Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/62379
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

Summary

Een citizen science project is ontworpen om inwoners van San Diego te werven om milieumonsters te verzamelen voor SARS-CoV-2. Er is een meertalig webgebaseerd platform gemaakt voor het indienen van gegevens met behulp van een gebruiksvriendelijke interface voor mobiele apparaten. Een laboratoriuminformatiebeheersysteem vergemakkelijkte het verzamelen van duizenden geografisch diverse monsters met realtime resultaattracking.

Abstract

Om de overdracht door de gemeenschap van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) tijdens de wereldwijde pandemie van 2020 te beheersen, hebben de meeste landen strategieën geïmplementeerd op basis van directe menselijke tests, gezichtsbedekking en oppervlaktedesinfectie. In de veronderstelling dat de belangrijkste transmissieroute aerosolen en ademhalingsdruppels omvat, hebben de inspanningen om SARS-CoV-2 bij vijanden te detecteren zich gericht op locaties die worden verdacht van een hoge prevalentie (bijv. ziekenhuisafdelingen, cruiseschepen en massatransportsystemen). Om de aanwezigheid van SARS-CoV-2 te onderzoeken op oppervlakken in de stedelijke omgeving die zelden worden gereinigd en zelden gedesinfecteerd, werden 350 burgers in dienst nemen uit de grotere San Diego County. In totaal verzamelden deze burgerwetenschappers 4.080 monsters. Een online platform werd ontwikkeld om de levering en afhaling van samplingkits te monitoren en om monstergegevens te verzamelen. De bemonsteringskits werden meestal gebouwd op basis van benodigdheden die beschikbaar waren in winkels met pandemieën. Monsters werden verwerkt met reagentia die gemakkelijk toegankelijk waren ondanks het terugkerende aanbodtekort. De gebruikte methoden waren zeer gevoelig en resistent tegen remmers die vaak aanwezig zijn in milieumonsters. De voorgestelde experimentele ontwerp- en verwerkingsmethoden waren succesvol in het betrekken van tal van burgerwetenschappers die effectief monsters uit verschillende oppervlakken verzamelden. De hier beschreven workflow en methoden zijn relevant om de stedelijke omgeving te onderzoeken op andere virussen, die van belang zijn voor de volksgezondheid en een bedreiging vormen voor toekomstige pandemieën.

Introduction

Sars-CoV-2 wordt verondersteld hoofdzakelijk via de inademing van besmette aërosolen en druppeltjes van direct contact met besmette individuen1,2,3,4worden overgedragen . Tijdens de eerste fasen van de wereldwijde COVID-19-pandemie waren de inspanningen om de overdracht van SARS-CoV-2 te beheersen echter sterk gericht op het desinfecteren van oppervlakken, handen wassen en ontsmetten. Tegen het einde van 2020 beschouwden transmissierichtlijnen van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO)5 en de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC)6 transmissie in de lucht voornamelijk als een gevaar wanneer ze in nauw contact (<2 m) met een geïnfecteerde persoon of in aanwezigheid van aërosolgenererende medische procedures. Zelfinenting na contact met verontreinigde oppervlakken of inademing van aërosolviëring van fomites moet nog worden uitgesloten als transmissieroute van SARS-CoV-2.

COVID-19-gevallen zijn gemeld waarbij transmissie in de lucht onwaarschijnlijk lijkt7,8. SARS-CoV-2 virionen blijven besmettelijk op koper gedurende maximaal 8 uur, op karton en roestvrij staal gedurende maximaal 24 uur en op plastic voor maximaal 48 uur9. In cruiseschipcabines werd SARS-CoV-2 RNA gedetecteerd 17 dagen nadat de passagiers waren vertrokken7. Lucht - en oppervlaktemonsters van ziekenhuizen en massatransportsystemen zijn positief getest op SARS-CoV-2 en andere coronavirussen8,10,11,12,13,14. Een studie uitgevoerd op de buitenste verpakking van Halloween snoep behandeld door asymptomatische en matige / licht symptomatische COVID-19 patiënten, concludeerde dat de combinatie van handen wassen door de handler en het wassen van het snoep met handzeep SARS-CoV-2 RNA verlaagde tot onder drempelniveaus15.

Verschillende methoden voor SARS-CoV-2-diagnostiek zijn gepubliceerd op basis van real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)16,17, reverse-transcription loop-mediated isotherme amplification (RT-LAMP)11,18,19,20,21en CRISPR-Cas technologies18,19,22,23. De meeste vereisen RNA-extractiekits die vaak schaars zijn tijdens perioden van aanzienlijke wereldwijde vraag, en zeer weinig zijn gebruikt voor milieuscreening van het virus24. De detectie van SARS-CoV-2 RNA met RT-LAMP is aangetoond dat het meer dan 83% concordant is voor het gebruik van RT-qPCR. Bovendien resulteerde RT-LAMP in een vermindering van 25% in onduidelijke resultaten in vergelijking met RT-qPCR15.

RT-LAMP is een eenvoudige techniek die een omgekeerde transcriptase gebruikt om cDNA te synthetiseren uit een RNA-sjabloon25, gevolgd door een DNA-polymerase met sterke strengverplaatsingsactiviteit die DNA synthetiseert bij constante temperatuur (d.w.z. isotherme versterking)26. Hogere specificiteit van virale genoomdetectie wordt bereikt met behulp van vier of zes primers die zes of acht gebieden van het doel-DNA herkennen. Versterking wordt geïnitieerd vanuit een interne primer en levert een semi-dubbelstrengs DNA-structuur op. De voorste streng wordt vervolgens versterkt door een buitenste primer. Deze versterkingen worden herhaald voor de omgekeerde primers. Interne en buitenste primers aan beide uiteinden hebben een interne omgekeerde zelf complementaire plaats die een lus vormt in het versterkingsproduct26,27. Bij isotherme strengverplaatsing genereert asynchrone DNA-synthese grote hoeveelheden versterkt product waarbij continue polymerisatie het signaal van slechts 10 kopieën per reactie11,20,28versterkt . De colorimetrische RT-LAMP mix is zwak gebufferd en gebruikt fenolrood als pH-indicator. Omdat het polymerase een nucleotide bevat, geeft het een proton vrij en zullen voldoende protonen de pH van de oplossing en de kleur ervan veranderen van roze naar geel11,20,28,29.

RT-LAMP is ontwikkeld voor de detectie van door muggen overgedragen ziekten in perifere gezondheidszorgfaciliteiten zonder volledig uitgeruste laboratoria25 en voor de snelle detectie van andere RNA-virussen zoals humaan immunodeficiëntievirus30. De meest kwetsbare bevolkingsgroepen in uitbraken van epidemieën - volgens de definitie van de WHO - beschikken vaak niet over voldoende economische middelen en de juiste apparatuur om detectie uit te voeren (Global Public Health Agenda van de Verenigde Naties). In de huidige SARS-CoV-2-pandemie zijn voorraden zoals medische swabs en reagentia voor RNA-extractiekits niet in staat geweest om aan de wereldwijde vraag te voldoen, vooral in niet-productielanden. Het voorgestelde protocol gebruikte een op guanidinium thiocyanaat (GITC) gebaseerde ruwe RNA-extractie, die het RNA effectief op een koudeketenonafhankelijke manier bewaarde en de persistentie van remmers uit het monster aanzienlijk verminderde. Bovendien is het GITC-chloroform extractieprotocol gebaseerd op de scheiding van RNA van DNA en eiwitten gevolgd door de respectieve neerslag, waardoor het grootste deel van het genetische materiaal kan worden teruggevorderd. Deze voordelen wegen op tegen de potentiële gevaren van burgerwetenschappers die met de chemische stof omgaan als er maatregelen worden genomen om hen op passende wijze te informeren over de risico's.

De voorgestelde werkstroom maakt gebruik van materialen en reagentia die algemeen van nut zijn. Het vereist apparatuur die beschikbaar is in basis, vaak landelijke, laboratoriumomgevingen. Deze methoden zijn goedkoop, zeer resistent tegen remmers die vaak worden aangetroffen in milieumonsters of monsters die niet kunnen worden verwerkt met extractiekits, en elimineren de noodzaak van een zeer nauwkeurige thermocycler. Deze studie presenteert een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs op algemeen aangeraakte en zelden gedesinfecteerde oppervlakken van huishoudens en het stedelijke milieu.

Protocol

Zie de tabel met materialen voor een gedetailleerde lijst van reagentia en benodigdheden, inclusief catalogusnummers, fabrikant en bijbehorende kosten.

1. Bemonstering van de stedelijke omgeving

  1. Burgerwetenschapper outreach
    1. Rekruteer burgerwetenschappers met behulp van een directe en duidelijke call-to-action die wordt vrijgegeven via lokale en sociale media. Maak een handvat voor sociale media (bijvoorbeeld #swab4corona) om het onderwerp te verbinden met sociale media-inhoud.
    2. Maak een e-mailaccount aan voor directe communicatie tussen het laboratoriumteam en elke burgerwetenschapper, beheerd door een persoon die vloeiend de belangrijkste talen van de regio van belang spreekt (bijv. Spaans en Engels voor San Diego County).
    3. Bouw een beveiligd webgebaseerd sample management platform (SMP) om te dienen als database, een laboratoriuminformatiebeheersysteem (LIMS) en om te communiceren met burgerwetenschappers.
      OPMERKING: De SMP biedt een gecentraliseerde locatie waar gebruikers een kit aanvragen, toegang krijgen tot protocollen voor het verzamelen van monsters, metagegevens van monsters indienen en een pick-up aanvragen voor voltooide voorbeeldkits.
    4. Maak een koppeling naar het SMP (bijv. https://demo.covidsample.org/) (figuur 1) voor personen om een aanvraag in te dienen om deel te nemen aan de milieubemonsteringsinspanning door bioveiligheidsgerelateerde vragen te beantwoorden die in een onlineformulier zijn gespecificeerd.
    5. Beveilig de toegang tot de SMP met behulp van een authentication application programming interface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider. Geef goedgekeurde gebruikers toegang tot het SMP.
      OPMERKING: Raadpleeg de literatuur voor een beschrijving van het OAuth 2.0-protocol31 voor verificatie en autorisatie. Het biedt een wrijvingsloos aanmeldingsproces voor vrijwilligers van burgerwetenschappers. Het stelt gebruikers ook in staat om zich aan te melden met een bestaand account, waardoor het niet nodig is om een aangepaste aanmeldings oplossing te maken en gebruikers referenties te beheren, wat een aanzienlijke hoeveelheid tijd bespaart en deelname aanmoedigt. Volgens recente rapporten heeft de gratis e-mailservice die beschikbaar is voor de gekozen cloudcomputerserviceprovider ongeveer 1,5 miljard maandelijks actieve e-mailgebruikers; het vereisen van een e-mailaccount van deze serviceprovider voor deelname wordt niet beschouwd als een ontmoedigende factor.
    6. Leg het doel van de studie- en bioveiligheidsoverwegingen uit aan de burgerwetenschappers van het SMP voordat ze hun eerste kit aanvragen. Zorg voor een meertalige plug-in om navigatie mogelijk te maken in een van de talen die beschikbaar zijn via een meertalige neurale machinevertalingsservice die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider.
    7. Neem in de steekproefsectie grafische en audiovisuele protocollen op in het Engels en Spaans.
    8. Wijs een unieke id toe aan elke kit en ontwerp de gebruikersinterface om knoppen te gebruiken die zijn gekoppeld aan Sample ID om het gegevensinvoerproces te stroomlijnen (Figuur 1A).
    9. Gebruik een software voor het plannen van bezorgroutes met een applicatie voor mobiele apparaten die door chauffeurs moet worden gebruikt om bezorg-/ophaalroutes te optimaliseren en burgerwetenschappers op de hoogte te stellen van nauwkeurige geschatte aankomsttijden.
    10. Bouw het LIMS-platform op een PHP-webservicestack en host het op een commercieel hostingplatform (aanbevolen besturingssysteem, webserversoftware en databasesoftware zijn gespecificeerd in de tabel met materialen).
    11. Zorg voor een veilige webgebaseerde applicatie-interface waarmee laboratoriumpersoneel gegevens snel en eenvoudig kan beheren in het LIMS. Zorg voor gegevensvisualisatie met behulp van een data Charting Application Programming Interface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider.
    12. Visualiseer georuimtelijke gegevens met behulp van een georuimtelijke applicatieprogrammeringsinterface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider. De gegevens die via het SMP bij het LIMS worden ingediend, opslaan om (1) gecentraliseerde opslag van projectgegevens te vergemakkelijken; (2) het volgen van workflows voor monster- en gegevensverwerking; en (3) beheer van de logistiek van de distributie van monsterkits aan burgerwetenschappers.
    13. Beveiligde ingediende metagegevens met behulp van best practices (bijv. https://demo.covidsample.org/).
    14. Pre-load informatie zoals Sample Kit ID, Sample ID, datum, tijd en Global Positioning System (GPS) coördinaten (automatisch verzameld uit een afbeelding van de site) om naleving van het gegevenstype mogelijk te maken en het indienen van onjuiste of ontbrekende gegevens door de gebruiker te minimaliseren (Figuur 1B). Voeg de volgende velden toe die handmatig en snel (<1 min) door de burgerwetenschapper moeten worden ingevuld: datum en tijd van verzameling, een korte beschrijving van de locatie en een foto van de bemonsteringslocatie.
    15. Reinig alle geüploade gegevens en valideer voor het gegevenstype. Valideer bijvoorbeeld afbeeldingsgegevens die door gebruikers zijn geüpload om .jpg bestanden te selecteren, hernoem ze met Sample ID voor snelle koppeling met het voorbeeld en sla geüploade afbeeldingen op op een afzonderlijke beveiligde locatie die niet toegankelijk is voor gebruikers.
    16. Activeer de optie om de levering en afhaling van de kit aan te vragen wanneer alle monsters (16) zijn voltooid. Activeer bovendien de optie om een nieuwe kit aan te vragen die moet worden geleverd bij het ophalen van de vorige (Figuur 1A).
      OPMERKING: Voor vrijwilligers die de voorkeur geven aan een niet-webgebaseerd platform en voor degenen die zich zorgen maken over het bekendmaken van hun GPS-locatie (bijv. leden van de gemeenschap die zich zorgen maken over hun migratiestatus), kunnen kits worden geleverd op een overeengekomen vergaderlocatie en vrijwilligers worden gevraagd om een schriftelijke versie van de gegevensverzameling op te nemen. Voor communicatie tussen het laboratorium en elke burgerwetenschapper, heb een tweetalig lid van het project beschikbaar voor telefoongesprekken en sms'jes.
  2. Swab voor Corona
    1. Identificeer een epidemiologisch relevant tijdvenster voor de bemonsteringsinspanning.
    2. Bouw een kit die alle bemonsteringsbenodigdheden bevat, inclusief de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen (d.w.z. masker, handschoenen), een bemonsteringsprotocol en relevante informatie over bioveiligheid (figuur 2). Label elke buis vooraf met de toegewezen unieke id (sample-ID).
    3. Swab zelden gedesinfecteerde oppervlakken die worden blootgesteld aan aerosolized fomites in huishoudens en de stedelijke omgeving.
      1. Draag het meegeleverde masker in het openbaar en een nieuw paar handschoenen voor het verzamelen van elk monster om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik na het beëindigen van de bemonstering het meegeleverde handdesinfecterend middel.
      2. Bevochtig een 1 cm2 polyester absorberend wattenstaafje (bijv. dweilpads) met een reinigingsmiddel (bijv. 0,5% natriumdodecylsulfaat (SDS)) om het virus te inactiveren door de envelop te verstoren en het naakte RNA te stabiliseren door het uitvouwen van RNases32op te wekken .
      3. Wattenstaafje een oppervlak van 10 cm2. Laat elk monsterswab met behulp van een tandenstoker volledig onderdompelen in de overeenkomstige voorgelabelde buis met 200 μL guanidiniumthiocyanaatoplossing (GITC). Bewaar buizen bij 4 °C totdat ze naar het laboratorium worden vervoerd. Zodra de monsters in het laboratorium aankomen, bewaar ze bij -80 °C.
        OPMERKING: GITC is een giftige irriterende stof; vermijd contact met de huid. GITC-oplossing is eenvoudig te bereiden op basis van gangbare laboratoriumchemicaliën, voor het recept zie33,34. Het inactiveert het virus, stabiliseert RNA door RNases34,35, 36te denatureren en stabiliseert monsters bijkamertemperatuur. De kit bevat echter ijspakketten om de monsters koud te houden zonder dat u huishoudelijke koelkasten hoeft te gebruiken voor opslag.

2. SARS-CoV-2 detectie

  1. Totale RNA-isolatie
    1. Desinfecteer oppervlakken, apparatuur en pipettors met een oplossing van 2 mM kopersulfaat en 3% waterstofperoxide; gevolgd door een oplossing van 10% bleekmiddel, 90 mM natriumbicarbonaat, 5% SDS en 2,5% NaOH. Veeg grondig af met gedestilleerd water gevolgd door 75% ethanol.
      OPMERKING: Deze oplossingen zijn een alternatief voor de commercieel beschikbare oplossingen.
    2. Dooimonsters op ijs. Vortex monsters gedurende 2 min op gemiddelde snelheid.
    3. Om de snelheid van de screening te verhogen, verwerkt u de monsters in pools. Als een pool positief is, moet u het RNA van elk monster onafhankelijk extraheren om de positieve steekproef(en) te vinden. Combineer de monsters uit elke bemonsteringskit (16 in totaal) in 2 groepen van 8 monsters.
      OPMERKING: Het hebben van 8 monsters per zwembad betekent dat er slechts 2 zwembaden per kit hoeven te worden verwerkt. Als een pool positief is, worden de afzonderlijke monsters opnieuw verwerkt voor individuele RT-LAMP-analyse. Dit vermindert tijd, kosten en reagentia.
    4. Pool 50 μL van elk van de 8 monsters in een microcentrifugebuis (totaal volume 400 μL); bewaar het resterende monster bij -80 °C. Voeg 0,2 volume (80 μL) chloroform, vortex gedurende 15 s toe en incubeer vervolgens gedurende 20 minuten bij 4 °C. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C.
    5. Breng de waterige (heldere vloeistof) laag over in een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar de resterende interface en roze vloeistof in de vriezer van -80 °C; deze fracties bevatten DNA en eiwitten33,36.
    6. Voeg een gelijk volume isopropanol (~200 μL) en 2,6 μL glycogeen coprecipitant (15 mg ml-1)37toe. Meng goed en incubeer bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur, gevolgd door 4 °C gedurende 10 minuten om RNA te precipiëren.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd door monsters 's nachts bij -20 °C te incuberen in plaats van 1 uur.
    7. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 50 μL met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water en voeg een gelijk volume (50 μL) RNase-vrij 5 M ammoniumacetaat en 2,5 volumes (250 μl) 100% ethanol7,38toe .
      OPMERKING: Ammoniumionen remmen polynucleotidekinase bij gebruik in een downstreamproces38. Het mengsel precipitateert RNA terwijl deoxynucleosidetrifosfaten en oligosachariden in oplossing38achterblijven .
    8. Meng goed en incubeer bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur, gevolgd door 4 °C gedurende 10 minuten om RNA te precipiëren.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd door monsters 's nachts bij -20 °C te incuberen in plaats van 1 uur.
    9. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C. Was de pellet met 1 ml koude (-20 °C), vers gemaakt van 75% ethanol. Centrifugeer bij 8.000 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een P10 pipet om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord.
    10. Droog de pellet 10-15 minuten aan de lucht totdat er geen ethanol meer over is. Resuspend de pellet in 50 μL MET DEPC behandeld water, voeg 5 μL 10x DNase buffer + 1μL DNase (2 Eenheden μL-1)toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
    11. Voeg 0,1 volume (5,6 μL) DNase inactivatiereagens toe, incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur en meng elke minuut voorzichtig. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 2 minuten en breng supernatant over naar een nieuwe buis (~50 μL). Plaats de buis onmiddellijk op ijs tijdens het voorbereiden van de RT-qPCR- of RT-LAMP-reacties of bewaar deze in een vriezer van -20 °C.
      OPMERKING: Voer RNA-isolatie uit in een ampliconvrije ruimte om overlast te voorkomen.
  2. Multiplex reverse-transcription loop-gemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP)
    1. Bereid een 20X primer mix oplossing (Tabel 1) voor elke set primers (Tabel 2). Bereid de RT-LAMP reactiemix (tabel 3) voor op kamertemperatuur met 10% overtollig volume om het pipetverlies te verklaren.
      OPMERKING: De colorimetrische LAMP 2X mastermix met Antarctisch thermolabiel uracil-DNA glycosylase (UDG) voorkomt versterking van DNA-besmetting door eerdere reacties20,28.
    2. Draai en draai het mengsel naar beneden. Verdeel 20 μL van het mengsel in elke reactiebuis: steekproef, spiked, positieve controle,en negatieve controle. Incubeer de reacties in de buizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, zodat de UDG kan reageren op mogelijke overdrachtsverontreiniging.
    3. Voeg 5 μL RNA toe aan de monsterreactie, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopieën) synthetisch SARS-CoV-2 RNA aan de piekreactie, 2,5 μL (450 kopieën) synthetisch SARS-CoV-2 RNA aan de positieve controlereactie en 5 μL H2O aan de negatieve controlereactie. Meng goed en draai de reacties naar beneden; ontdooi alle RNA op ijs.
    4. Terwijl de thermocycler, of het waterbad, wordt verwarmd tot 65 °C, laat u alle reacties op kamertemperatuur blijven. De UDG wordt bij >50 °C ingeactiveerd. Plaats de reacties in de thermocycler (gebruik het deksel), incubeer gedurende 40 minuten op 65 °C en laat de reacties 5 minuten op kamertemperatuur komen (~22 °C) of koel 1 minuut af op ijs. Analyseer de resultaten met behulp van de colorimetrische functie (eenvoudige observatie) of door de producten in een agarose gel uit te voeren.
      OPMERKING: Hoewel de detectielimiet (LOD) 10 kopieën per reactie bedraagt, neemt de detectiefrequentie toe naarmate het kopieeraantal 500 kopieën per reactie nadert (figuur 3A). Houd er bij colorimetrische waarneming rekening mee dat een negatief resultaat wordt aangegeven met roze (pH = 8,8), terwijl een positief resultaat wordt aangegeven door geel (pH = 5) (figuur 3B). De colorimetrische optie vermijdt het openen van de RT-LAMP-buizen na versterking, waardoor het volume van de RT-LAMP-producten in de werkomgeving en overdrachtsverontreiniging wordt verminderd. Voor gelelektroforese, bereid een 1,5% agarosegel met 1X DNA-gelvlek in 0,5% Tris / Borate / EDTA (TBE) buffer. Laad 25 μL van de reactie + 5 μL 6X ladingskleurstof in elke put. Voer de gel 60 minuten uit op 100 V. Een moleculaire marker is niet nodig omdat positieve monsters een ladderpatroon vertonen (figuur 3C).

Representative Results

Monsters verzameld door burgerwetenschappers voor de detectie van SARS-CoV-2. Gedurende een periode van 8 maanden (half maart tot de derde week van november 2020) werden 482 burgers goedgekeurd om deel te nemen aan dit project, waarvan 350 (73%) vroeg om een kit. In totaal werden 362 kits geleverd (d.w.z. sommige deelnemers vroegen om meerdere kits) en 246 (70%) zijn geretourneerd (figuur 4A, B ). Alle 4.080 monsters in deze kits werden verwerkt. De inzamelingsplaatsen werden verdeeld over De Kust van het noorden, Het Centrale, Centrale, en Zuidelijke districten van de provincie, evenals een paar bij de oostelijke districten (Figuur 4A). Deze districten hebben de hoogste bevolkingsdichtheid van San Diego County en de meest gedocumenteerde COVID-19-gevallen, zoals gerapporteerd door het San Diego Human Health Service Agency39.

Burgers vroegen om het ophalen van de meeste gesamplede kits (d.w.z. gemiddeld slagingspercentage: 70,4%). Elke dag werden 1-16 kits aangevraagd en 0-14 kits werden teruggestuurd naar het laboratorium (figuur 4B). Uit een enquête onder de burgerwetenschappers bleek dat het verzamelen van een complete kit (16 monsters) 1-3 uur duurde, verdeeld over gemiddeld 8 dagen (figuur 4A en tabel 4). Het overgrote deel van de kits was compleet (91,1%), wat betekent dat ze een wattenstaafje in alle 16 monsterbuizen bevatten, en de bijbehorende bemonsteringsgegevens werden geüpload naar het LIMS (figuur 4A en tabel 4).

Detectie van SARS-CoV-2 met gitc-chloroform extractie en multiplex reverse transcriptase loop-gemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP). Voor de colorimetrische RT-LAMP-test werden twee sets primers11,20,28 gebruikt om de nucleocapsid (N2) en de envelop (E1) genen (tabel 2)te targeten. De door deze primers herkende sequenties bevinden zich in dezelfde regio als de primers en sondes die zijn goedgekeurd door de CDC40 en de Europese Unie (EU)41 voor de menselijke diagnose van COVID-19 door RT-qPCR. Deze resultaten bevestigen wat Zhang et al.28 beschreven, waarin het toevoegen van 60 mM guanidinehydrochloride aan de reactie de LOD verhoogt wanneer deze in multiplex wordt uitgevoerd. De LOD met een frequentie van 100% was 500 kopieën per reactie van 25 μL (figuur 3A, B). In de colorimetrische RT-LAMP veranderden positieve monsters van kleur van roze naar geel als gevolg van een pH-verschuiving van ~ 8 naar 5,5 (figuur 3B). Toen de reactie oranje werd bij lage-kopienummers, werden monsters uitgevoerd in een 1,5% agarosegel om te bevestigen dat deze positief waren en resulteerden in een ladderachtig patroon (Figuur 3C). RT-LAMP werd gebruikt om SARS-CoV-2 te detecteren in gepoolde RNA-monsters.

Om te controleren op valse negatieven als gevolg van reactieremmers, werd elk monster getest in een extra reactie met 500 kopieën van synthetische SARS-CoV-2. Positieve gepoolde monsters werden gederepliceerd door het RNA van elk afzonderlijk monster in de pool te isoleren en in een RT-LAMP-reactie uit te voeren om de identiteit van het positieve monster te bepalen. De detectieresultaten werden vervolgens geüpload naar het LIMS, waar de unieke monster-ID werd gekoppeld aan de informatie over datum, tijd, GPS-coördinaten, site en afbeelding van het monster.

Real-time en traditionele RT-PCR-methoden: remming door monsterverontreinigingen. Om de beste methode te selecteren die geschikt is voor de voorgestelde detectiepijplijn, werden andere RNA-versterkingsmethoden getest met milieumonsters die werden verzameld door een pilotcohort van burgerwetenschappers. Voorbeelden van de resultaten van elk van deze methoden worden in figuur 5 gepresenteerd om hun gevoeligheid voor omgevingsremmers en achtergrondsignaalruis bij lage virale copy-number concentraties weer te geven.

Zes rt-qPCR-formuleringen (tabel met materialen) die door de CDC en de WHO zijn goedgekeurd, zijn getest op detectie van het virus op milieumonsters. Protocollen werden gevolgd volgens de instructies van de fabrikant en cdc-richtlijnen voor de detectie van SARS-CoV-2 in klinische omgevingen40. Reacties met verschillende concentraties synthetische SARS-CoV-2 RNA-controles werden na ruwe RNA-isolatie in swabbed-oppervlaktemonsters gestoken. Alle mastermixen waren gevoelig voor remmers bij LOD-concentraties van de positieve controle (Figuur 5A).

Om remmers van deze real-time technologieën te omzeilen, werd een traditioneel RT-PCR-systeem getest. Een rt-pcr-systeem in één stap (tabel met materialen) werd gebruikt om het nucleocapsid-gen te versterken met behulp van de primersets N1, N2en het omhulselgen met behulp van de primerset E1 die respectievelijk door de CDC (VS) en het ECDC (EU) is goedgekeurd (tabel 2). Protocollen werden gevolgd volgens de instructies van de fabrikant en cdc-richtlijnen voor de detectie van SARS-CoV-2 in klinische omgevingen40. De primersets N1 en N2 ontworpen door de CDC leveren een ~70 bp product op; de positieven van het lage aantal kopieën werden echter niet onderscheiden van het versterkingsachtergrondgeluid van de negatieve controle (figuur 5B), die valse positieven in de resultaten introduceerde. Het product van de E1-primers had een zwak signaal bij een laag kopieergetal ( figuur5B), waardoor valse negatieven in de resultaten werden geïntroduceerd. Bovendien was de geteste RT-PCR-methode nog steeds gevoelig voor remmers die aanwezig waren in de milieumonsters (gegevens niet weergegeven).

Er zijn andere methoden ontwikkeld om zeer kleine hoeveelheden doelsequenties te detecteren. Een van deze methoden is de Rolling Circle Amplification (RCA), waarna de herkenning van de doelsequentie, RNA of DNA, door een specifieke lineaire sonde, een ligase de sjabloon circulariseert. Met behulp van primers die zijn ontworpen om te hybridiseren met de sonde, versterkt een DNA-polymerase met strengverplaatsingsactiviteit de sonde in een isotherme reactie42. Het is de sonde die het doel identificeerde, dat wordt versterkt, en niet de doelvolgorde, wat deze methode zeer gevoelig maakt43. Wang et al.44 publiceerden een RCA protocol voor de directe detectie van SARS-CoV-1 RNA. De methode is aangepast om primers te gebruiken die specifiek zijn voor SARS-CoV-2. Helaas circuleert en levert de sonde in het niet-sjabloonbesturingselement (NTC) het product af bij afwezigheid van een RNA-sjabloon, zelfs bij gebruik van een breed scala aan ligasen, waaronder een SNP-gevoelige ligase. Bij afwezigheid van ligase vertoonde de NTC geen versterking van de lineaire sonde (figuur 5C).

Figure 1
Figuur 1: Webgebaseerd bemonsteringsplatform met monsterverzamelingsgegevensinterface voor mobiele apparaten. (A) Er werd een website gemaakt, met een meertalige plug-in, om de interactie tussen het laboratorium en de burgerwetenschappers te bemiddelen. Het platform werd gebruikt voor het leveren/ophalen van de samplekit en het indienen van monstergegevens. Het platform bevatte gedetailleerde Engels/Spaanse grafische en audiovisuele samplingprotocollen. (B) Mobiele apparaatweergave die wordt gebruikt om voorbeeldgegevens te uploaden: datum, tijd, GPS-coördinaten, beschrijving van de voorbeeldsite en een afbeelding van de verzamelsite. Afkortingen: SARS-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; GPS = Global Positioning Systeem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Monsterverzamelingskit. Burgerwetenschappers kregen een koeler met twee ijsverpakkingen, een veiligheidsinformatieblad om vrijwilligers te informeren over de gevaren van het hanteren van de GITC-oplossing, een gedetailleerd bemonsterings- en maskerdragend protocol, een KN95-masker, een afvalzak, een spuitfles met handdesinfecterend middel, een spuitfles met 0,5% SDS, 16 paar handschoenen, een kleine zak met 16 tandenstokers en 16 polyester wattenstaafjes, 16 voorgelabelde microcentrifugebuizen met 20 Afkortingen: GITC = guanidinium thiocyanaat; SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Multiplexed Reverse-Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) assay. Multiplexed reacties met primers voor SARS-CoV-2 nucleocapsid (N2) en envelope (E1) genen om slechts 10 kopieën van het virus in de reactie te detecteren. Synthetische SARS-CoV-2 RNA werd gebruikt als positieve controle. (A) Detectiefrequentie in multiplex colorimetrische RT-LAMP van SARS-CoV-2 bij verschillende genoomkopienummers per reactie. Gemiddelde waarde van vijf repliceert in roze. (B) Detectiegrens (LOD) van SARS-CoV-2 in multiplex colorimetrische RT-LAMP; geel = positief (pH ~5); roze = negatief (pH ~8). (C) Ladderpatroon van positieve SARS-CoV-2 RT-LAMP reacties bij 1,5% agarose gel elektroforese. Afkortingen: SARS-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; rxn = reactie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Locatie van citizen scientist sampling kits in San Diego County en slagingspercentage van aangevraagde kits. (A) Oranje stippen vertegenwoordigen de locatie van 1 sampling kit, die 16 samples bevat. De blauwe cirkeldiagram toont het percentage kits dat verschillende dagen duurde vanaf het moment dat ze werden afgeleverd bij de burgerwetenschappers tot het moment dat ze naar het laboratorium werden teruggebracht. Aantal dagen tussen haakjes. Het oranje cirkeldiagram toont het percentage kits met een verschillend aantal voltooide monsters van in totaal 16 monsters. Het aantal voltooide monsters met een uitstrijkje in de monsterbuis en de bijbehorende bemonsteringsgegevens die tussen haakjes naar het LIMS zijn geüpload. (B) Percentage kits dat naar het laboratorium is teruggestuurd (dots) en het totale aantal aangevraagde kits (bars), ten opzichte van de datum waarop de kit is aangevraagd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Alternatieve SARS-CoV-2 RNAdetection methoden. (A) RT-qPCR detectie van SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) gen met behulp van primer set N2. Gepoolde milieumonsters verrijkt met 900 (groene) of 9 (oranje) kopieën van SARS-CoV-2. Positieve besturingselementen van dezelfde kopienummers in blauw. Pijl geeft de afname aan van fluorescentiedetectie van positieve controle met laag kopieergetal wanneer er een omgevingsmonster aanwezig is. (B) Traditionele RT-PCR detectie van SARS-CoV-2. Boven: RT-PCR producten van het nucleocapsid gen met behulp van primer sets N1 en N2. Een zwak achtergrondsignaal wordt waargenomen in de no-template controle. Onder: RT-PCR producten van het envelopgen met behulp van primer set E1. Bij de LOD-concentratie wordt een zeer laag signaal waargenomen. Blauwe pijlen tonen verwacht positief product: (boven) ~70 bp en (onder) 113 bp in 2% agarose gel elektroforese. C) RCA van SARS-CoV-2 RNA. Cirkelvormige sonde versterkt in aanwezigheid van ligase en afwezigheid van RNA-sjabloon (NTCcir); bij afwezigheid van ligase en RNA sjabloon lineaire sonde versterkt niet (NTClin). Afkortingen: SARS-CoV-2 = ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden; bp = basisparen; rxn = reactie; MM = moleculaire marker; RT-PCR = reverse-transcriptie polymerase kettingreactie; RT-qPCR = real-time kwantitatieve RT-PCR; RCA = versterking van de walscirkel; NTC= geen sjabloonbesturingselement; LOD = detectiegrens; rxn = reactie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

abc 20X Concentratie (μM) 1x concentratie (μM)
Fip 32 1.6
BIP 32 1.6
F3 4 0.2
B3 4 0.2
LusF 8 0.4
LusB 8 0.4

Tabel 1: Formulering voor 20X RT-LAMP primer mix. In de RT-LAMP-reactie herkennen 6 primers 8 gebieden van het beoogde DNA. Afkortingen: reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification; FIP = voorwaartse binnenprimer; BIP = achterwaartse binnenprimer; F3 = voorwaartse verplaatsingsprimer; B3 = achterwaartse verplaatsingsprimer; LoopF = forward loop primer; LoopB = achterwaartse lusprimer.

abc volgorde doel Productgrootte
RT-LAMP9,18,19
E1-F3 TGAGTACGAACTTATGTACTCAT E ladder-achtig patroon
E1-B3 TTCAGATTTTTAACACGAGAGT
E1-FIP ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG
E1-BIP TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
E1-LusB GCGCTTCGATTGTGTGCGT
E1-LusF CGCTATTAACTATTAACG
N2-F3 ACCAGGAACTAATCAGACAAG N
N2-B3 GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT
N2-FIP TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC
N2-BIP CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA
N2-LusF GGGGGCAAATTGTGCAATTTG
N2-LusB CTTCGGGAACGTGGTTGACC
RT-qPCR38
nCoV_N1-F 2019 GACCCCAAAATCAGCGAAAT N 72 basispunten
nCoV_N1-R 2019 TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
nCoV_N1-P 2019 5'-FAM-ACC CCG KAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'
nCoV_N2-F 2019 TTACAAACATTGGCCGCAAA N 67 basispunten
nCoV_N2-R 2019 GCGCGACATTCCGAAGAA
nCoV_N2-P 2019 5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3"
RT-PCR38
E1_Sarbeco_F ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT E 113 bp
E1_Sarbeco_R ATATTGCAGCAGTACGCACACA

Tabel 2: Primers gebruikt voor RT-LAMP, RT-qPCR en RT-PCR. Primersequenties, doelgen, verwachte productgrootte en bijbehorende referentie worden vermeld. Afkortingen: RT-LAMP = reverse-transcription loop-mediated isotherme amplification; RT-PCR = reverse-transcriptie polymerase kettingreactie; bp = basisparen; RT-qPCR = real-time kwantitatieve RT-PCR; E1 = envelopgen; N2 = nucleocapsid gen; F = voorwaartse primer; R = omgekeerde primer; P = Sonde ; FIP = voorwaartse binnenprimer; BIP = achterwaartse binnenprimer; F3 = voorwaartse verplaatsingsprimer; B3 = achterwaartse verplaatsingsprimer; LoopF = forward loop primer; LoopB = achterwaartse lusprimer.

Reagens Volume (μL)
WarmStart Colorimetrische LAMP 2X Master Mix met UDG 12.5
N2 Primer Mix (20x) 1.25
E1 Primer Mix (20x) 1.25
Guanidine hydrochloride (600 mM)* 2.5
Doel-RNA 5
Nucleasevrij H2O 2.5
Totaal volume 25

Tabel 3: Reactie master mix voor multiplex colorimetrische RT-LAMP. (*) Van Guanidinehydrochloride is aangetoond dat het de gevoeligheid en snelheid van de reactie verhoogt door een niet-gekarakteriseerd mechanisme28. Afkortingen: LAMP = loop-mediated isotherme amplification; UDG = uracil-DNA glycosylase; N2 = nucleocapsid gen; E1 = envelopgen; DEPC = diethylpyrocarbonaat.

Goedgekeurde burgers Burgers die een kit hebben aangevraagd Geleverde kits Geretourneerde gesamplede kits Dagen gewijd aan bemonstering % Complete kits % Onvolledige kits Verwerkte monsters
482 72.6% (350/482) 362 70.4% (255/362) bedoelen 8 91.1 (224/246) 8.9 (22/246) 4,080
mediaan 3

Tabel 4:Swabbing voor SARS-CoV-2 door de cijfers. Outreach en sampling slagingspercentages. Afkorting: SARS-CoV-2 = severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.

Discussion

Burgerwetenschapper engagement. Burgerwetenschappers werden gerekruteerd om oppervlakken in San Diego County uit te nemen om de aanwezigheid van SARS-CoV-2 in de stedelijke omgeving te bemonsteren en te detecteren. De meeste geleverde bemonsteringskits (70%) werden teruggestuurd naar het laboratorium, en daarvan waren bijna alle monsters compleet (91%) (figuur 3A,B en tabel 4). Vrijwilligers konden eenvoudig kitlevering / afhaling aanvragen via het webgebaseerde platform en de software voor het plannen van bezorgroutes bracht burgerwetenschappers op de hoogte van geschatte aankomsttijden, beide waarschijnlijk belangrijke factoren voor het waargenomen succes. De gemiddelde tijd vanaf het moment dat de kit aan de burgerwetenschapper werd geleverd tot het moment dat het naar het laboratorium werd teruggebracht, was 8 dagen, met een mediaan van 3 dagen en een bereik van 1-64 dagen (figuur 3A en tabel 4). Vaker herinneringen aan vrijwilligers zouden deze vertraging waarschijnlijk verminderen.

Het dataverzamelingsplatform werd met succes gebruikt door een grote meerderheid van de gebruikers (73%) (Tabel 4). Hoewel de inspanningen van de burgerwetenschappers niet werden gemeten, toonden veldtests aan dat het platform voor gegevensverzameling de inspanning en tijd die nodig was om de monsterverzameling goed te voltooien, aanzienlijk verminderde. Het verminderen van de hoeveelheid boekhouding stimuleerde dus de betrokkenheid van burgerwetenschappers. Het webgebaseerde platform was bedoeld om demografische beperkingen te overwinnen door een meertalige neurale machinevertalingsservice te bieden en door grafische en audiovisuele protocollen in het Engels en Spaans te bieden. Dit was slechts gedeeltelijk succesvol omdat er minder monsters werden verzameld van zowel de South Bay als North County, waar het grootste deel van de Spaanse / Latino-bevolking van de provincie45woont. Deze gebieden herbergden ook 63% (1.700 gevallen per 100.000) van de totale COVID-19-gevallen in San Diego County met de hoogste prevalentie van de ziekte46 en het aantal ziekenhuisopnames (62%)47,48. Hoewel de meeste monsters afkomstig waren uit Central County, werd een representatief aantal verzameld uit de meest door COVID-19 getroffen districten en slechts een klein deel van de monsters was positief, wat suggereert dat oppervlaktereservoirs van SARS-CoV-2 in de stedelijke omgeving relatief zeldzaam zijn.

Monsterverwerking. Bemonsteringsdoekjes werden bevochtigd met SDS, die het virus activeerde door de envelop te verstoren en het naakte RNA stabiliseerde door RNases32uit te klappen. Handig tijdens het ophalen, het reinigingsmiddel in het wattenstaafje reinigde het bemonsterde oppervlak. Milieumonsters bevatten vaak zeer kleine hoeveelheden RNA. Om het herstel te maximaliseren, werd RNA-isolatie uitgevoerd met behulp van een gitc-gebaseerde, kolomvrije, ruwe extractiemethode. GITC, een sterk chaotropisch middel, verstoort de waterstofbindingen die het vouwen van eiwitten behouden (d.w.z. hydrofoob effect). Deze actie resulteert in de inactivatie van virale deeltjes en het RNA blijft stabiel als gevolg van de remming van RNAses34,35,36. De GITC-oplossing handhaafde de stabiliteit van de RNA-monsters zonder strikte overwegingen van de koelketen, waardoor de burgers de monsters op kamertemperatuur konden houden als er geen vriezer voor de meegeleverde ijsverpakkingen beschikbaar was. Om het potentiële gevaar van dit reagens bij direct contact met de huid of slijmvlies te verminderen, werden burgers op de hoogte gebracht van deze risico's door een materiaalveiligheidsinformatieblad in de kit op te nemen en werd een waarschuwingszegel in de doos met de buizen geplaatst.

De ruwe GITC-chloroform extractiemethode hielp bij het terugwinnen van sporen van RNA uit de swabs, en zoals blijkt uit de versterking van spiked samples, bleven remmers zelden in de monsters aanwezig na extractie. Monsters, die negatief waren voor SARS-CoV-2 en geen RT-LAMP-remming vertoonden, vertegenwoordigden echte negatieven of hadden een lager kopieernummer dan de LOD met een frequentie van 100%. Omgekeerd impliceert de detectie van viraal RNA op een oppervlak niet direct het risico van overdracht door contact, aangezien de infectiviteit van het virus uit positieve monsters moet worden getest. Een snelle screening van het milieu, niet beperkt door de beschikbaarheid van geavanceerde voorraden of hooggekwalificeerd personeel, is van cruciaal belang om te beoordelen of oppervlakken een viraal reservoir vormen en om de inspanningen op het gebied van preventie en insluiting beter te sturen.

RT-LAMP is geselecteerd als de beste methode die geschikt is voor de voorgestelde detectiepijplijn. Het bleek een snelle en goedkope methode te zijn die zeer resistent was tegen de meeste resterende remmers en net zo gevoelig en specifiek was als andere RT-qPCR-methoden. Vanwege het gebruik ervan in klinische omgevingen tijdens de SARS-CoV-2-pandemie, werd de beschikbaarheid van RT-qPCR-kits beïnvloed door de wereldwijde vraag. Bovendien waren RT-qPCR-technieken — zelfs die welke zijn geformuleerd om remmers te weerstaan — gevoelig voor stoffen in de milieumonsters die werden verzameld door een proefcohort van burgerwetenschappers, zelfs na het gebruik van andere gemeenschappelijke strategieën om de concurrentie van remmers voor enzymbinding te verminderen49. Deze bevindingen worden bevestigd door een recente studie die beide methoden vergeleek om SARS-CoV-2 te detecteren op swabmonsters van snoep dat door COVID-19-patiënten werd behandeld en meer dan 83% resultaat concordantie vond, met 25% lagere remming in monsters geanalyseerd door RT-LAMP15. Bovendien verlaagde de GITC-chloroform ruwe extractie, in combinatie met RT-LAMP, de kosten van reagentia en voorraden met 42% in vergelijking met RNA-kitextractie en RT-qPCR (Tabel met materialen).

Deze methode maakte een analyse met hoge doorvoer van duizenden oppervlakteswabmonsters mogelijk. Tot 80 pools, die 640 monsters vertegenwoordigen, werden verwerkt in 2 dagen van RNA-extractie tot SARS-CoV-2-detectie door RT-LAMP. Het voorgestelde protocol is semiquantitative, beperkt tot de detectie van viraal RNA, en wijst niet op de aanwezigheid van besmettelijke virale deeltjes. Verdere analyse is nodig om het risico van overdracht van SARS-CoV-2 van geïnfecteerde fomites aanwezig op de geswabde oppervlakken te beoordelen.

Deze studie presenteert een protocol om snel een teststrategie op te zetten die een effectieve workflow omvat wanneer u wordt geconfronteerd met een gezondheidscrisis met een overdraagbare ziekte. Het voorgestelde bemonsteringsprotocol is eenvoudig en maakt gebruik van benodigdheden die vaak in huishoudens worden aangetroffen, en de virale detectiemethode wordt uitgevoerd op apparatuur die beschikbaar is in basislaboratoriuminstellingen, zoals een waterbad in plaats van een thermocycler. De kosten van RT-LAMP-reagentia zijn aanzienlijk lager dan die welke nodig zijn voor RT-qPCR en zijn minder gevoelig voor scenario's met een hoge wereldwijde vraag. Deze studie dient als kader voor de beoordeling van virale reservoirs in het milieu bij toekomstige epidemie-uitbraken en wereldwijde pandemieën.

Disclosures

Alle auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Acknowledgments

We danken de onderzoekers van het Viral Information Institute (VII), Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin en Dr. Jennifer Smith voor het nemen van de tijd om talloze monsters te verzamelen. We danken ook Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre en Dr. Sarah Allard van de afdeling Kindergeneeskunde van de School of Medicine University of San Diego California (UCSD) voor het faciliteren van positieve controles en nuttige feedback. We danken Stacey Carota (SDSU College of Sciences) en Gina Spidel (SDSU) voor logistieke ondersteuning en Juan Rodríguez voor de kunst en grafische vormgeving van het samplingprotocol. We danken alle deelnemers voor hun inzet en toewijding aan dit project in zeer moeilijke tijden. Dit werk werd ondersteund door een genereuze donatie van Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) en de National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Award Number: 2030479).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SMP, LIMS, and community outreach:
Authentication Application Programming Interface Google Google Sign-In
Commercial hosting platform GoDaddy
Data Charting Application Programming Interface Google Google Charts
Database software MySQL 
Delivery route planning software  Circuit Circuit for Teams
Free email service Google Google Email
Geospatial Application Programming Interface Google Google Maps API
Multilingual neural machine translation service Google Google Translate
Online form Google Google Form
Operating system Linux
Web and database development  Big Rose Web Design
Web server software Apache 
Sampling kit:
Coolers Coleman (Amazon) B00363X3F2 Cost (US$) per 100 rxns: 70
Gallon Ziploc bags Solimo (Amazon) B07BJ495GL Cost (US$) per 100 rxns: 18
Glycerol (hand sanitizer) FischerScientific G33-4 Cost (US$) per 100 rxns: 9
Ice packs Ice-Brix (Amazon) B075GLD3X1 Cost (US$) per 100 rxns: 110
Isopropanol (hand sanitizer) FischerScientific AA36644K7 Cost (US$) per 100 rxns: 43
KN95 masks Echo-Sigma Echo-Sigma Cost (US$) per 100 rxns: 400
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet Office Depot 348037 Cost (US$) per 100 rxns: 36
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) Anyumocz (Amazon) B07T64FHXR Cost (US$) per 100 rxns: 80
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes Genesee Scientific 22-281 Cost (US$) per 100 rxns: 83
Sample ID solvent resistant labels LABTAG XST-10C1-1WH Cost (US$) per 100 rxns: 68
Swiffer WetJet pads (swabs) Swiffer (Amazon) B001F0RBT2 Cost (US$) per 100 rxns: 8
Toothpicks Kitchen Essential (Amazon) B00PBK4NG6 Cost (US$) per 100 rxns: 8
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS Invitrogen 15596018 Cost (US$) per 100 rxns: 40
Tube boxes Genesee Scientific 21-119 Cost (US$) per 100 rxns: 180
Small Ziploc bags Ziploc (Amazon) B01LRKEI9K Cost (US$) per 100 rxns: 8
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer  Zebra GK420t
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160
Trizol RNA extraction:
Ammonium Acetate RNase-free Invitrogen AM9070G Cost (US$) per 100 rxns: 2
Chloroform FisherScientific C298-500 Cost (US$) per 100 rxns: 2
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) Invitrogen AM9515 Cost (US$) per 100 rxns: 80
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol FisherScientific BP2818500 Cost (US$) per 100 rxns: 30
Molecular-grade Isopropanol FisherScientific BP2618500 Cost (US$) per 100 rxns: 3
TURBO DNA-free Kit  Invitrogen AM1907 Cost (US$) per 100 rxns: 110
Multiplexed colorimetric RT-LAMP:
Guanidine Hydrochloride Alfa Aesar AAJ6548522 Cost (US$) per 100 rxns: 1
RT-LAMP E1-Primers IDT n/a Cost (US$) per 100 rxns: 7
RT-LAMP N2-Primers IDT n/a Cost (US$) per 100 rxns: 7
Synthetic SARS-CoV-2 RNA ATCC VR-3276SD Cost (US$) per 100 rxns: 14
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG NEB M1800S Cost (US$) per 100 rxns: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler Eppendorf 950030010
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470
Kit for RNA extraction:
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit Qiagen 61904 Cost (US$) per 100 rxns: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2 RNA ATCC VR-3276SD Cost (US$) per 100 rxns: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Applied Biosystems 4444432 Cost (US$) per 100 rxns: 180
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes IDT 10006713 Cost (US$) per 100 rxns: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Quantabio 95132-100
QuantiNova Pathogen  Qiagen 208652
QuantiNova Probe Qiagen 208352
UltraPlex 1-Step ToughMix  Quantabio 95166-100
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System BioRad 1855196
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR  Invitrogen 12594025
Lab cleanup:
DNAZap Invitrogen AM9890
RNAZap Invitrogen AM9780

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
  2. Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730 (2020).
  3. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
  4. Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
  5. Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
  6. How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
  7. Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
  8. Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
  9. Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  10. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
  11. Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
  12. Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
  13. Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437 (2018).
  14. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  15. Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074 (2020).
  16. Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
  17. Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  18. Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
  19. Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
  20. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  21. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
  22. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. 38, 870-874 (2020).
  23. Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
  24. Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
  25. Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
  26. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 28 (12), 63 (2000).
  27. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  28. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
  29. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
  30. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  31. OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
  32. Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
  33. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  34. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  35. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
  36. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  37. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  38. Wallace, D. M. Precipitation of nucleic acids. Methods in Enzymology. 152, 41-48 (1987).
  39. COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
  40. CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
  41. Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045 (2020).
  42. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
  43. Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
  44. Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
  45. Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
  46. COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
  47. COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
  48. COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
  49. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Tags

Biologie virale reservoirs in het milieu fomite RNA-virussen wereldwijde gezondheid ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) coronavirusziekte 2019 (COVID-19) omgekeerde transcriptie lusgemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP) moleculaire epidemiologie virale afstoting citizen science
Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas, M. I., Giles, S. S., Little,… More

Rojas, M. I., Giles, S. S., Little, M., Baron, R., Livingston, I., Dagenais, T. R. T., Baer, J., Cobián-Güemes, A. G., White, B., Rohwer, F. Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs. J. Vis. Exp. (170), e62379, doi:10.3791/62379 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter