시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

요약

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

초록

기판 단백질의 내부 리신 잔류물, 유비쿼터스라고 불리는 공정에 유비퀴틴(Ub)의 공유 부착은 진핵 생물에서 가장 중요한 번역 후 수정 중 하나를 나타냅니다. 유비퀴틸화는 유비퀴틴 활성화 효소(E1 효소), 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소(E2 효소), 유비퀴틴 리구아제(E3 효소) 등 3가지 효소 클래스의 순차적 캐스케이드에 의해 매개되며, 때로는 유비퀴틴 사슬 연공인자(E4 효소)에 의해 매개된다. 여기서, 유비퀴틸레이션 분석용 체외 프로토콜이 제공되어 E3 유비퀴틴 리가제 활성, E2-E3 쌍 간의 협력 및 기판 선택의 평가를 가능하게 한다. E2-E3 쌍의 협력은 E3 리게아제의 무료 폴리 유비퀴틴 체인 및/또는 자동 유비쿼터션의 생성을 모니터링하여 스크리밍할 수 있습니다. 기판 유비쿼터틸레이션은 E3 리게아제의 선택적 결합에 의해 정의되며 체외 반응의 서쪽 블로팅에 의해 검출될 수 있다. 또한, E2~Ub 방전 분석체가 설명되어 있으며, 이는 기능적 E2-E3 협력의 직접적인 평가를 위한 유용한 도구이다. 여기서, 유비퀴틴의 E3 의존적 전달은 해당 E2 효소로부터 자유 리신 아미노산(기판 유비쿼터티화를 모방) 또는 E3 리게아제 자체의 내부 리신(auto-ubiquitylation)에 따른다. 결론적으로, E3 리구아제 촉매 기능을 해결하기 위해 빠르고 수행하기 쉬운 세 가지 다른 체외 프로토콜이 제공됩니다.

서론

유비쿼터션은 Ub가 기판 단백질^1에공동으로 연결되는 과정입니다. Ub 수정은 세 가지 효소 클래스, 즉Ub 활성화 효소 (E1s), Ub-컨쥬게이팅 효소 (E2s), Ub ligases (E3s), 그리고 아마도 Ub 사슬 연신 요인 (E4s)^2,3,4,5의작용을 포함하는 연속적인 효소 반응에 의해 촉매된다. E1에 의한 Ub의 아데노신 트리호스페이트(ATP)와 마그네슘(Mg^2+)의존적활성화 후, E1의 활성 부위 시스테인은 Ub의 C-말단 글리신을 공격하여 티오에스테르 복합체(Ub~E1)를 형성한다. ATP 가수분해에서 가져온 에너지는 Ub가 다음과 같은 효소 캐스케이드 전반에 걸쳐 유지되는 높은 에너지 전환 상태를 달성하게 합니다. 다음으로, E2 효소는 활성 Ub를 내부 촉매 시스테인으로 전달하여 일시적인 Ub~E2 티오에스테르 결합을 형성합니다. 이어서, Ub는 기판 단백질로 옮겨질 것입니다.

이 작업은 두 가지 방법으로 수행할 수....

프로토콜

1. 버퍼 및 시약 준비

참고: 실험실에서 수동으로 제조된 버퍼 및 시약은 다음과 같습니다. 프로토콜에 사용된 다른 모든 버퍼 및 시약은 다른 소스에서 구입하여 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다.

1. 10배 인산염 완충식식염(10배 PBS)을 준비한다. 이를 위해 염화나트륨 1.37M 나트륨(NaCl), 염화27m 칼륨(KCl), 디나트륨-수소-인산염 이수제 80mMM(Na₂HPO₄.2 H_2O),20mMMMM의 칼륨-디수소 인산염(KH2_PO4)2l(2PO 4) 2L를 2L로 혼합한다. 10x PBS를 오토클레이브하고 ddH₂O로 1배 PBS 솔루션을 준비합니다.
   1. 오토클레이빙은 121°C 및 98.9kPa에서 15분 동안 수행됩니다.
      참고: 자동 연결은 모든 버퍼 및 솔루션에 대해 이러한 조건에서 수행됩니다. 달리 표시되지 않으면 솔루션이 실온(RT)에 저장됩니다.
2. PBS-Tween(PBS-T) 솔루션 1L을 1x PBS1L에 0.1% 펜을 추가하여 준비합니다.
3. ddH₂O. ....

