית. צור מזהה ייחודי (למשל, #swab4corona)כדי לחבר את הנושא בין תוכן מדיה חברתית.
    2. צור חשבון דוא"ל לתקשורת ישירה בין צוות המעבדה לבין כל מדען אזרחי, המנוהל על ידי אדם דובר את השפות העיקריות של אזור העניין (למשל, ספרדית ואנגלית עבור מחוז סן דייגו).
    3. בנה פלטפורמת ניהול מדגם מבוססת אינטרנט מאובטחת (SMP) שתשמש כמסד נתונים, מערכת לניהול מידע במעבדה (LIMS) ותתקשר עם מדענים אזרחיים.
      הערה: ה- SMP מספק מיקום מרכזי שבו משתמשים מבקשים ערכה, ניגשים לפרוטוקולי איסוף לדוגמה, שולחים מטה-נתונים לדוגמה ומבקשים איסוף עבור ערכות לדוגמה שהושלמו.
    4. צור קישור ל- SMP (לדוגמה, https://demo.covidsample.org/) (איור 1) כדי שאנשים יגישו בקשה להשתתף במאמץ הדגימה הסביבתית על-ידי מענה לשאלות הקשורות ל-biosafety שצוינו בטופס מקוון.
    5. גישה מאובטחת ל- SMP באמצעות ממשק אימות תיכנות יישומים המתאפשר על-ידי ספק שירותי מחשב בענן. הענק למשתמשים שאושרו גישה ל- SMP.
      הערה: עיין בספרות לקבלת תיאור של פרוטוקול OAuth 2.031 לצורך אימות ואישור. הוא מספק תהליך כניסה ללא חיכוך למתנדבי מדען אזרחי. היא גם מאפשרת למשתמשים להיכנס באמצעות חשבון קיים, ומבטלת את הצורך ליצור פתרון כניסה מותאם אישית ולנהל אישורי משתמש, דבר החוסך זמן רב ומעודד השתתפות. על פי הדיווחים האחרונים, לשירות הדוא"ל החינמי הזמין עבור ספקית שירותי המחשבים בענן שנבחרה יש כ-1.5 מיליארד משתמשי דוא"ל פעילים מדי חודש; דרישת חשבון דואר אלקטרוני מספק שירות זה להשתתפות אינה נחשבת לגורם מרתיע.
    6. הסבר את מטרת המחקר ושיקולי ההסתעפות הביולוגית למדענים האזרחיים ב- SMP לפני שהם מבקשים את הערכה הראשונה שלהם. ספק תוסף רב לשוני כדי לאפשר ניווט בכל אחת מהשפות הזמינות משירות תרגום מכונה עצבי רב לשוני בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן.
    7. כלול במקטע הדגימה פרוטוקולים גרפיים ושמעיים באנגלית ובספרדית.
    8. הקצה מזהה ייחודי לכל ערכה ועצב את ממשק המשתמש כך שישתמש בלחצנים המקושרים למזהה לדוגמה כדי לייעל את תהליך הזנת הנתונים (איור 1A).
    9. השתמש בתוכנת תכנון נתיב מסירה עם יישום מכשיר נייד שישמש נהגים כדי לייעל את נתיבי המסירה / איסוף ולהודיע למדענים אזרחיים על זמני הגעה משוערים מדויקים.
    10. בנה את פלטפורמת LIMS על מחסנית של שירות אינטרנט PHP, וארח אותה בפלטפורמת אירוח מסחרית (מערכת הפעלה מוצעת, תוכנת שרת אינטרנט ותוכנות מסד נתונים מפורטות בטבלת החומרים).
    11. ספק ממשק יישומים מאובטח מבוסס אינטרנט כדי לאפשר לאנשי המעבדה לנהל נתונים במהירות ובקלות ב- LIMS. ספק תצוגה חזותית של נתונים באמצעות ממשק תיכנות יישומים של יצירת תרשימים של נתונים המתאפשר על-ידי ספק שירותי מחשב בענן.
    12. דמיין נתונים גאו-מרחביים באמצעות ממשק תכנות יישומים גאו-מרחבי בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן. אחסן את הנתונים שנשלחו ל- LIMS באמצעות ה- SMP כדי להקל (1) על אחסון מרכזי של נתוני פרוייקט; (2) מעקב אחר זרימות עבודה לדוגמה/עיבוד נתונים; ו-(3) ניהול הלוגיסטיקה של הפצת ערכות מדגם למדענים אזרחיים.
    13. מטה-נתונים שנשלחו מאובטחים באמצעות שיטות עבודה מומלצות (למשל, https://demo.covidsample.org/).
    14. טען מראש מידע כגון מזהה ערכת לדוגמה, מזהה לדוגמה, תאריך, שעה וקואורדינטות של מערכת מיקום גלובלית (GPS) (שנאסף באופן אוטומטי מתמונה של האתר) כדי לאפשר תאימות של סוגי נתונים ולמזער את השליחה של נתונים שגויים או חסרים על-ידי המשתמש (איור 1B). כלול את השדות הבאים שיש למלא באופן ידני ומהיר (<1 דקות) על ידי המדען האזרחי: תאריך ושבת איסוף, תיאור קצר של המיקום ותמונה של אתר הדגימה.
    15. תחטא את כל הנתונים שהועלו ואמת עבור סוג נתונים. לדוגמה, אמת נתוני תמונה שהועלו על-ידי משתמשים כדי לבחור קבצי .jpg, לשנות את שמם עם מזהה לדוגמה לצורך שיוך מהיר לדוגמה ולאחסן תמונות שהועלו במיקום מאובטח נפרד שאינו נגיש למשתמשים.
    16. הפעל את האפשרות לבקש מסירה ואיסוף של ערכות לאחר השלמת כל הדגימות (16). בנוסף, הפעל את האפשרות לבקש מסירת ערכה חדשה בעת איסוף הערכה הקודמת (איור 1A).
      הערה: עבור מתנדבים המעדיפים פלטפורמה שאינה מבוססת אינטרנט ועבור אלה המודאגים מחשיפת מיקום ה- GPS שלהם (למשל, חברי הקהילה המודאגים ממצבם הנודד), ניתן לספק ערכות במיקום מפגש מוסכם ומתנדבים התבקשו להקליט גרסה כתובה של איסוף הנתונים. לתקשורת בין המעבדה לבין כל מדען אזרח, יש חבר דו לשוני בפרויקט זמין לשיחות טלפון וטקסטים.
  2. ספוגית לקורונה
    1. זהה חלון זמן רלוונטי מבחינה אפידמיולוגית למאמץ הדגימה.
    2. בנה ערכה המכילה את כל ציוד הדגימה, כולל ציוד המגן האישי הדרוש (כלומר, מסכה, כפפות), פרוטוקול דגימה ומידע רלוונטי לאבטחה ביולוגית(איור 2). קדם-תווית לכל צינור עם המזהה הייחודי שהוקצה (מזהה לדוגמה).
    3. ספוגית לעתים רחוקות חיטוי משטחים החשופים fomites אירוסולים במשקי בית ובסביבה העירונית.
      1. לבשו את המסכה שסופקה בפומבי וזוג כפפות חדש לאיסוף כל דגימה כדי למנוע זיהום צולב. לאחר סיום הדגימה, השתמש בחיטוי הידיים שסופק.
      2. רטוב 1 ס"מ2 ספוג פוליאסטר סופג (למשל, רפידות מגב) עם חומר ניקוי (למשל, 0.5% נתרן דודקיל סולפט (SDS)) כדי לנטרל את הנגיף על ידי שיבוש המעטפה שלה כדי לייצב את RNA עירום על ידי גרימת נפרשות של RNases32.
      3. ספוגית משטח של 10 ס"מ2. בסיוע קיסם, להטביע לחלוטין כל דגימת דגימה בצינור שכותרתו מראש המתאים המכיל 200 μL של פתרון guanidinium thiocyanate (GITC). לאחסן צינורות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם מועברים למעבדה. ברגע שהדגימות מגיעות למעבדה, אחסנו אותן ב-80 מעלות צלזיוס.
        הערה: GITC הוא מגרה רעיל; יש להימנע ממגע עם העור. פתרון GITC הוא פשוט להכין מכימיקלים במעבדה נפוצים, עבור המתכון לראות33,34. זה משבית את הנגיף, מייצב RNA על ידי denaturing RNases34,35,36, ומייצב דגימות בטמפרטורת החדר. הערכה, לעומת זאת, כוללת חבילות קרח כדי לשמור על הדגימות קרות ללא צורך להשתמש במקררים ביתיים לאחסון.

2. זיהוי SARS-CoV-2

  1. בידוד RNA כולל
    1. לחטא משטחים, ציוד, ו pipettors עם פתרון של 2 מ"מ נחושת גופרתי ו 3% מי חמצן; ואחריו פתרון של 10% אקונומיקה, 90 מ"מ נתרן ביקרבונט, 5% SDS, ו 2.5% NaOH. לנגב ביסודיות עם מים מזוקקים ואחריו 75% אתנול.
      הערה: פתרונות אלה הם חלופה לפתרונות המסחריים הזמינים.
    2. להפשיר דגימות על קרח. דגימות וורטקס למשך 2 דקות במהירות בינונית.
    3. כדי להגביר את מהירות ההקרנה, לעבד את הדגימות בבריכות. אם מאגר הוא חיובי, לחלץ את RNA של כל מדגם באופן עצמאי כדי למצוא את המדגם החיובי /s. שלב את הדגימות מכל ערכת דגימה (16 בסך הכל) לתוך 2 בריכות של 8 דגימות.
      הערה: לאחר 8 דגימות לכל בריכה אומר כי רק 2 בריכות צריך להיות מעובד לכל ערכה. אם מאגר הוא חיובי, דגימות בודדות מעובדים מחדש עבור ניתוח RT-LAMP בודדים. פעולה זו מפחיתה את הזמן, העלויות והריאגנטים.
    4. בריכה 50 μL של כל אחד 8 דגימות לתוך צינור microcentrifuge (נפח כולל 400 μL); שמור את הדגימה הנותרת ב- -80 °C (60 °F). הוסף 0.2 כרכים (80 μL) של כלורופורם, מערבולת במשך 15 s, ולאחר מכן דגירה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. מעבירים את שכבת המים (נוזל שקוף) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. לאחסן את הממשק הנותר ונוזל ורוד במקפיא -80 מעלות צלזיוס; שברים אלה מכילים DNA וחלבונים33,36.
    6. הוסף נפח שווה של איזופרופנול (~ 200 μL) ו 2.6 μL של coprecipitant גליקוגן (15 מ"ג מ"ל-1)37. מערבבים היטב, ודגרים ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעות, ואחריו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לזרז RNA.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי דגירה דגימות ב -20 °C (60 °F) לילה במקום 1 שעה.
    7. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה. Resuspend את גלולה ב 50 μL של diethylpyrocarbonate (DEPC)-מטופלים מים, ולהוסיף נפח שווה (50 μL) של RNase חינם 5 M אמוניום אצטט ו 2.5 כרכים (250 μl) של 100% אתנול7,38.
      שים לב: יוני אמוניום לעכב קינאז polynucleotide אם נעשה שימוש בתהליך במורד הזרם38. התערובת מזרזת RNA תוך השארת טריפוספטים ו אוליגוסכרידים בתמיסה38.
    8. מערבבים היטב, ודגרים ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעות, ואחריו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לזרז RNA.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי דגירה דגימות ב -20 °C (60 °F) לילה במקום 1 שעה.
    9. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של קור (-20 מעלות צלזיוס), טרי עשה 75% אתנול. צנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם פיפטה P10 כדי למנוע הפרעה גלולה.
    10. אוויר לייבש את גלולה במשך 10-15 דקות עד שאין אתנול שנותר. Resuspend את גלולה ב 50 μL של מים שטופלו DEPC, להוסיף 5 μL של 10x מאגר DNase + 1μL של DNase (2 יחידות μL-1),ואת הדגירה ב 37 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
    11. הוסף 0.1 כרכים (5.6 μL) של מגיב השבתת DNase, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ומערבבים בעדינות כל דקה. צנטריפוגה ב 13,000 × g במשך 2 דקות, ולהעביר supernatant לצינור חדש (~ 50 μL). מניחים את הצינור על הקרח מיד בעת הכנת תגובות RT-qPCR או RT-LAMP, או לאחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: בצע בידוד RNA בחדר ללא אמפליפון כדי למנוע זיהום נשיאה.
  2. הגברה איסותרמית בתיווך לולאה הפוכה מולטיפלקס (RT-LAMP)
    1. הכן פתרון ערבוב פריימר 20X (טבלה 1) עבור כל קבוצה של פריימרים (טבלה 2). הכינו את תערובת התגובה RT-LAMP (טבלה 3) בטמפרטורת החדר עם נפח עודף של 10% כדי להסביר את אובדן הצינור.
      הערה: תערובת אמן מנורה צבעונית 2X עם אנטארקטיקה תרמולבילה uracil-DNA גליקוסילאז (UDG) מונע הגברה של זיהום DNA מתגובותקודמות 20,28.
    2. וורטקס ולסובב את התערובת. לוותר על 20 μL של התערובת לתוך כל צינור תגובה: מדגם, זינק, שליטה חיובית, ושליטה שלילית. דגירה את התגובות בצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר UDG לפעול על זיהום לשאת מעל פוטנציאלי.
    3. הוסף 5 μL של RNA לתגובת המדגם, 5 μL של RNA + 2.5 μL (450 עותקים) של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובה הממוסמרת, 2.5 μL (450 עותקים) של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובת הבקרה החיובית, ו 5 μL של H2O לתגובת הבקרה השלילית. מערבבים היטב, ומסובבים את התגובות; להפשיר את כל RNA על קרח.
    4. בעוד התרמוציקלר, או אמבט המים, מחומם ל 65 מעלות צלזיוס, לאפשר לכל התגובות להישאר בטמפרטורת החדר. ה-UDG יופעל ב->50 מעלות צלזיוס. מניחים את התגובות תרמוציקלר (להשתמש במכסה חום), דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, ולתת את התגובות להגיע לטמפרטורת החדר (~ 22 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות), או להתקרר על קרח במשך 1 דקות. לנתח את התוצאות באמצעות התכונה colorimetric (תצפית פשוטה) או על ידי הפעלת המוצרים בג'ל agarose.
      הערה: למרות שמגבלת הזיהוי (LOD) היא 10 עותקים לתגובה, תדירות הזיהוי גדלה ככל שמספר העותק מתקרב ל-500 עותקים לתגובה (איור 3A). לתצפית צבעונית, שים לב שתוצאה שלילית מסומנת בוורוד (pH = 8.8), ואילו תוצאה חיובית מסומנת על-ידי צהוב (pH = 5) (איור 3B). האפשרות הצבעונית נמנעת מפתיחת צינורות RT-LAMP לאחר הגברה, אשר יפחיתו את נפח מוצרי RT-LAMP בסביבת העבודה וזיהום נשיאה. עבור אלקטרופורזה ג'ל, להכין 1.5% ג'ל agarose עם כתם ג'ל DNA 1X ב 0.5% טריס / Borate / EDTA (TBE) חוצץ. טען 25 μL של התגובה + 5 μL של צבע טעינה 6X בכל באר. הפעל את הג'ל ב 100 V במשך 60 דקות. אין צורך בסמן מולקולרי שכן דגימות חיוביות מראות תבנית סולם (איור 3C).

Representative Results

דגימות שנאספו על ידי מדענים אזרחיים לגילוי SARS-CoV-2. במהלך תקופה של 8 חודשים (אמצע מרץ עד השבוע השלישי של נובמבר 2020), 482 אזרחים אושרו להשתתף בפרויקט זה, מתוכם 350 (73%) ביקש ערכה. בסך הכל נמסרו 362 ערכות (כלומר, חלק מהמשתתפים ביקשו ערכות מרובות) ו-246 (70%) הוחזרו (איור 4א,ב). כל 4,080 הדגימות הכלולות בערכות אלה עובדו. אתרי איסוף הופצו לאורך מחוזות החוף הצפוני, צפון מרכז, מרכז ודרום המחוז, כמו גם כמה במחוזות המזרחיים (איור 4A). במחוזות אלה יש את צפיפות האוכלוסין הגבוהה ביותר של מחוז סן דייגו ואת מקרי COVID-19 המתועדים ביותר, כפי שדווח על ידי הסוכנות לשירותי בריאות האדם בסן דייגו39.

האזרחים ביקשו לאסוף את רוב הערכות שנדגמו (כלומר, שיעור הצלחה ממוצע: 70.4%). בכל יום התבקשו 1-16 ערכות והוחזרו למעבדה 0-14 ערכות (איור 4B). סקר שנערך בקרב המדענים האזרחיים הראה כי איסוף הערכה המלאה (16 דגימות) ארך 1-3 שעות שהופצו לאורך 8 ימים בממוצע (איור 4A וטבלה 4). הרוב המכריע של הערכות הושלמו (91.1%), כלומר הן הכילו ספוגית בתוך כל 16 צינורות הדגימה, ונתוני הדגימה המתאימים הועלו ל-LIMS(איור 4A וטבלה 4).

זיהוי של SARS-CoV-2 באמצעות מיצוי GITC-כלורופורם ומולטיפלקס הפוך תעתיק לולאה בתיווך הגברה isothermal (RT-LAMP). עבור בדיקת RT-LAMP הצבעונית, שני סטים של פרייומרים11,20,28 שימשו כדי למקד את nucleocapsid (N2) ואת המעטפה (E1) גנים (טבלה 2). הרצפים המוכרים על ידי פריימרים אלה נמצאים באותו אזור כמו פריימרים ובדיקות שאושרו על ידי ה- CDC40 והאיחוד האירופי (EU)41 לאבחון אנושי של COVID-19 על ידי RT-qPCR. תוצאות אלו מאמתות את מה שג'אנג ואח '28 תיארו, שבו הוספת 60 מ"מ guanidine הידרוכלוריד לתגובה מגבירה את LOD כאשר לרוץ מולטיפלקס. ה-LOD בתדירות של 100% היה 500 עותקים לתגובת 25 μL (איור 3A, B). ב- RT-LAMP הצבעוני, דגימות חיוביות שינו צבע מוורוד לצהוב עקב הסטת pH מ- ~ 8 ל- 5.5 (איור 3B). כאשר התגובה הפכה כתומה במספרים נמוכים, דגימות הופעלו בג'ל agarose 1.5% כדי לאשר אלה היו חיוביים והביא דפוס דמוי סולם (איור 3C). RT-LAMP שימש לגילוי SARS-CoV-2 בדגימות RNA במאגר.

כדי לשלוט על תשלילים כוזבים עקב מעכבי תגובה, כל דגימה נבדקה בתגובה נוספת זינקה עם 500 עותקים של SARS-CoV-2 סינתטי. דגימות חיוביות במאגר היו dereplicated על ידי בידוד RNA של כל מדגם בודדים בבריכה ולהפעיל בתגובת RT-LAMP כדי לקבוע את זהות המדגם החיובי. תוצאות האיתור הועלו לאחר מכן ל- LIMS, שם משויך מזהה הדגימה הייחודי למידע על תאריך, שעה, קואורדינטות GPS, אתר ותמונה של הדגימה.

שיטות RT-PCR בזמן אמת ומסורתיות: עיכוב על ידי מזהמים לדוגמה. כדי לבחור את השיטה הטובה ביותר המתאימה לצינור הגילוי המוצע, שיטות הגברה אחרות של RNA נבדקו עם דגימות סביבתיות שנאספו על ידי קבוצת טייסים של מדענים אזרחיים. דוגמאות לתוצאות של כל אחת משיטות אלה מוצגות באיור 5 כדי לתאר את הרגישות שלהן למעכבים סביבתיים ואת רעשי אותות הרקע בריכוזים נמוכים של מספרי העתקה ויראליים.

שישה ניסוחים RT-qPCR (שולחן החומרים) שאושרו על ידי ה-CDC ו- WHO נבדקו לגילוי הנגיף על דגימות סביבתיות. פרוטוקולים היו אחריו על פי הוראות היצרן, כמו גם הנחיות CDC לגילוי SARS-CoV-2 בהגדרות קליניות40. תגובות המכילות ריכוזים שונים של פקדי RNA סינתטיים SARS-CoV-2 היו זינק לתוך דגימות משטח מנוקב לאחר בידוד RNA גולמי. כל תערובות המאסטר היו רגישות למעכבים בריכוזי LOD של השליטה החיובית (איור 5A).

כדי לעקוף מעכבים של טכנולוגיות אלה בזמן אמת, נבדקה מערכת RT-PCR מסורתית. מערכת RT-PCR צעד אחד (טבלה של חומרים) שימש כדי להגביר את הגן nucleocapsid באמצעות ערכות פריימר N1, N2, ואת גן המעטפה באמצעות ערכת פריימר E1 שאושרה על ידי ה-CDC (ארה"ב) ו ECDC (האיחוד האירופי), בהתאמה (טבלה 2). פרוטוקולים היו אחריו על פי הוראות היצרן, כמו גם הנחיות CDC לגילוי SARS-CoV-2 בהגדרות קליניות40. פריימר מגדיר N1 ו N2 שתוכנן על ידי ה-CDC להניב מוצר ~ 70 bp; עם זאת, תוצאות חיוביות של מספרים בעותק נמוך לא נבדלו מרעש הרקע של ההגברה של השליטה השלילית (איור 5B),שהכניס תוצאות חיוביות שגויות לתוצאות. המכפלה של פרייומרים E1 היה אות חלש במספר עותק נמוך ( איור5B),החדרת שליליות כוזבות לתוך התוצאות. יתר על כן, שיטת RT-PCR נבדק עדיין היה רגיש מעכבים נוכח דגימות סביבתיות (נתונים לא הראו).

שיטות אחרות פותחו כדי לזהות כמויות קטנות מאוד של רצף היעד. אחת משיטות אלה היא הגברה מעגל מתגלגל (RCA), ואז זיהוי של רצף היעד, RNA או DNA, על ידי בדיקה ליניארית ספציפית, ליגאז מעגלי את התבנית. באמצעות פריימרים שנועדו להכליא עם החללית, פולימראז DNA עם פעילות תזוזת גדיל מגביר את החללית בתגובה isothermal42. זה החללית שזיהתה את המטרה, אשר מוגברת, ולא את רצף היעד, מה שהופך את השיטה הזאת רגישה מאוד43. וואנג ואח'44 פרסמו פרוטוקול RCA לגילוי ישיר של SARS-CoV-1 RNA. השיטה שונתה כדי להשתמש בפריימריז ספציפיים עבור SARS-CoV-2. למרבה הצער, בפקד שאינו תבנית (NTC), הבדיקה מעגלית ומניבה מוצר בהיעדר תבנית RNA, גם בעת שימוש במגוון רחב של ליגות, כולל ליגאז רגיש ל- SNP. בהיעדר ליגאז, ה-NTC לא הראה הגברה מהגשושית הליניארית (איור 5C).

Figure 1
איור 1: פלטפורמת דגימה מבוססת אינטרנט עם ממשק נתוני איסוף לדוגמה עבור מכשירים ניידים. (A) אתר אינטרנט, המכיל תוסף רב לשוני, נוצר כדי לתווך את האינטראקציה בין המעבדה לבין המדענים האזרחיים. הפלטפורמה שימשה לבקשת מסירה/איסוף של ערכה לדוגמה ושליחת נתונים לדוגמה. הפלטפורמה הכילה פרוטוקולי דגימה מפורטים באנגלית/ספרדית ודגימה אורקולית. (B) תצוגת מכשיר נייד המשמשת להעלאת נתונים לדוגמה: תאריך, שעה, קואורדינטות GPS, תיאור אתר לדוגמה ותמונה של אתר האוסף. קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2; GPS = מערכת מיקום גלובלית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ערכת איסוף לדוגמה. מדענים אזרחיים קיבלו מקרר המכיל שתי חבילות קרח, גיליון נתוני בטיחות כדי ליידע את המתנדבים על הסכנות של טיפול בפתרון GITC, פרוטוקול דגימה מפורט וחבישת מסכה, מסכת KN95, שקית פסולת, בקבוק ספריי עם מחטא ידיים, בקבוק ספריי עם 0.5% SDS, 16 זוגות כפפות, תיק קטן עם 16 קיסמים ו -16 ספוגיות פוליאסטר, 16 צינורות microcentrifuge שכותרתו מראש המכילים 200 μL של פתרון GITC, תיבה המכילה את צינורות הדגימה, ושקית המשמשת כמיכל משני לתיבת הצינור במקרה של שפיכה. קיצורים: GITC = גואנידיניום תיוסיאנאט; SDS = נתרן דודקיל סולפט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בדיקה משולבת שלהגברה איסותרמית בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP). תגובות מרובות באמצעות פרייומרים עבור SARS-CoV-2 nucleocapsid (N2) ומעטפה (E1) גנים כדי לזהות כמה רק 10 עותקים של הנגיף בתגובה. סארס-CoV-2 סינתטי RNA שימש כשליטה חיובית. (A)תדירות הזיהוי במולטיפלקס COLORIMETRIC RT-LAMP של SARS-CoV-2 במספרי העתקת גנום שונים לכל תגובה. ערך ממוצע של חמישה שכפולים בוורוד. (B)הגבלת זיהוי (LOD) של SARS-CoV-2 ב RT-LAMP צבעוני מולטיפלקס; צהוב = חיובי (pH ~ 5); ורוד = שלילי (pH ~ 8). (C) תבנית סולם של תגובות חיוביות SARS-CoV-2 RT-LAMP ב 1.5% אלקטרופורזה ג'ל agarose. קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2; rxn = תגובה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיקום ערכות הדגימה של מדען אזרחי במחוז סן דייגו ושיעור ההצלחה של הערכות המבוקשות. (A) נקודות כתומות מייצגות את המיקום של ערכת דגימה אחת, המכילה 16 דגימות. תרשים העוגה הכחולה מראה את אחוז הערכות שלקח ימים שונים מהרגע שבו הן נמסרו למדענים האזרחיים ועד למועד החזרתן למעבדה. מספר הימים בסוגריים. תרשים העוגה הכתומה מציג את אחוז הערכות עם מספר שונה של דגימות שהושלמו מתוך סך של 16 דגימות. מספר הדגימות שהושלמו המכילות דגימה בתוך צינור הדגימה ונתוני הדגימה המתאימים שהועלו ל- LIMS בסוגריים. (ב)אחוז הערכות שהוחזרו למעבדה (נקודות) והמספר הכולל של הערכות המבוקשות (ברים), ביחס למועד בו התבקשה הערכה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שיטות חלופיות ל-SARS-CoV-2 RNAdetection. (A) זיהוי RT-qPCR של הגן SARS-CoV-2 נוקלאוקפסיד(N)באמצעות ערכת פריימר N2. דגימות סביבתיות במאגר זינקו עם 900 (ירוק), או 9 (כתום) עותקים של SARS-CoV-2. פקדים חיוביים של אותם מספרי עותקים בכחול. חץ מציין את הירידה בזיהוי פלואורסצנטיות של בקרה חיובית מספר עותק נמוך כאשר מדגם סביבתי קיים. (B)זיהוי RT-PCR מסורתי של SARS-CoV-2. למעלה: מוצרי RT-PCR של הגן nucleocapsid באמצעות ערכות פריימר N1 ו- N2. אות רקע עמום נצפה בפקד ללא תבנית. למטה: מוצרי RT-PCR של גן המעטפה באמצעות ערכת פריימר E1. אות נמוך מאוד נצפתה בריכוז LOD. חצים כחולים מראים מוצר חיובי צפוי: (למעלה) ~ 70 bp ו (למטה) 113 bp ב 2% אלקטרופורזה ג'ל agarose. (C)RCA של SARS-CoV-2RNA. בדיקה מעגלית מגבירה בנוכחות ליגאז והיעדר תבנית RNA (NTCcir); בהיעדר בדיקה ליניארית של תבנית ליגאז ו- RNA אינה מגבירה(NTC lin). קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2; RFU = יחידות פלואורסצנטיות יחסיות; bp = זוגות בסיסים; rxn = תגובה; MM = סמן מולקולרי; RT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך; RT-qPCR = RT-PCR כמותי בזמן אמת; RCA = הגברה מעגל מתגלגל; NTC= אין פקד תבנית; LOD = מגבלת זיהוי; rxn = תגובה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תחל ריכוז 20X (מיקרומטר) ריכוז פי 1 (μM)
FIP (FIP) 32 1.6
רכיב BIP 32 1.6
F3 4 0.2
B3 4 0.2
לולאהF 8 0.4
לולאהB 8 0.4

טבלה 1: ניסוח לתערובת פריימר RT-LAMP 20X. בתגובת RT-LAMP, 6 פריימפרים מזהים 8 אזורים של הדנ"א הממוקד. קיצורים: הגברה איסותרמית בתיווך לולאה הפוכה; FIP = פריימר פנימי קדמי; BIP = פריימר פנימי לאחור; F3 = פריימר תזוזה קדימה; B3 = פריימר תזוזה לאחור; LoopF = פריימר לולאה קדימה; LoopB = פריימר לולאה לאחור.

תחל רצף יעד גודל מוצר
RT-מנורה9,18,19
E1-F3 טגטגטגאטקטקטקטקט E תבנית דמוית סולם
E1-B3 טטגאטאטאקאגאגט
E1-FIP אקאגאגאטגאטגאג
E1-BIP TTGטגטאגטאגקטאגקטאגטטגטטקטאקג'ט
E1-לולאהB GCGCTTCגאטג'גטגג'יט
E1-לולאהF CGקטאקטאקטאגה
N2-F3 אקאגאגאקאטאקאג N
N2-B3 גקטגאטקטגאטגאטקט
N2-FIP TTCCאגקטגאגאגאטאקאטאג סמ"ק
N2-BIP CGקטגקטאגאגאגאטקאטגאטגאטגאגקטגטה
N2-לולאהF גאגגקאאטג
N2-לולאהB CTTCGGGGTGGGGGACC
RT-qPCR38
2019-nCoV_N1-F גקאקאאטג'יג'אאט N 72 סיביות לשנייה
2019-nCoV_N1-R תקטגטאגקטקטקטגטגאטקטג
2019-nCoV_N1-P 5'-FAM-ACC CCG חתול TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'
2019-nCoV_N2-F טאקאאאקאטג'קגקאה N 67 סיביות לשנייה
2019-nCoV_N2-R GCGCGACATTCCGAAGAA
2019-nCoV_N2-P 5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'
RT-PCR39
E1_Sarbeco_F אקאגטאקאגטאגטאגאטאגג'יט E 113 סיביות לשנייה
E1_Sarbeco_R אטאטג'קאגגטקה

טבלה 2: פריימרים המשמשים עבור RT-LAMP, RT-qPCR ו- RT-PCR. רצפי פריימר, גן היעד, גודל המוצר הצפוי וההתייחסות המתאימה מפורטים. קיצורים: RT-LAMP = הגברה איסותרמית בתיווך לולאה הפוכה; RT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך; bp = זוגות בסיסים; RT-qPCR = RT-PCR כמותי בזמן אמת; E1 = גן מעטפה; N2 = גן נוקלאוקאפסיד; F = פריימר קדמי; R = פריימר הפוך; P = בדיקה ; FIP = פריימר פנימי קדמי; BIP = פריימר פנימי לאחור; F3 = פריימר תזוזה קדימה; B3 = פריימר תזוזה לאחור; LoopF = פריימר לולאה קדימה; LoopB = פריימר לולאה לאחור.

מגיב אמצעי אחסון (μL)
התחלה חמה מנורה צבעונית 2X מאסטר לערבב עם UDG 12.5
N2 תערובת פריימר (20x) 1.25
E1 תערובת פריימר (20x) 1.25
גואנידין הידרוכלוריד (600 מ"מ)* 2.5
רנ"א יעד 5
H2O ללא גרעין 2.5
סה"כ נפח 25

טבלה 3: תערובת תבנית בסיס לתגובה עבור RT-LAMP צבעוני מולטיפלקס. (*) Guanidine הידרוכלוריד הוכח להגביר את הרגישות והמהירות של התגובה על ידי מנגנון לא אופייני28. קיצורים: LAMP = הגברה איסותרמית בתיווך לולאה; UDG = אורסיל-DNA גליקוסילאז; N2 = גן נוקלאוקאפסיד; E1 = גן מעטפה; DEPC = דיתילפירוקרבונט.

אזרחים מאושרים אזרחים שביקשו ערכה ערכות שנמסרו ערכות שנדגמו שהוחזרו ימים המוקדשים לדגימה % ערכות שלמות % ערכות שלא הושלמו דוגמאות מעובדות
482 72.6% (350/482) 362 70.4% (255/362) התכוון 8 91.1 (224/246) 8.9 (22/246) 4,080
חציון 3

טבלה 4:סווטב עבור SARS-CoV-2 במספרים. הושטת יד ודגימה של שיעורי הצלחה. קיצור: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2.

Discussion

מעורבות מדען אזרחי. מדענים אזרחיים גויסו למשטחי ספוגית ברחבי מחוז סן דייגו כדי לדגום ולזהות את נוכחותם של SARS-CoV-2 בסביבה העירונית. רוב ערכות הדגימה שנמסרו (70%) הוחזרו למעבדה, ומתואם כמעט כל הדגימות הושלמו (91%) (איור3א,B וטבלה 4). מתנדבים יכולים בקלות לבקש מסירה/איסוף של ערכות דרך הפלטפורמה מבוססת האינטרנט, ותוכנת תכנון מסלולי המסירה הודיעה למדענים אזרחיים על זמני ההגעה המשוערים, שניהם ככל הנראה גורמים משמעותיים להצלחה שנצפתה. הזמן הממוצע ממועד מסירת הערכה למדען האזרחי ועד להחזרתה למעבדה היה 8 ימים, עם חציון של 3 ימים וטווח של 1-64 ימים (איור 3A וטבלה 4). תזכורות תכופות יותר למתנדבים צפויות לקצר את זמן ההשהיה הזה.

פלטפורמת איסוף הנתונים שימשה בהצלחה את רוב המשתמשים (73%) (שולחן4). בעוד המאמצים של המדענים האזרחיים לא נמדדו, בדיקות שדה הראו כי פלטפורמת איסוף הנתונים צמצמה באופן משמעותי את המאמץ והזמן הנדרשים להשלמת איסוף מדגם כראוי. לפיכך, הפחתת כמות הנהלת החשבונות עודדה מעורבות של מדען אזרחי. הפלטפורמה מבוססת האינטרנט נועדה להתגבר על מגבלות דמוגרפיות על ידי מתן שירות תרגום מכונה עצבי רב לשוני ועל ידי מתן פרוטוקולים גרפיים אורקוליים באנגלית ובספרדית. זה היה מוצלח רק באופן חלקי כמו פחות דגימות נאספו הן סאות' ביי ומחוז צפון שבו רוב האוכלוסייה ההיספנית / לטינו של המחוז מתגוררים45. אזורים אלה גם היו 63% (1,700 מקרים לכל 100,000) מכלל מקרי COVID-19 במחוז סן דייגו עם השכיחות הגבוהה ביותר של המחלה46 ושיעור האשפוזים(62%) 47,48. למרות שרוב הדגימות הגיעו ממחוז סנטרל, מספר מייצג נאסף מהמחוזות המושפעים ביותר מ- COVID-19 ורק חלק קטן מהדגימות היה חיובי, מה שמרמז כי מאגרי פני השטח של SARS-CoV-2 בסביבה העירונית הם נדירים יחסית.

עיבוד לדוגמה. ספוגיות דגימה היו רטובות עם SDS, אשר השבית את הנגיף על ידי שיבוש המעטפה שלה וייצב את RNA עירום על ידי נפרש RNases32. בנוחות במהלך האיסוף, חומר הניקוי בספוגית ניקה את המשטח שנדגם. דגימות סביבתיות מכילות לעתים קרובות כמויות קטנות מאוד של RNA. כדי למקסם את ההתאוששות, בידוד RNA בוצע בשיטת מיצוי גולמי מבוססת GITC, נטולת טורים. GITC, סוכן צ'אוטרופי חזק, משבש את קשרי המימן השומרים על קיפול חלבונים (כלומר, אפקט הידרופובי). פעולה זו גורמת להשבתה של חלקיקים ויראליים, ואת RNA נשאר יציב עקב עיכוב של RNAses34,35,36. פתרון GITC שמר על יציבות דגימות ה- RNA ללא שיקולים קפדניים של שרשרת קרה, מה שאיפשר לאזרחים לשמור על הדגימות בטמפרטורת החדר אם מקפיא לחפיסות הקרח שסופקו לא היה זמין. כדי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי ריאגנט זה מהווה כאשר עור ישיר או מגע רירית מתרחשת, האזרחים היו מודעים לסיכונים אלה על ידי הכללת גיליון נתונים בטיחות חומר שסופק בערכה חותם אזהרה הונח בתיבה המכילה את הצינורות.

שיטת החילוץ הגולמית GITC-chloroform סייעה להתאוששות עקבות של RNA מהמטליות, וכפי שמוצג על ידי הגברה של דגימות ממוסמרות, מעכבים לעתים רחוקות התעקשו בדגימות לאחר החילוץ. דגימות, שהיו שליליות עבור SARS-CoV-2 ולא הראו עיכוב RT-LAMP, ייצגו תשלילים אמיתיים או היה מספר עותק נמוך יותר מאשר LOD בתדר 100%. לעומת זאת, זיהוי של RNA ויראלי על משטח אינו מרמז ישירות על הסיכון של שידור באמצעות מגע כמו הדבקות של הנגיף מדגימות חיוביות צריך להיבדק. סינון מהיר של הסביבה, לא מוגבל על ידי הזמינות של אספקה מתוחכמת או כוח אדם מוסמך מאוד, הוא חיוני כדי להעריך אם משטחים מהווים מאגר ויראלי כדי לשפר את מאמצי מניעה והכלה ישירה.

RT-LAMP נבחרה להיות השיטה הטובה ביותר המתאימה לצינור הזיהוי המוצע. זה הוכיח להיות שיטה מהירה וזולה כי היה עמיד מאוד לרוב המעכבים הנותרים רגיש וספציפי כמו שיטות אחרות RT-qPCR. בשל השימוש בהם בהגדרות קליניות במהלך מגפת SARS-CoV-2, הזמינות של ערכות RT-qPCR הושפעה מהביקוש העולמי. יתר על כן, טכניקות RT-qPCR - אפילו אלה שנוסחו כדי להתנגד למעכבים - היו רגישות לחומרים הכלולים בדגימות הסביבתיות שנאספו על ידי קבוצת פיילוט של מדענים אזרחיים, גם לאחר שימוש באסטרטגיות נפוצות אחרות להפחתת התחרות המעכבת על כריכתאנזימים 49. ממצאים אלה מאומתים על ידי מחקר שנערך לאחרונה שהשווה את שתי השיטות לגילוי SARS-CoV-2 על דגימות ספוגית מממתקים שטופלו על ידי חולי COVID-19 ומצא מעל 83% קונקורדנציה תוצאה, עם עיכוב נמוך ב -25% בדגימות שנותחו על ידי RT-LAMP15. יתר על כן, מיצוי גולמי GITC-כלורופורם, יחד עם RT-LAMP, הפחית את העלות של ריאגנטים ואספקה על ידי 42% לעומת מיצוי ערכת RNA ו RT-qPCR (שולחן החומרים).

שיטה זו אפשרה ניתוח תפוקה גבוהה של אלפי דגימות ספוגית פני השטח. עד 80 בריכות, המייצגות 640 דגימות, עובדו תוך יומיים מיצוי RNA לגילוי SARS-CoV-2 על ידי RT-LAMP. הפרוטוקול המוצע הוא חצי שוויוני, מוגבל לגילוי של RNA ויראלי, ואינו מצביע על נוכחות של חלקיקים נגיפיים זיהומיות. ניתוח נוסף נדרש כדי להעריך את הסיכון של העברת SARS-CoV-2 מ fomites נגוע נוכח על משטחים מנוקב.

מחקר זה מציג פרוטוקול כדי להגדיר במהירות אסטרטגיית בדיקה הכוללת זרימת עבודה יעילה כאשר מתמודדים עם מצב חירום בריאותי עם מחלה מדבקת. פרוטוקול הדגימה המוצע הוא פשוט ומשתמש באספקה הנפוצה במשקי בית, ושיטת הגילוי הנגיפית מתבצעת על ציוד הזמין בהגדרות מעבדה בסיסיות כגון אמבט מים במקום תרמוציקלר. העלויות של ריאגנטים RT-LAMP נמוכות משמעותית מאלה הדרושות עבור RT-qPCR ופחות רגישות לתרחישי ביקוש גלובליים גבוהים. מחקר זה משמש מסגרת להערכת מאגרים ויראליים סביבתיים בהתפרצויות מגיפות עתידיות ומגפות עולמיות.

Disclosures

כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לחוקרי מכון המידע הוויראלי (VII), ד"ר אנקה מ. סגל, ווילו סגל, פטרישיה ל. רוהוור, גארי רוהוור, קארי ל. רוהוור, מגדה סילביה פינטה, אליזבת קרוז קאנו, ד"ר גרגורי פיטרס, ד"ר סטיוארט סנדין וד"ר ג'ניפר סמית' על שהקדשו את הזמן לאיסוף דגימות רבות. אנו מודים גם לד"ר רוב נייט, ד"ר ג'ק גילברט, ד"ר פדרו באלדה-פרה וד"ר שרה אלארד מהמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת סן דייגו קליפורניה (UCSD) על הקלת בקרות חיוביות ומשוב שימושי. אנו מודים לסטייסי קארוטה (SDSU College of Sciences) וג'ינה ספידדל (SDSU) על התמיכה הלוגיסטית ולחואן רודריגז על האמנות והעיצוב הגרפי של פרוטוקול הדגימה. אנו מודים לכל המשתתפים על מחויבותם ומסירותם לפרויקט בתקופות קשות מאוד. עבודה זו נתמכה על ידי תרומה נדיבה של ד"ר ג'ו אן ליין (SDSU המכללה למדעים) ואת הקרן הלאומית למדעים RAPID: מאגרים סביבתיים של מענק SARS-CoV-2 (מספר הפרס: 2030479).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SMP, LIMS, and community outreach:
Authentication Application Programming Interface Google Google Sign-In
Commercial hosting platform GoDaddy
Data Charting Application Programming Interface Google Google Charts
Database software MySQL 
Delivery route planning software  Circuit Circuit for Teams
Free email service Google Google Email
Geospatial Application Programming Interface Google Google Maps API
Multilingual neural machine translation service Google Google Translate
Online form Google Google Form
Operating system Linux
Web and database development  Big Rose Web Design
Web server software Apache 
Sampling kit:
Coolers Coleman (Amazon) B00363X3F2 Cost (US$) per 100 rxns: 70
Gallon Ziploc bags Solimo (Amazon) B07BJ495GL Cost (US$) per 100 rxns: 18
Glycerol (hand sanitizer) FischerScientific G33-4 Cost (US$) per 100 rxns: 9
Ice packs Ice-Brix (Amazon) B075GLD3X1 Cost (US$) per 100 rxns: 110
Isopropanol (hand sanitizer) FischerScientific AA36644K7 Cost (US$) per 100 rxns: 43
KN95 masks Echo-Sigma Echo-Sigma Cost (US$) per 100 rxns: 400
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet Office Depot 348037 Cost (US$) per 100 rxns: 36
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) Anyumocz (Amazon) B07T64FHXR Cost (US$) per 100 rxns: 80
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes Genesee Scientific 22-281 Cost (US$) per 100 rxns: 83
Sample ID solvent resistant labels LABTAG XST-10C1-1WH Cost (US$) per 100 rxns: 68
Swiffer WetJet pads (swabs) Swiffer (Amazon) B001F0RBT2 Cost (US$) per 100 rxns: 8
Toothpicks Kitchen Essential (Amazon) B00PBK4NG6 Cost (US$) per 100 rxns: 8
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS Invitrogen 15596018 Cost (US$) per 100 rxns: 40
Tube boxes Genesee Scientific 21-119 Cost (US$) per 100 rxns: 180
Small Ziploc bags Ziploc (Amazon) B01LRKEI9K Cost (US$) per 100 rxns: 8
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer  Zebra GK420t
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160
Trizol RNA extraction:
Ammonium Acetate RNase-free Invitrogen AM9070G Cost (US$) per 100 rxns: 2
Chloroform FisherScientific C298-500 Cost (US$) per 100 rxns: 2
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) Invitrogen AM9515 Cost (US$) per 100 rxns: 80
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol FisherScientific BP2818500 Cost (US$) per 100 rxns: 30
Molecular-grade Isopropanol FisherScientific BP2618500 Cost (US$) per 100 rxns: 3
TURBO DNA-free Kit  Invitrogen AM1907 Cost (US$) per 100 rxns: 110
Multiplexed colorimetric RT-LAMP:
Guanidine Hydrochloride Alfa Aesar AAJ6548522 Cost (US$) per 100 rxns: 1
RT-LAMP E1-Primers IDT n/a Cost (US$) per 100 rxns: 7
RT-LAMP N2-Primers IDT n/a Cost (US$) per 100 rxns: 7
Synthetic SARS-CoV-2 RNA ATCC VR-3276SD Cost (US$) per 100 rxns: 14
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG NEB M1800S Cost (US$) per 100 rxns: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler Eppendorf 950030010
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470
Kit for RNA extraction:
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit Qiagen 61904 Cost (US$) per 100 rxns: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2 RNA ATCC VR-3276SD Cost (US$) per 100 rxns: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Applied Biosystems 4444432 Cost (US$) per 100 rxns: 180
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes IDT 10006713 Cost (US$) per 100 rxns: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Quantabio 95132-100
QuantiNova Pathogen  Qiagen 208652
QuantiNova Probe Qiagen 208352
UltraPlex 1-Step ToughMix  Quantabio 95166-100
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System BioRad 1855196
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR  Invitrogen 12594025
Lab cleanup:
DNAZap Invitrogen AM9890
RNAZap Invitrogen AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
  2. Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730 (2020).
  3. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
  4. Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
  5. Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
  6. How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
  7. Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
  8. Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
  9. Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  10. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
  11. Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
  12. Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
  13. Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437 (2018).
  14. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  15. Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074 (2020).
  16. Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
  17. Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  18. Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
  19. Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
  20. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  21. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
  22. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. 38, 870-874 (2020).
  23. Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
  24. Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
  25. Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
  26. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 28 (12), 63 (2000).
  27. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  28. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
  29. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
  30. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  31. OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
  32. Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
  33. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  34. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  35. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
  36. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  37. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  38. Wallace, D. M. Precipitation of nucleic acids. Methods in Enzymology. 152, 41-48 (1987).
  39. COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
  40. CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
  41. Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045 (2020).
  42. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
  43. Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
  44. Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
  45. Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
  46. COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
  47. COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
  48. COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
  49. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Tags

ביולוגיה גיליון 170 מאגרים ויראליים סביבתיים נגיפי RNA של fomite בריאות גלובלית תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) מחלת קורונה 2019 (COVID-19) הגברה איסותרמית בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP) אפידמיולוגיה מולקולרית שפיכה ויראלית מדע אזרחי
סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas, M. I., Giles, S. S., Little,… More

Rojas, M. I., Giles, S. S., Little, M., Baron, R., Livingston, I., Dagenais, T. R. T., Baer, J., Cobián-Güemes, A. G., White, B., Rohwer, F. Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs. J. Vis. Exp. (170), e62379, doi:10.3791/62379 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter