Summary
Un proyecto de ciencia ciudadana fue diseñado para reclutar residentes de San Diego para recolectar muestras ambientales para el SARS-CoV-2. Se creó una plataforma multilingüe basada en la web para el envío de datos utilizando una interfaz de dispositivo móvil fácil de usar. Un sistema de gestión de la información de laboratorio facilitó la recolección de miles de muestras geográficamente diversas con seguimiento de resultados en tiempo real.
Abstract
Para controlar la transmisión comunitaria del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) durante la pandemia mundial de 2020, la mayoría de los países implementaron estrategias basadas en pruebas directas en humanos, cobertura facial y desinfección de superficies. Bajo el supuesto de que la principal vía de transmisión incluye aerosoles y gotitas respiratorias, los esfuerzos para detectar el SARS-CoV-2 en fómites se han centrado en lugares sospechosos de alta prevalencia (por ejemplo, salas de hospitales, cruceros y sistemas de transporte masivo). Para investigar la presencia de SARS-CoV-2 en superficies en el entorno urbano que rara vez se limpian y rara vez se desinfectan, se alistó a 350 ciudadanos del condado de San Diego. En total, estos científicos ciudadanos recogieron 4.080 muestras. Se desarrolló una plataforma en línea para monitorear la entrega y recogida de kits de muestreo, así como para recopilar datos de muestras. Los kits de muestreo se construyeron en su mayoría a partir de suministros disponibles en tiendas con estrés pandémico. Las muestras se procesaron utilizando reactivos de fácil acceso a pesar de la escasez recurrente de suministros. Los métodos utilizados fueron altamente sensibles y resistentes a los inhibidores que están comúnmente presentes en muestras ambientales. El diseño experimental propuesto y los métodos de procesamiento tuvieron éxito en la participación de numerosos científicos ciudadanos que efectivamente recogieron muestras de diversas áreas de superficie. El flujo de trabajo y los métodos descritos aquí son relevantes para estudiar el entorno urbano en busca de otros virus, que son de interés para la salud pública y representan una amenaza para futuras pandemias.
Introduction
Se cree que el SARS-CoV-2 se transmite principalmente a través de la inhalación de aerosoles y gotitas contaminados por contacto directo con individuos infectados1,2,3,4. Sin embargo, durante las fases iniciales de la pandemia mundial de COVID-19, los esfuerzos para controlar la transmisión del SARS-CoV-2 se centraron fuertemente en la desinfección de superficies, el lavado de manos y la desinfección. Para finales de 2020, las pautas de transmisión de la Organización Mundial de la Salud (OMS)5 y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)6 de Estados Unidos consideraron que la transmisión en el aire era un peligro principalmente cuando se está en contacto cercano (<2 m) con una persona infectada o en presencia de procedimientos médicos generadores de aerosoles. La autoin inoculación después del contacto con superficies contaminadas o la inhalación de fómites aerosolizados aún no se han descartado como una vía de transmisión del SARS-CoV-2.
Se han reportado casos de COVID-19 en los que la transmisión aérea parece poco probable7,8. Los viriones del SARS-CoV-2 permanecen infecciosos en el cobre hasta 8 h, en el cartón y el acero inoxidable hasta 24 h, y en el plástico hasta 48 h9. En las cabinas de los cruceros, el ARN del SARS-CoV-2 se detectó 17 días después de que los pasajeros hubieran partido7. Muestras de aire y superficie de hospitales y sistemas de transporte masivo han dado positivo para SARS-CoV-2 y otros coronavirus8,10,11,12,13,14. Un estudio realizado en el embalaje exterior de caramelos de Halloween manejados por pacientes de COVID-19 asintomáticos y moderadamente/levemente sintomáticos, concluyó que la combinación de lavado de manos por parte del manipulador y lavado de los dulces con jabón de manos redujo el ARN del SARS-CoV-2 por debajo de los niveles umbral15.
Se han publicado varios métodos para el diagnóstico del SARS-CoV-2 basados en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real(RT-qPCR)16,17,la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP)11,18,19,20,21y las tecnologías CRISPR-Cas18,19,22,23. La mayoría requieren kits de extracción de ARN que a menudo escasean durante los períodos de demanda mundial significativa, y muy pocos se han utilizado para la detección ambiental del virus24. Se ha demostrado que la detección de ARN del SARS-CoV-2 mediante RT-LAMP es más del 83% concordante con el uso de RT-qPCR. Además, RT-LAMP dio lugar a una reducción del 25% en los resultados no concluyentes en comparación con RT-qPCR15.
RT-LAMP es una técnica sencilla que utiliza una transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir de una plantilla de ARN25,seguida de una ADN polimerasa con fuerte actividad de desplazamiento de hebras que sintetiza ADN a temperatura constante (es decir, amplificación isotérmica)26. Una mayor especificidad de la detección del genoma viral se logra mediante el uso de cuatro o seis cebadores que reconocen seis u ocho regiones del ADN objetivo. La amplificación se inicia a partir de un cebador interno y produce una estructura de ADN semi-doble cadena. La hebra principal es entonces amplificada por una imprimación externa. Estas amplificaciones se repiten para los cebadores inversos. Los cebadores internos y externos en cada extremo tienen un sitio auto-complementario inverso interno que forma un bucle en el producto de amplificación26,27. En el desplazamiento de hebra isotérmica, la síntesis asíncrona de ADN genera altas cantidades de producto amplificado donde la polimerización continua amplifica la señal de tan solo 10 copias por reacción11,20,28. La mezcla colorimétrica RT-LAMP está débilmente tamponada y utiliza el rojo fenol como indicador de pH. Como la polimerasa incorpora un nucleótido, libera un protón, y suficientes protones cambiarán el pH de la solución así como su color de rosa a amarillo11,20,28,29.
RT-LAMP fue desarrollado para la detección de enfermedades transmitidas por mosquitos en centros de salud periféricos que carecen de laboratorios totalmente equipados25 y para la detección rápida de otros virus ARN como el virus de inmunodeficiencia humana30. Las poblaciones más vulnerables en los brotes epidémicos —según la definición de la OMS— a menudo carecen de recursos económicos suficientes y del equipo adecuado para llevar a cabo la detección (Programa mundial de salud pública de las Naciones Unidas). En la actual pandemia de SARS-CoV-2, los suministros como hisopos de grado médico y reactivos para kits de extracción de ARN no han podido satisfacer la demanda mundial, especialmente en los países no manufactureros. El protocolo propuesto utilizó una extracción de ARN crudo basada en tiocianato de guanidinio (GITC), que preservó eficazmente el ARN de una manera independiente de la cadena de frío y redujo significativamente la persistencia de los inhibidores de la muestra. Además, el protocolo de extracción gitc-cloroformo se basa en la separación del ARN del ADN y las proteínas seguida de la precipitación respectiva, lo que permite la recuperación de la mayor parte del material genético. Estas ventajas superan los peligros potenciales de los científicos ciudadanos que manipulan el producto químico si se toman medidas para informarles adecuadamente de los riesgos.
El flujo de trabajo propuesto utiliza materiales y reactivos que son de uso general. Requiere equipos que estén disponibles en entornos de laboratorio básicos, a menudo rurales. Estos métodos son baratos, altamente resistentes a los inhibidores que a menudo se encuentran en muestras ambientales o muestras que no se pueden procesar con kits de extracción, y eliminan la necesidad de un termociclador de alta precisión. Este estudio presenta una tubería para el muestreo y la detección del SARS-CoV-2 de reservorios ambientales en superficies comúnmente tocadas y raramente desinfectadas de los hogares y el medio ambiente urbano.
Protocol
Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista detallada de reactivos y suministros, incluidos los números de catálogo, el fabricante y los costos correspondientes.
1. Muestreo del entorno urbano
- Alcance científico ciudadano
- Reclutar científicos ciudadanos utilizando un llamado directo y claro a la acción lanzado a través de las redes locales y sociales. Cree un identificador de redes sociales (por ejemplo, #swab4corona)para conectar el tema a través del contenido de las redes sociales.
- Cree una cuenta de correo electrónico para la comunicación directa entre el equipo del laboratorio y cada científico ciudadano, administrada por una persona que domine los principales idiomas de la región de interés (por ejemplo, español e inglés para el condado de San Diego).
- Construir una plataforma segura de gestión de muestras basada en la web (SMP) para servir como una base de datos, un sistema de gestión de información de laboratorio (LIMS), y para comunicarse con los científicos ciudadanos.
NOTA: El SMP proporciona una ubicación centralizada donde los usuarios solicitan un kit, acceden a los protocolos de recopilación de muestras, envían metadatos de muestra y solicitan una recogida de kits de muestra completados. - Cree un enlace al SMP (por ejemplo, https://demo.covidsample.org/) (Figura 1) para que las personas soliciten participar en el esfuerzo de muestreo ambiental respondiendo a las preguntas relacionadas con la bioseguridad especificadas en un formulario en línea.
- Acceso seguro al SMP mediante una interfaz de programación de aplicaciones de autenticación facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube. Dar a los usuarios aprobados acceso al SMP.
NOTA: Consulte la documentación para obtener una descripción del protocolo 31 de OAuth2.0 para la autenticación y autorización. Proporciona un proceso de inicio de sesión sin fricciones para los voluntarios científicos ciudadanos. También permite a los usuarios iniciar sesión con una cuenta existente, lo que elimina la necesidad de crear una solución de inicio de sesión personalizada y administrar las credenciales de usuario, lo que ahorra una cantidad significativa de tiempo y fomenta la participación. Según informes recientes, el servicio de correo electrónico gratuito disponible para el proveedor de servicios informáticos en la nube elegido tiene aproximadamente 1.5 mil millones de usuarios de correo electrónico activos mensualmente; requerir una cuenta de correo electrónico de este proveedor de servicios para la participación no se considera un factor desalentador. - Explicar el objetivo del estudio y las consideraciones de bioseguridad a los científicos ciudadanos en el SMP antes de que soliciten su primer kit. Proporcione un complemento multilingüe para permitir la navegación en cualquiera de los idiomas disponibles en un servicio de traducción automática neuronal multilingüe facilitado por un proveedor de servicios informáticos en la nube.
- Incluir en el apartado de muestreo protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español.
- Asigne un identificador único a cada kit y diseñe la interfaz de usuario para utilizar los botones vinculados al ID de muestra para agilizar el proceso de entrada de datos (Figura 1A).
- Utilice un software de planificación de rutas de entrega con una aplicación de dispositivo móvil para ser utilizado por los conductores para optimizar las rutas de entrega / recogida y notificar a los científicos ciudadanos de los tiempos estimados precisos de llegada.
- Construya la plataforma LIMS en una pila de servicios web PHP y hospede en una plataforma de alojamiento comercial (el sistema operativo sugerido, el software del servidor web y el software de base de datos se especifican en la Tabla de materiales).
- Proporcione una interfaz de aplicación segura basada en web para permitir que el personal del laboratorio administre los datos de forma rápida y sencilla en lims. Proporcionar visualización de datos mediante una interfaz de programación de aplicaciones de gráficos de datos facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube.
- Visualice los datos geoespaciales utilizando una interfaz de programación de aplicaciones geoespaciales facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube. Almacenar los datos enviados al LIMS a través del SMP para facilitar (1) el almacenamiento centralizado de los datos del proyecto; (2) seguimiento de flujos de trabajo de procesamiento de muestras/datos; y (3) gestión de la logística de la distribución de kits de muestras a científicos ciudadanos.
- Proteja los metadatos enviados mediante las mejores prácticas (por ejemplo, https://demo.covidsample.org/).
- Pre-cargue información como id. de kit de muestra, ID de muestra, fecha, hora y coordenadas del sistema de posicionamiento global (GPS) (recopilada automáticamente de una imagen del sitio) para permitir el cumplimiento del tipo de datos y minimizar el envío de datos erróneos o faltantes por parte del usuario (Figura 1B). Incluya los siguientes campos que el científico ciudadano debe rellenar de forma manual y rápida (<1 min): fecha y hora de la recolección, una breve descripción de la ubicación y una imagen del sitio de muestreo.
- Sanitize todos los datos cargados y valide para el tipo de datos. Por ejemplo, valide los datos de imagen cargados por los usuarios para seleccionar .jpg archivos, cámbiele el nombre con el identificador de ejemplo para una asociación rápida con el ejemplo y almacene las imágenes cargadas en una ubicación segura independiente a la que no puedan acceder los usuarios.
- Active la opción para solicitar la entrega y recogida del kit cuando se hayan completado todas las muestras (16). Adicionalmente, activa la opción de solicitar un nuevo kit para ser entregado en el momento de la recogida del anterior (Figura 1A).
NOTA: Para los voluntarios que prefieren una plataforma no basada en la web y para aquellos preocupados por revelar su ubicación GPS (por ejemplo, los miembros de la comunidad preocupados por su estado migratorio), los kits se pueden entregar en un lugar de reunión acordado y se les pide a los voluntarios que registren una versión escrita de la recopilación de datos. Para la comunicación entre el laboratorio y cada científico ciudadano, tener un miembro bilingüe del proyecto disponible para llamadas telefónicas y mensajes de texto.
- Hisopo para Corona
- Identificar una ventana de tiempo epidemiológicamente relevante para el esfuerzo de muestreo.
- Construya un kit que contenga todos los suministros de muestreo, incluido el equipo de protección personal necesario (es decir, máscara, guantes), un protocolo de muestreo e información relevante para la bioseguridad (Figura 2). Pre-etiquete cada tubo con el identificador único asignado (ID de muestra).
- Los hisopos rara vez desinfectan las superficies que están expuestas a fómites aerosolizados en los hogares y el medio ambiente urbano.
- Use la mascarilla proporcionada en público y un nuevo par de guantes para la recolección de cada muestra para evitar la contaminación cruzada. Después de terminar el muestreo, use el desinfectante de manos proporcionado.
- Moje un hisopo absorbente de poliésterde 1 cm 2 (por ejemplo, almohadillas de fregona) con un detergente (por ejemplo, sulfato de dodecil sódico al 0,5% (SDS)) para inactivar el virus interrumpiendo su envoltura y para estabilizar el ARN desnudo induciendo el despliegue de RNasas32.
- Hisopo una superficie de 10 cm2. Con la ayuda de un palillo de dientes, sumerja completamente cada hisopo de muestra en el tubo premarcado correspondiente que contiene 200 μL de solución de tiocianato de guanidinio (GITC). Almacene los tubos a 4 °C hasta que sean transportados al laboratorio. Una vez que las muestras lleguen al laboratorio, guárdelas a -80 °C.
NOTA: GITC es un irritante tóxico; evitar el contacto con la piel. La solución GITC es fácil de preparar a partir de productos químicos de laboratorio comunes, para la receta ver33,34. Inactiva el virus, estabiliza el ARN desnaturalizando las RNasas34,35,36y estabiliza las muestras a temperatura ambiente. El kit, sin embargo, incluye bolsas de hielo para mantener las muestras frías sin la necesidad de usar refrigeradores domésticos para el almacenamiento.
2. Detección del SARS-CoV-2
- Aislamiento total de ARN
- Desinfecte las superficies, equipos y pipeteadores con una solución de sulfato de cobre de 2 mM y peróxido de hidrógeno al 3%; seguido de una solución de blanqueador al 10%, bicarbonato de sodio al 90 mM, SDS al 5% y NaOH al 2,5%. Limpie bien con agua destilada seguida de etanol al 75%.
NOTA: Estas soluciones son una alternativa a las soluciones disponibles comercialmente. - Descongelar muestras sobre hielo. Muestras de vórtice durante 2 min a velocidad media.
- Para aumentar la velocidad de la selección, procese las muestras en piscinas. Si un grupo es positivo, extraiga el ARN de cada muestra de forma independiente para encontrar la/s muestra/s positiva/s. Combine las muestras de cada kit de muestreo (16 en total) en 2 grupos de 8 muestras.
Nota : tener 8 muestras por grupo significa que sólo 2 grupos deben procesarse por kit. Si una agrupación es positiva, las muestras individuales se vuelven a procesar para el análisis RT-LAMP individual. Esto reduce el tiempo, los costos y los reactivos. - Pool 50 μL de cada una de las 8 muestras en un tubo de microcentrífuga (volumen total 400 μL); guarde la muestra restante a -80 °C. Añadir 0,2 volúmenes (80 μL) de cloroformo, vórtice durante 15 s, y luego incubar durante 20 min a 4 °C. Centrífuga a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.
- Transfiera la capa acuosa (líquido transparente) a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde la interfaz restante y el líquido rosado en el congelador de -80 °C; estas fracciones contienen ADN y proteínas33,36.
- Añadir un volumen igual de isopropanol (~200 μL) y 2,6 μL de glucógeno coprecipitante (15 mg mL-1)37. Mezclar bien e incubar a -20 °C durante al menos 1 h, seguido de 4 °C durante 10 min para precipitar el ARN.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí incubando muestras a -20 °C durante la noche en lugar de 1 h. - Centrífuga a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C. Retire el sobrenadante sin molestar el pellet. Resuspend el pellet en 50 μL de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y añadir un volumen igual (50 μL) de acetato de amonio 5 M libre de ARNasa y 2,5 volúmenes (250 μl) de etanol al 100%7,38.
NOTA: Los iones de amonio inhiben la polinucleótido quinasa si se utilizan en un proceso aguas abajo38. La mezcla precipita ARN dejando trifosfatos y oligosacáridos desoxinucleósidos en solución38. - Mezclar bien e incubar a -20 °C durante al menos 1 h, seguido de 4 °C durante 10 min para precipitar el ARN.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí incubando muestras a -20 °C durante la noche en lugar de 1 h. - Centrífuga a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C. Lavar el pellet con 1 mL de frío (-20 °C), recién hecho al 75% de etanol. Centrífuga a 8.000 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta P10 para evitar molestar el pellet.
- Seque al aire el pellet durante 10-15 min hasta que no quede etanol. Resuspend el pellet en 50 μL de agua tratada con DEPC, añadir 5 μL de tampón de 10x DNasa + 1μL de DNasa (2 Unidades μL-1), e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Añadir 0,1 volúmenes (5,6 μL) de reactivo de inactivación de la DNasa, incubar a temperatura ambiente durante 5 min y mezclar suavemente cada minuto. Centrífuga a 13.000 × g durante 2 min, y transferir sobrenadante a un tubo nuevo (~50 μL). Coloque el tubo sobre hielo inmediatamente mientras prepara las reacciones RT-qPCR o RT-LAMP, o guárdelo en un congelador de -20 °C.
NOTA: Realice el aislamiento de ARN en una habitación libre de amplificación para evitar la contaminación por arrastre.
- Desinfecte las superficies, equipos y pipeteadores con una solución de sulfato de cobre de 2 mM y peróxido de hidrógeno al 3%; seguido de una solución de blanqueador al 10%, bicarbonato de sodio al 90 mM, SDS al 5% y NaOH al 2,5%. Limpie bien con agua destilada seguida de etanol al 75%.
- Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa múltiplex (RT-LAMP)
- Preparar una solución de mezcla de cebadores 20X (Tabla 1) para cada juego de cebadores (Tabla 2). Prepare la mezcla de reacción RT-LAMP (Tabla 3) a temperatura ambiente con un exceso de volumen del 10% para tener en cuenta la pérdida de pipeteo.
NOTA: La mezcla maestra colorimétrica LAMP 2X con uracilo-ADN glicosilasa termolábil antártica (UDG) evita la amplificación de la contaminación del ADN por reacciones previas20,28. - Vórtice y girar hacia abajo de la mezcla. Dispense 20 μL de la mezcla en cada tubo de reacción: muestra, punción, control positivoy control negativo. Incubar las reacciones en los tubos a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que el UDG actúe sobre la posible contaminación por arrastre.
- Añadir 5 μL de ARN a la reacción de la muestra, 5 μL de ARN + 2,5 μL (450 copias) de ARN sintético del SARS-CoV-2 a la reacción con pinchos, 2,5 μL (450 copias) de ARN sintético del SARS-CoV-2 a la reacción de control positiva, y 5 μL de H2O a la reacción de control negativa. Mezclar bien, y girar hacia abajo las reacciones; descongelar todo el ARN en el hielo.
- Mientras que el termociclador, o el baño de agua, se calienta a 65 °C, permita que todas las reacciones permanezcan a temperatura ambiente. El UDG se inactivará a >50 °C. Coloque las reacciones en el termociclador (use tapa de calor), incube a 65 °C durante 40 min y deje que las reacciones alcancen la temperatura ambiente (~ 22 °C durante 5 min), o enfríe en el hielo durante 1 min. Analice los resultados utilizando la característica colorimétrica (observación simple) o ejecutando los productos en un gel de agarosa.
NOTA: Aunque el límite de detección (LOD) es de 10 copias por reacción, la frecuencia de detección aumenta a medida que el número de copias se acerca a las 500 copias por reacción (Figura 3A). Para la observación colorimétrica, tenga en cuenta que un resultado negativo se indica con rosa (pH = 8,8), mientras que un resultado positivo se indica con amarillo (pH = 5) (Figura 3B). La opción colorimétrica evita la apertura de los tubos RT-LAMP después de la amplificación, lo que reducirá el volumen de los productos RT-LAMP en el entorno de trabajo y la contaminación por arrastre. Para la electroforesis en gel, prepare un gel de agarosa al 1,5% con tinción de gel de ADN 1X en tampón Tris/Borato/EDTA al 0,5%. Cargue 25 μL de la reacción + 5 μL de colorante de carga 6X en cada pozo. Ejecute el gel a 100 V durante 60 min. No se necesita un marcador molecular ya que las muestras positivas muestran un patrón de escalera (Figura 3C).
- Preparar una solución de mezcla de cebadores 20X (Tabla 1) para cada juego de cebadores (Tabla 2). Prepare la mezcla de reacción RT-LAMP (Tabla 3) a temperatura ambiente con un exceso de volumen del 10% para tener en cuenta la pérdida de pipeteo.
Representative Results
Muestras recogidas por científicos ciudadanos para la detección del SARS-CoV-2. Durante un periodo de 8 meses (mediados de marzo a la tercera semana de noviembre de 2020), 482 ciudadanos fueron aprobados para participar en este proyecto, de los cuales 350 (73%) solicitó un kit. Se entregaron un total de 362 kits (es decir, algunos participantes solicitaron varios kits), y 246 (70%) fueron devueltos (Figura 4A,B). Se procesaron las 4.080 muestras contenidas en estos kits. Los sitios de recolección se distribuyeron en los distritos costeros del norte, centro-norte, centro y sur del condado, así como algunos en los distritos orientales (Figura 4A). Estos distritos tienen la mayor densidad de población del condado de San Diego y los casos de COVID-19 más documentados, según informó la Agencia de Servicios de Salud Humana de San Diego39.
Los ciudadanos solicitaron la recogida de la mayoría de los kits muestreados (es decir, tasa de éxito promedio: 70,4%). Cada día, se solicitaron 1-16 kits, y 0-14 kits fueron devueltos al laboratorio (Figura 4B). Una encuesta a los científicos ciudadanos mostró que la recolección de un kit completo (16 muestras) tomó 1-3 h distribuidas a lo largo de un promedio de 8 días (Figura 4A y Tabla 4). La gran mayoría de los kits estaban completos (91,1%), lo que significa que contenían un hisopo dentro de los 16 tubos de muestra, y los datos de muestreo correspondientes se cargaron en el LIMS (Figura 4A y Tabla 4).
Detección de SARS-CoV-2 mediante extracción de GITC-cloroformo y amplificación isotérmica mediada por bucle múltiplex de transcriptasa inversa (RT-LAMP). Para el ensayo colorimétrico RT-LAMP, se utilizaron dos conjuntos de cebadores11,20,28 para atacar los genes nucleocáppsida(N2)y de la envoltura(E1) (Tabla 2). Las secuencias reconocidas por estos cebadores se encuentran en la misma región que los cebadores y sondas aprobados por los CDC40 y la Unión Europea (UE)41 para el diagnóstico humano de COVID-19 por RT-qPCR. Estos resultados corroboran lo que Zhang et al.28 describieron, en el que la adición de clorhidrato de guanidina de 60 mM a la reacción aumenta el LOD cuando se ejecuta en múltiplex. El LOD a una frecuencia del 100% fue de 500 copias por reacción de 25 μL (Figura 3A,B). En el RT-LAMP colorimétrico, las muestras positivas cambiaron de color de rosa a amarillo debido a un cambio de pH de ~ 8 a 5.5 (Figura 3B). Cuando la reacción se volvió naranja a números de copia baja, las muestras se ejecutaron en un gel de agarosa al 1,5% para confirmar que eran positivas y dieron lugar a un patrón similar a una escalera (Figura 3C). RT-LAMP se utilizó para detectar el SARS-CoV-2 en muestras de ARN agrupadas.
Para controlar los falsos negativos debidos a los inhibidores de la reacción, cada muestra se probó en una reacción adicional con 500 copias de SARS-CoV-2 sintético. Las muestras agrupadas positivas se desreplicaron aislando el ARN de cada muestra individual en la piscina y se ejecutaron en una reacción RT-LAMP para determinar la identidad de la muestra positiva. Los resultados de la detección se cargaron en el LIMS, donde el ID de muestra único se emparejó con la información sobre la fecha, la hora, las coordenadas GPS, el sitio y la imagen de la muestra.
Métodos rt-pcr en tiempo real y tradicionales: inhibición por contaminantes de la muestra. Para seleccionar el mejor método adecuado para la línea de detección propuesta, se probaron otros métodos de amplificación de ARN con muestras ambientales recogidas por una cohorte piloto de científicos ciudadanos. Ejemplos de los resultados de cada uno de estos métodos se presentan en la Figura 5 para representar su sensibilidad a los inhibidores ambientales y el ruido de la señal de fondo a bajas concentraciones de número de copias virales.
Seis formulaciones de RT-qPCR (Tabla de Materiales) aprobadas por los CDC y la OMS fueron probadas para la detección del virus en muestras ambientales. Se siguieron los protocolos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, así como con las directrices de los CDC para la detección del SARS-CoV-2 en entornos clínicos40. Las reacciones que contenían diferentes concentraciones de controles sintéticos de ARN del SARS-CoV-2 se dispararon en muestras de superficie hisopada después del aislamiento de ARN crudo. Todas las mezclas maestras fueron sensibles a los inhibidores a concentraciones lod del control positivo (Figura 5A).
Para evitar los inhibidores de estas tecnologías en tiempo real, se probó un sistema tradicional de RT-PCR. Se utilizó un sistema rt-pcr de un solo paso (Table of Materials) para amplificar el gen nucleocáppsida utilizando los conjuntos de cebadores N1, N2,y el gen envolvente utilizando el conjunto de cebadores E1 aprobado por los CDC (EE.UU.) y el ECDC (UE), respectivamente (Tabla 2). Se siguieron los protocolos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, así como con las directrices de los CDC para la detección del SARS-CoV-2 en entornos clínicos40. Los conjuntos de cebadores N1 y N2 diseñados por los CDC producen un producto de ~ 70 pb; sin embargo, los positivos de bajo número de copias no se distinguieron del ruido de fondo de amplificación del control negativo (Figura 5B),que introdujo falsos positivos en los resultados. El producto de los cebadores E1 tenía una señal débil a bajo número de copias (Figura 5B),introduciendo falsos negativos en losresultados. Además, el método de RT-PCR probado seguía siendo sensible a los inhibidores presentes en las muestras ambientales (datos no mostrados).
Se han desarrollado otros métodos para detectar cantidades muy pequeñas de secuencia objetivo. Uno de estos métodos es la Amplificación del Círculo Rodante (RCA), con lo cual el reconocimiento de la secuencia objetivo, ARN o ADN, por una sonda lineal específica, una ligasa circulariza la plantilla. Utilizando cebadores diseñados para hibridar con la sonda, una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra amplifica la sonda en una reacción isotérmica42. Es la sonda que identificó el objetivo, que se amplifica, y no la secuencia de destino, lo que hace que este método sea altamente sensible43. Wang et al.44 publicaron un protocolo RCA para la detección directa del ARN del SARS-CoV-1. El método fue modificado para utilizar cebadores específicos para el SARS-CoV-2. Desafortunadamente, en el control sin plantilla (NTC), la sonda circulariza y produce producto en ausencia de plantilla de ARN, incluso cuando se utiliza una amplia variedad de ligasas, incluida una ligasa sensible al SNP. En ausencia de ligasa, el NTC no mostró amplificación de la sonda linealizada (Figura 5C).
Figura 1:Plataforma de muestreo basada en la web con interfaz de recopilación de datos de muestras para dispositivos móviles. (A) Se creó un sitio web, que contiene un complemento multilingüe, para mediar en la interacción entre el laboratorio y los científicos ciudadanos. La plataforma se utilizó para la solicitud de entrega/recogida de kits de muestra y el envío de datos de muestras. La plataforma contenía protocolos detallados de muestreo gráfico y audiovisual en inglés y español. (B)Vista de dispositivo móvil utilizada para cargar datos de muestra: fecha, hora, coordenadas GPS, descripción del sitio de muestra y una imagen del sitio de recolección. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2; GPS = Sistema de Posicionamiento Global. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Kit de recolección de muestras. Los científicos ciudadanos recibieron un refrigerador que contenía dos bolsas de hielo, una hoja de datos de seguridad para informar a los voluntarios sobre los peligros de manipular la solución GITC, un protocolo detallado de muestreo y uso de máscaras, una máscara KN95, una bolsa de residuos, una botella de aerosol con desinfectante de manos, una botella de aerosol con 0,5% de SDS, 16 pares de guantes, una pequeña bolsa con 16 palillos de dientes y 16 hisopos de poliéster, 16 tubos de microcentrífuga preetiquetados que contienen 200 μL de solución GITC, una caja que contiene los tubos de muestreo y una bolsa utilizada como contenedor secundario para la caja del tubo en caso de derrame. Abreviaturas: GITC = tiocianato de guanidinio; SDS = sulfato de dodecil sódico. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa multiplexada (RT-LAMP). Reacciones multiplexadas utilizando cebadores para los genes de la nucleocáppsida(N2)y de la envoltura(E1)del SARS-CoV-2 para detectar tan solo 10 copias del virus en la reacción. El ARN sintético del SARS-CoV-2 fue utilizado como control positivo. (A)Frecuencia de detección en RT-LAMP colorimétrico múltiplex del SARS-CoV-2 a diferentes números de copias del genoma por reacción. Valor medio de cinco réplicas en rosa. (B)Límite de detección (LOD) del SARS-CoV-2 en rt-lamp colorimétrico múltiplex; amarillo = positivo (pH ~5); rosa = negativo (pH ~8). (C)Patrón de escalera de reacciones positivas de SARS-CoV-2 RT-LAMP en electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2; rxn = reacción. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Ubicación de los kits de muestreo de científicos ciudadanos en el condado de San Diego y tasa de éxito de los kits solicitados. (A) Los puntos naranjas representan la ubicación de 1 kit de muestreo, que contiene 16 muestras. El gráfico circular azul muestra el porcentaje de kits que tardaron varios días desde que se entregaron a los científicos ciudadanos hasta que se devolvieron al laboratorio. Número de días entre paréntesis. El gráfico circular naranja muestra el porcentaje de kits con diferente número de muestras completadas de un total de 16 muestras. Número de muestras completadas que contienen un hisopo dentro del tubo de muestra y los datos de muestreo correspondientes cargados en el LIMS entre paréntesis. (B)Porcentaje de kits que fueron devueltos al laboratorio (puntos), y número total de kits solicitados (barras), en relación con la fecha en que se solicitó el kit. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5: Métodos alternativos de detección del SARS-CoV-2 RNA. (A) RT-qPCR detección del gen de la nucleocáppsida(N)del SARS-CoV-2 utilizando el conjunto de cebadores N2. Muestras ambientales agrupadas con 900 copias (verde) o 9 (naranja) de SARS-CoV-2. Controles positivos de los mismos números de copia en azul. Arrow indica la disminución en la detección de fluorescencia del control positivo de número de copia baja cuando la muestra ambiental está presente. (B)Detección tradicional de RT-PCR del SARS-CoV-2. Arriba: Productos RT-PCR del gen nucleocáppsida utilizando los conjuntos de cebadores N1 y N2. Se observa una débil señal de fondo en el control sin plantilla. Abajo: Productos RT-PCR del gen de la envoltura utilizando el juego de cebadores E1. Se observa una señal muy baja en la concentración de LOD. Las flechas azules muestran un producto positivo esperado: (arriba) ~ 70 pb y (abajo) 113 pb en electroforesis en gel de agarosa al 2%. (C) RCA de ARN del SARS-CoV-2. La sonda circular amplifica en presencia de ligasa y ausencia de plantilla de ARN (NTCcir); en ausencia de ligasa y plantilla de ARN sonda lineal no amplifica (NTClin). Abreviaturas: SARS-CoV-2 = coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2; RFU = unidades de fluorescencia relativa; bp = pares de bases; rxn = reacción; MM = marcador molecular; RT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa; RT-qPCR = RT-PCR cuantitativa en tiempo real; RCA = amplificación del círculo rodante; NTC= control sin plantilla; LOD = límite de detección; rxn = reacción. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| cebador | Concentración de 20X (μM) | Concentración de 1X (μM) |
| Fip | 32 | 1.6 |
| BIP | 32 | 1.6 |
| F3 | 4 | 0.2 |
| B3 | 4 | 0.2 |
| LoopF | 8 | 0.4 |
| BucleB | 8 | 0.4 |
Tabla 1: Formulación para mezcla de cebadores RT-LAMP 20X. En la reacción RT-LAMP, 6 cebadores reconocen 8 regiones del ADN objetivo. Abreviaturas: amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa; FIP = cebador interno delantero; BIP = cebador interno hacia atrás; F3 = cebador de desplazamiento hacia adelante; B3 = cebador de desplazamiento hacia atrás; LoopF = cebador de bucle delantero; LoopB = cebador de bucle hacia atrás.
| cebador | secuencia | blanco | Tamaño del producto | |||
| RT-LAMP9,18,19 | ||||||
| E1-F3 | TGAGTACGAACTTATGTACTCAT | E | patrón similar a una escalera | |||
| E1-B3 | TTCAGATTTTTAACACGAGAGT | |||||
| E1-FIP | ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG | |||||
| E1-BIP | TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT | |||||
| E1-LoopB | GCGCTTCGATTGTGTGCGT | |||||
| E1-LoopF | CGCTATTAACTATTAACG | |||||
| N2-F3 | ACCAGGAACTAATCAGACAAG | N | ||||
| N2-B3 | GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT | |||||
| N2-FIP | TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC | |||||
| N2-BIP | CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA | |||||
| N2-LoopF | GGGGGCAAATTGTGCAATTTG | |||||
| N2-LoopB | CTTCGGGAACGTGGTTGACC | |||||
| RT-qPCR38 | ||||||
| 2019-nCoV_N1-F | GACCCCAAAATCAGCGAAAT | N | 72 pb | |||
| 2019-nCoV_N1-R | TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG | |||||
| 2019-nCoV_N1-P | 5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3' | |||||
| 2019-nCoV_N2-F | TTACAAACATTGGCCGCAAA | N | 67 pb | |||
| 2019-nCoV_N2-R | GCGCGACATTCCGAAGAA | |||||
| 2019-nCoV_N2-P | 5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3' | |||||
| RT-PCR39 | ||||||
| E1_Sarbeco_F | ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT | E | 113 pb | |||
| E1_Sarbeco_R | ATATTGCAGCAGTACGCACACA | |||||
Tabla 2: Cebadores utilizados para RT-LAMP, RT-qPCR y RT-PCR. Se enumeran las secuencias de cebadores, el gen diana, el tamaño esperado del producto y la referencia correspondiente. Abreviaturas: RT-LAMP = amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa; RT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa; bp = pares de bases; RT-qPCR = RT-PCR cuantitativa en tiempo real; E1 = gen de la envoltura; N2 = gen de la nucleocáppsida; F = cebador delantero; R = cebador inverso; P = Sonda ; FIP = cebador interno delantero; BIP = cebador interno hacia atrás; F3 = cebador de desplazamiento hacia adelante; B3 = cebador de desplazamiento hacia atrás; LoopF = cebador de bucle delantero; LoopB = cebador de bucle hacia atrás.
| Reactivo | Volumen (μL) |
| WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix con UDG | 12.5 |
| N2 Primer Mix (20x) | 1.25 |
| E1 Primer Mix (20x) | 1.25 |
| Clorhidrato de guanidina (600 mM)* | 2.5 |
| ARN diana | 5 |
| H2O libre de nucleasa | 2.5 |
| Volumen total | 25 |
Tabla 3: Mezcla maestra de reacción para rt-lamp colorimétrico múltiplex. (*) Se ha demostrado que el clorhidrato de guanidina aumenta la sensibilidad y la velocidad de la reacción mediante un mecanismo no caracterizado28. Abreviaturas: LAMP = amplificación isotérmica mediada por bucle; UDG = uracilo-ADN glicosilasa; N2 = gen de la nucleocáppsida; E1 = gen de la envoltura; DEPC = dietilpirocarbonato.
| Ciudadanos aprobados | Ciudadanos que solicitaron un kit | Kits entregados | Kits muestreados devueltos | Jornadas dedicadas al muestreo | % kits completos | % de kits incompletos | Muestras procesadas | |
| 482 | 72.6% (350/482) | 362 | 70.4% (255/362) | significar | 8 | 91.1 (224/246) | 8.9 (22/246) | 4,080 |
| mediana | 3 | |||||||
Tabla 4:Hisopado para el SARS-CoV-2 por los números. Tasas de éxito de divulgación y muestreo. Abreviatura: SARS-CoV-2 = coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2.
Discussion
Participación ciudadana científica. Científicos ciudadanos fueron reclutados para hisopar superficies en todo el condado de San Diego para muestrear y detectar la presencia de SARS-CoV-2 en el entorno urbano. La mayoría de los kits de muestreo entregados (70%) fueron devueltas al laboratorio, y de ellas, casi todas las muestras estaban completas (91%) (Figura 3A, B y Cuadro 4). Los voluntarios podían solicitar fácilmente la entrega/recogida de kits a través de la plataforma basada en la web, y el software de planificación de rutas de entrega notificaba a los científicos ciudadanos los tiempos estimados de llegada, ambos factores probablemente significativos para el éxito observado. El tiempo promedio desde que se entregó el kit al científico ciudadano hasta que fue devuelto al laboratorio fue de 8 días, con una mediana de 3 días y un rango de 1-64 días (Figura 3A y Tabla 4). Recordatorios más frecuentes a los voluntarios probablemente reducirían este tiempo de retraso.
La plataforma de recopilación de datos fue utilizada con éxito por una gran mayoría de los usuarios (73%) (Cuadro 4). Si bien no se midieron los esfuerzos de los científicos ciudadanos, las pruebas de campo mostraron que la plataforma de recopilación de datos redujo significativamente el esfuerzo y el tiempo necesarios para completar adecuadamente la recolección de muestras. Por lo tanto, la reducción de la cantidad de contabilidad alentó la participación de los científicos ciudadanos. La plataforma basada en la web pretendía superar las limitaciones demográficas proporcionando un servicio de traducción automática neuronal multilingüe y proporcionando protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español. Esto fue solo parcialmente exitoso, ya que se recolectaron menos muestras tanto del Condado de South Bay como del Condado norte, donde reside la mayoría de la población hispana / latina del condadocon 45 años. Estas áreas también albergaban el 63% (1,700 casos por cada 100,000) del total de casos de COVID-19 en el condado de San Diego con la prevalencia más alta de la enfermedad46 y la tasa de hospitalizaciones (62%)47,48. Aunque la mayoría de las muestras provinieron del Condado Central, se recogió un número representativo de los distritos más afectados por COVID-19 y solo una pequeña fracción de las muestras fue positiva, lo que sugiere que los reservorios superficiales de SARS-CoV-2 en el entorno urbano son relativamente raros.
Procesamiento de muestras. Los hisopos de muestreo se humedecieron con SDS, que inactivaron el virus al interrumpir su envoltura y estabilizaron el ARN desnudo mediante el despliegue de RNases32. Convenientemente durante la recolección, el detergente en el hisopo limpió la superficie muestreada. Las muestras ambientales a menudo contienen cantidades muy pequeñas de ARN. Para maximizar la recuperación, el aislamiento del ARN fue realizado usando gitc-basado, columna-libre, método crudo de la extracción. GITC, un fuerte agente caotrópico, interrumpe los enlaces de hidrógeno que mantienen el plegamiento de proteínas (es decir, efecto hidrofóbico). Esta acción da lugar a la inactivación de partículas virales, y el ARN permanece estable debido a la inhibición de las ARN34,35,36. La solución GITC mantuvo la estabilidad de las muestras de ARN sin consideraciones estrictas de cadena de frío, lo que permitió a los ciudadanos mantener las muestras a temperatura ambiente si no se disponía de un congelador para las bolsas de hielo proporcionadas. Para reducir el peligro potencial que este reactivo representa cuando se produce un contacto directo con la piel o la mucosa, los ciudadanos fueron informados de estos riesgos mediante la inclusión de una hoja de datos de seguridad del material proporcionada en el kit y se colocó un sello de advertencia en la caja que contiene los tubos.
El método crudo de extracción de GITC-cloroformo ayudó a la recuperación de rastros de ARN de los hisopos, y como se muestra en la amplificación de muestras con picos, los inhibidores rara vez persistieron en las muestras después de la extracción. Las muestras, que fueron negativas para el SARS-CoV-2 y no mostraron inhibición de RT-LAMP, representaron verdaderos negativos o tuvieron un número de copias más bajo que el LOD con una frecuencia del 100%. Por el contrario, la detección de ARN viral en una superficie no implica directamente el riesgo de transmisión a través del contacto, ya que es necesario analizar la infectividad del virus a partir de muestras positivas. La detección rápida del medio ambiente, no limitada por la disponibilidad de suministros sofisticados o personal altamente calificado, es crucial para evaluar si las superficies constituyen un reservorio viral y para dirigir mejor los esfuerzos de prevención y contención.
RT-LAMP fue seleccionado para ser el mejor método adecuado para la tubería de detección propuesta. Demostró ser un método rápido y barato que era altamente resistente a la mayoría de los inhibidores restantes y tan sensible y específico como otros métodos de RT-qPCR. Debido a su uso en entornos clínicos durante la pandemia de SARS-CoV-2, la disponibilidad de kits rt-qPCR se vio afectada por la demanda mundial. Además, las técnicas de RT-qPCR,incluso las formuladas para resistir a los inhibidores, eran sensibles a las sustancias contenidas en las muestras ambientales recogidas por una cohorte piloto de científicos ciudadanos, incluso después del uso de otras estrategias comunes para reducir la competencia de los inhibidores por la unión enzimática49. Estos hallazgos son corroborados por un estudio reciente que comparó ambos métodos para detectar sars-CoV-2 en muestras de hisopos de caramelos manejados por pacientes de COVID-19 y encontró más del 83% de concordancia de resultados, con un 25% menos de inhibición en muestras analizadas por RT-LAMP15. Además, la extracción de crudo GITC-cloroformo, junto con RT-LAMP, redujo el costo de los reactivos y suministros en un 42% en comparación con la extracción del kit de ARN y RT-qPCR (Tabla de Materiales).
Este método permitió el análisis de alto rendimiento de miles de muestras de hisopos superficiales. Hasta 80 piscinas, que representan 640 muestras, se procesaron en 2 días desde la extracción de ARN hasta la detección de SARS-CoV-2 por RT-LAMP. El protocolo propuesto es semicuantitativo, limitado a la detección de ARN viral, y no indica la presencia de partículas virales infecciosas. Se requieren análisis adicionales para evaluar el riesgo de transmisión del SARS-CoV-2 de los fómites infectados presentes en las superficies hisopadas.
Este estudio presenta un protocolo para establecer rápidamente una estrategia de pruebas que incluya un flujo de trabajo efectivo cuando se enfrenta a una emergencia de salud con una enfermedad transmisible. El protocolo de muestreo propuesto es simple y utiliza suministros que se encuentran comúnmente en los hogares, y el método de detección viral se lleva a cabo en equipos disponibles en entornos básicos de laboratorio, como un baño de agua en lugar de un termocicloador. Los costos de los reactivos RT-LAMP son significativamente más bajos que los necesarios para RT-qPCR y menos susceptibles a escenarios de alta demanda global. Este estudio sirve de marco para la evaluación de reservorios virales ambientales en futuros brotes epidémicos y pandemias mundiales.
Disclosures
Todos los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a los investigadores del Instituto de Información Viral (VII), la Dra. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, el Dr. Gregory Peters, el Dr. Stuart A. Sandin y la Dra. Jennifer Smith por tomarse el tiempo para recolectar numerosas muestras. También agradecemos al Dr. Rob Knight, al Dr. Jack Gilbert, al Dr. Pedro Balda-Ferre y a la Dra. Sarah Allard del departamento de Pediatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de San Diego California (UCSD) por facilitar controles positivos y comentarios útiles. Agradecemos a Stacey Carota (SDSU Facultad de Ciencias) y Gina Spidel (SDSU) por el apoyo logístico y a Juan Rodríguez por el arte y diseño gráfico del protocolo de muestreo. Agradecemos a todos los participantes su compromiso y dedicación a este proyecto en tiempos muy difíciles. Este trabajo fue apoyado por una generosa donación de la Dra. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) y la fundación nacional de ciencias RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Número de premio: 2030479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMP, LIMS, and community outreach: | |||
| Authentication Application Programming Interface | Google Sign-In | ||
| Commercial hosting platform | GoDaddy | ||
| Data Charting Application Programming Interface | Google Charts | ||
| Database software | MySQL | ||
| Delivery route planning software | Circuit | Circuit for Teams | |
| Free email service | Google Email | ||
| Geospatial Application Programming Interface | Google Maps API | ||
| Multilingual neural machine translation service | Google Translate | ||
| Online form | Google Form | ||
| Operating system | Linux | ||
| Web and database development | Big Rose Web Design | ||
| Web server software | Apache | ||
| Sampling kit: | |||
| Coolers | Coleman (Amazon) | B00363X3F2 | Cost (US$) per 100 rxns: 70 |
| Gallon Ziploc bags | Solimo (Amazon) | B07BJ495GL | Cost (US$) per 100 rxns: 18 |
| Glycerol (hand sanitizer) | FischerScientific | G33-4 | Cost (US$) per 100 rxns: 9 |
| Ice packs | Ice-Brix (Amazon) | B075GLD3X1 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
| Isopropanol (hand sanitizer) | FischerScientific | AA36644K7 | Cost (US$) per 100 rxns: 43 |
| KN95 masks | Echo-Sigma | Echo-Sigma | Cost (US$) per 100 rxns: 400 |
| Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet | Office Depot | 348037 | Cost (US$) per 100 rxns: 36 |
| 30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) | Anyumocz (Amazon) | B07T64FHXR | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
| RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 22-281 | Cost (US$) per 100 rxns: 83 |
| Sample ID solvent resistant labels | LABTAG | XST-10C1-1WH | Cost (US$) per 100 rxns: 68 |
| Swiffer WetJet pads (swabs) | Swiffer (Amazon) | B001F0RBT2 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Toothpicks | Kitchen Essential (Amazon) | B00PBK4NG6 | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS | Invitrogen | 15596018 | Cost (US$) per 100 rxns: 40 |
| Tube boxes | Genesee Scientific | 21-119 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
| Small Ziploc bags | Ziploc (Amazon) | B01LRKEI9K | Cost (US$) per 100 rxns: 8 |
| Zebra Thermal Transfer Desktop Printer | Zebra | GK420t | |
| Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160 | |||
| Trizol RNA extraction: | |||
| Ammonium Acetate RNase-free | Invitrogen | AM9070G | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | Cost (US$) per 100 rxns: 2 |
| GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) | Invitrogen | AM9515 | Cost (US$) per 100 rxns: 80 |
| Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol | FisherScientific | BP2818500 | Cost (US$) per 100 rxns: 30 |
| Molecular-grade Isopropanol | FisherScientific | BP2618500 | Cost (US$) per 100 rxns: 3 |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | Cost (US$) per 100 rxns: 110 |
| Multiplexed colorimetric RT-LAMP: | |||
| Guanidine Hydrochloride | Alfa Aesar | AAJ6548522 | Cost (US$) per 100 rxns: 1 |
| RT-LAMP E1-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
| RT-LAMP N2-Primers | IDT | n/a | Cost (US$) per 100 rxns: 7 |
| Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
| WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG | NEB | M1800S | Cost (US$) per 100 rxns: 210 |
| Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler | Eppendorf | 950030010 | |
| Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470 | |||
| Kit for RNA extraction: | |||
| QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 61904 | Cost (US$) per 100 rxns: 570 |
| RT-qPCR: | |||
| Synthetic SARS-CoV-2 RNA | ATCC | VR-3276SD | Cost (US$) per 100 rxns: 14 |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Applied Biosystems | 4444432 | Cost (US$) per 100 rxns: 180 |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes | IDT | 10006713 | Cost (US$) per 100 rxns: 20 |
| qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix | Quantabio | 95132-100 | |
| QuantiNova Pathogen | Qiagen | 208652 | |
| QuantiNova Probe | Qiagen | 208352 | |
| UltraPlex 1-Step ToughMix | Quantabio | 95166-100 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855196 | |
| Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 | |||
| RT-PCR: | |||
| SuperScript IV One-Step RT-PCR | Invitrogen | 12594025 | |
| Lab cleanup: | |||
| DNAZap | Invitrogen | AM9890 | |
| RNAZap | Invitrogen | AM9780 | |
References
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