결과

유비퀴틴 리가제 칩과 협력하는 E2 효소를 식별하기 위해, E2 후보 세트는 체외 유비쿼터션 반응에서 개별에서 테스트되었다. 협력 E2-E3 쌍은 E3 의존형 유비쿼터티화 제품, 즉E3 리게세의 자동 편평성 및 무료 Ub 폴리머형성에 의해 모니터링되었다. 유비쿼터티화 제품은 서양 블로팅에 의해 분석되었다. 데이터 해석은 분자량 마커를 가진 결과 단백질 밴드의 크기 비교를 기반으로 합니다. 단백질 유비쿼터스는 각각 의 크기 차이가 8.6 kDa (단일 Ub 분자의 크기)를 가진 이중 밴드 또는 다중 반복 밴드의 외관을 특징으로하는 특정 밴드 패턴의 형성에 이르게한다.

여기서, 9개의 E2s의 능력은 야생형칩(도 1A),비활성 U박스 돌연변이 칩(H260Q)(도 1B)또는 칩(보충도면 S1)의존재속에서 시험되었다. .......

토론

이 논문은 E3 리게아제 기능 의 분석을 위한 기본 체외 보편화 방법을 설명합니다. 시험관 내 유비쿼터티션 어약을 수행할 때, 일부 E2 효소는 활성^{부위(30)에}근접한 자체 리신 잔류물의 공격으로 인해 자동 유비쿼터티화를 수행할 수 있다고 고려해야 한다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 각각의 리신 잔류물이 아르기닌으로 교환되는 E2 돌연변이제를 사용하는 것이 좋습니다, 이는 자동^{유비쿼터션(32)에}저항하는 촉매 활성 E2 효소를 초래한다. 이는 분석의 재현성을 보장하기 위해 리신 방전 분석서를 통해 Ub 전송을 모니터링할 때 특히 중요합니다. 또 다른 중요한 요소는 E2~Ub 티오에스 본드의 일시적인 특성입니다. 티오에스테르 안정성이 시험관내 적용에서 가능한 경우, E2의 활성 시스테인 잔류물은 세린으로 교환되어 보다 안정적인 E2~Ub^{oxyester(33)를}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amershan Protran 0.1 &마이크로; m NC	GE Healthcare	10600000	니트로셀룰로오스 멤브레인
Anti-CHIP	세포 신호	2080	단클론 토끼 항 CHIP 항체, 클론 C3B6
Anti-MYC	Roche	OP10	단일 클론 마우스 anti-MYC 항체, 클론 9E10
Anti-ubiquitin	Upstate	05-944	Monoclonal mouse anti-Ub 항체, 클론 P4D1-A11
Apyrase	Sigma	A6535-100UN
ATP (10x)	Enzo	12091903
BSA	Sigma	A6003-10G
EDTA	Roth	8043.2
KCl	Roth	6781.1
K2HPO4	Roth	P749.2
KH2PO4	Roth	3904.1
LDS 샘플 버퍼 (4x)	novex	B0007
L-라이신	시그마	L5501-5G
MES	Roth	4256.4
MeOH	VWR 화학 물질	2,08,47,307	100%
Milchpulver	Roth	T145.3
NaCl	Roth	P029.3
NuPAGE 항산화		NP0005
NuPAGE 전송 buffer(20x)	novex	NP0006-1
Page ruler plus	Thermo Fisher	26619	단백질 사다리
RotiBlock	Roth	A151.1	차단 시약
SDS(20%)	Roth	1057.1
S1000 Thermal Cycler	Bio Rad	1852196
Trans-Blot Turbo	Bio Rad	1704150EDU	이송 시스템
Tris base	Roth	4855.3
Tween 20	Roth	9127.2
UbcH 효소 세트	BostonBiochem	K-980B	E2 효소
Ubiquitin	BostonBiochem	U-100H
유비퀴틴 활성화 효소 E1	Enzo	BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x)	Enzo	BML-KW9885-001
Whatman 블로팅 페이퍼	Bio Rad	1703969	매우 두꺼운 여과지