Summary
توضح هذه المقالة نهجا جراحيا فعالا لإنشاء نقص التروية الحاد في الفئران ذات الشق الصغير. ويمكن تطبيق هذا النهج من قبل معظم مجموعات البحوث دون أي تحسينات مختبرية.
Abstract
الغرض من هذه الدراسة هو إدخال وتقييم نهج جراحي معدل للحث على نقص التروية الحاد في الفئران التي يمكن تنفيذها في معظم مختبرات الحيوانات. خلافا للنهج التقليدي للربط المزدوج للشريان الفخذي (DLFA) ، تم إجراء شق أصغر على المنطقة الأربية اليمنى لفضح الشريان الفخذي القريب (FA) لأداء DLFA. ثم، باستخدام خياطة 7-0، تم سحب الشق إلى منطقة الركبة لفضح FA البعيدة. تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) على الأطراف الخلفية الثنائية للكشف عن انسداد الاتحاد الإنجليزي بعد الجراحة. في 0, 1, 3, 5, و 7 أيام بعد الجراحة, تم تقييم الانتعاش الوظيفي للأطراف الخلفية بصريا ومتدرج باستخدام مقياس تارلوف. تم إجراء تقييم الهسطولوجيا بعد القتل الرحيم للحيوانات بعد 7 أيام من DLFA. تم تنفيذ الإجراءات بنجاح على الساق اليمنى في عشرة فئران ApoE-/- ، ولم تمت أي فئران أثناء الملاحظة اللاحقة. كانت أحجام الشق في جميع الفئران العشرة أقل من 5 مم (4.2 ± 0.63 مم). وأظهرت نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي أن تدفق الدم FA في الجانب الإقفاري كان محظورا بشكل واضح. أظهرت نتائج مقياس Tarlov أن وظيفة الأطراف الخلفية انخفضت بشكل كبير بعد الإجراء وتعافى ببطء على مدى الأيام السبعة التالية. أظهر التقييم النسيجي استجابة التهابية كبيرة على الجانب الإقفاري وانخفاض كثافة الأوعية الدموية الدقيقة في الطرف الخلفي الإقفاري. في الختام، تقدم هذه الدراسة تقنية معدلة باستخدام شق مصغر لإجراء نقص التروية في الأطراف الخلفية (HLI) باستخدام DLFA.
Introduction
هناك حاجة غير ملباة لنماذج الحيوانات قبل السريرية للبحث في أمراض الأوعية الدموية مثل أمراض الشرايين الطرفية (PAD). على الرغم من التطورات المتقدمة في التشخيص والعلاج ، كان هناك أكثر من 200 مليون مريض يعانون من PAD في عام 20181، وعددهم في تزايد مستمر. علىالرغممن أن العديد من النهج العلاجية الجديدة 2،3،4،5،6،7 قد وصفت ، الترجمة الناجحة لهذه الطرائق العلاجية في التطبيق السريري لا تزال مهمة شاقة. لذلك ، مطلوب نماذج تجريبية موثوقة ووثيقة الصلة في الجسم الحي تحاكي حالة المرض البشري للتحقيق في الآلية المحتملة وكفاءة هذه النهج العلاجية الجديدة لعلاج PAD6،7.
فرط الدهون و تصلب الشرايين (AS) هي عوامل الخطر الرئيسية لتطوير PAD. ApoE-/- الفئران (على نظام غذائي عالي الدهون) عرض التمثيل الغذائي للدهون غير طبيعية وفرط الدهون وتطوير في وقت لاحق لويحات تصلب الشرايين مما يجعل ApoE-/- الفئران كأفضل خيار لمحاكاة PAD ذات الصلة سريريا. يتم إنشاء نماذج HLI قبل السريرية من خلال الربط المزدوج للشريان الفخذي (DLFA) ، وهو النهج الأكثر استخداما في المختبرات في جميع أنحاء العالم8و9و10و 11و12و13و14و15 لمحاكاة نقص التروية الحاد على المزمن. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج عادة شق كبير نسبيا والغازية. وعلاوة على ذلك، فإنه يؤدي حتما إلى الحيوانات (وخاصة الفئران) الذين يعانون من زيادة إصابة الألم والالتهاب، مما يؤثر أيضا على النتائج التجريبية اللاحقة5،6،16،17. تصف هذه الورقة نموذج HLI حاد على مزمن في APOE-/- الفئران باستخدام شق صغير جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبدأ التوجيهي للمفوضية الأوروبية EC 2010/63/EU وتمت الموافقة عليها من قبل التشريع الألماني المحلي (35-9185.81/G[1]239/18). عشرة ذكور ApoE-/- الفئران مع C57BL/6J الخلفية, وزنها 29.6-38.0 غرام, تم إيواء على 12 ساعة ضوء / دورة الظلام وتغذية نظام غذائي غربي (1.25٪ الكوليسترول و 21٪ الدهون) والمياه الإعلانية libitum لمدة 12 أسبوعا من سن 8 أسابيع. تم إجراء HLI على الفئران البالغة من العمر 20 أسبوعا كما هو موضح أدناه.
1. التعريفي من HLI في ApoE-/- الفئران
- إعداد المعدات والأدوات اللازمة للجراحة (انظر جدول المواد والشكل 1). تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق الالاستعباد التلقائي قبل الاستخدام واستخدام معقم حبة الزجاج أثناء العملية.
- تخدير الماوس مع حقن تحت الجلد (S.C.) من خليط من ميدازولام (5 ملغ / كغ), ميدتوميدين (0.05 ملغ / مل / كجم), والفنتانيل (0.5 ملغ / كغ) قبل جميع العمليات الجراحية.
- بعد بداية التخدير، استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف، وتأكد من عدم وجود منعكس انسحاب دواسة في الأمامية والطرف الخلفي.
- بعد ذلك ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية في حوالي 37 درجة مئوية. باستخدام مسحات القطن وكريم إزالة الشعر، وإزالة الشعر بعناية من الجلد الطرف الخلفي على الجانب الأيمن.
ملاحظة: يجب استخدام كريم إزالة الشعر بكمية كافية لتغطية الأطراف الخلفية، وخاصة المنطقة الأربية حيث سيتم إجراء الشق. يجب استخدام كريم إزالة الشعر لمدة أقل من 3 دقائق وينبغي إزالته بعد ذلك بمسحات القطن الرطبة 2 إلى 3 مرات. - ضع الماوس في وضع السطخ على وسادة التدفئة تحت مجهر تشريح. استخدام مطهر الجلد (انظر جدول المواد)لتطهير الجلد من الماوس. بعد ذلك، استخدم ملقط مدبب ومقص جراحي لإجراء شق 3-4 ملم تقريبا في وسط المنطقة الأربية. راجع الشكل 2 للحصول على تخطيطي للإجراء.
- إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد بعناية مع مساعدة من ملقط مدببة غرامة لفضح حزمة الأوعية الدموية العصبية الفخذية القريبة. استخدام بعناية ملقط مدببة غرامة لاختراق غشاء غمد الفخذ. استخدم مسحة قطنية مبللة بالمحلول الملحي لتحريك الشريان الفخذي (FA) بعناية بعيدا عن العصب الفخذي (FN) والوريد الفخذي (FV).
- تمرير اثنين من الغرز 7-0 القابلة للامتصاص من خلال الاتحاد الانجليزي القريب، وجعل عقدة مزدوجة باستخدام مقص الربيع لتعبر الاتحاد الانجليزي بين العلاقات اثنين.
- لكشف الاتحاد الإنجليزي القاصي، مرر خياطة قابلة للامتصاص 7-0 من خلال الحافة السفلية للشق واسحب الشق برفق إلى منطقة الجانب الأيمن من الركبة في الطرف الخلفي.
- تحريك الأنسجة تحت الجلد جانبا بعناية لفضح حزمة العصبية الوعائية. استخدام ملقط مدببة غرامة لاختراق غشاء غمد الفخذ، وتشريح الاتحاد الانجليزي من FV وFN.
- تمرير اثنين من الغرز 7-0 قابلة للامتصاص من خلال الاتحاد الانجليزي البعيدة، وجعل عقدة مزدوجة. استخدام مقص الربيع لتقطيع الاتحاد الانجليزي بين العلاقات اثنين.
ملاحظة: لم يتم إجراء أي ربط على الطرف الأيسر، والذي كان بمثابة عنصر تحكم في كل فأر. - بعد ذلك، استخدم الغرز القابلة للامتصاص 6-0 لخياطة الشق. ضع الماوس على وسادة التدفئة في قفص نظيف ومواصلة رصد معالمها الحيوية حتى الانتعاش. توفير المسكنات بعد العملية الجراحية: بوبرينورفين s.c. (0.1 ملغ / كجم وزن الجسم كل 8 ساعات لمدة 48 ساعة). 48 ساعة بعد العملية، وإعطاء metamizole في مياه الشرب (24 ملغ / 5 مل من الماء يتوافق مع جرعة من 200 ملغ / كغ 4 مرات يوميا).
2. التصوير بالرنين المغناطيسي
ملاحظة: بعد يوم واحد من DLFA ، يجب أن تخضع الفئران للتصوير بالرنين المغناطيسي لتقييم انسداد FA.
- ضع الماوس في غرفة تعريف شفافة ، وتخدير الماوس مع isoflurane 1.5-2 ٪ في الهواء المحيط حتى فقدان حق منعكس.
- ضع الماوس على سرير حيواني ساخن مجهز بحامل لدغة ووضعها نحو المغناطيس مع نظام يتم التحكم فيه بالليزر. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37±1 درجة مئوية.
- أثناء الحصول على الصورة، والحفاظ على التخدير مع 1.5-2٪ isoflurane في الهواء المحيط، ورصد التنفس باستخدام مسبار الضغط.
- الحصول على الصور في اتجاه الشريحة العرضية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) وقت الطيران (TOF) تسلسل تصوير الأوعية مع المعلمة صدى الوقت (TE) / وقت التكرار (TR) / زاوية الوجه (FA) = 2 مللي ثانية / 12 مللي ثانية / 13 درجة ، أربعة متوسطات، مصفوفة اقتناء من 178 × 144 أعيد بناؤها إلى 256 × 192 و 121 شرائح، مما أدى إلى قرار متساوي الخواص من 0.15 ملم3. لقمع الإشارة من الأوردة، ضع شريحة تشبع distally إلى الأطراف الخلفية.
3. التقييم السريري والمتابعة
- تقدير الانتعاش الوظيفي في 1st, 3rd,5 th, و7 أيام بعد الجراحة باستخدام مقياس تارلوف الوظيفي18,19 ( الجدول1).
4. تقييم الهسولوجيا
- بعد سبعة أيام من الجراحة، ضعي حقن البنتوباربيتال (115 ملغم/كغ) للقتل الرحيم للفئران.
- مادة ملحية مرزومة بالفوسفات (PBS) تحتوي على 1٪ بارافورمالديهايد (PFA) من خلال البطين القلبي الأيسر (100 مل لكل فأر). إصلاح gastrocnemius الثنائية (جنرال موتورز) من الفئران في 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- تضمين العينة في البارافين وفقا للبروتوكول20الموصوف سابقا .
- قطع 4-5 ميكرومتر أجزاء سميكة من كتلة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين على microtome. مع مساعدة من فرشاة الطلاء جولة، ضع أقسام الأنسجة قطع في حمام الماء الحفاظ على 42 درجة مئوية.
- أدخل شريحة المجهر في الماء بزاوية 45 درجة، وضع بعناية تحت مجموعة من المقاطع التي سيتم جمعها.
- رفع الشريحة بعناية من الماء، والسماح للأقسام نعلق على الشريحة والجافة بين عشية وضحاها في حاضنة benchtop في 37 درجة مئوية.
- أداء hematoxylin / إيوزين (HE) تلطيخ أقسام البارافين.
- ضع الشرائح التي تحتوي على المقاطع في شرائح الشرائح. إعداد 3 حاويات من xylene الطازجة، ووضع الشرائح في كل حاوية لمدة 5 دقائق لإزالة الأقسام.
- إعادة ترطيب المقاطع عن طريق غمس شرائح على التوالي في 96٪، 80٪، 70٪، 50٪، 30٪ الإيثانول، والمياه deionized لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- وصمة عار في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق.
- نقل شرائح إلى وعاء من الماء deionized وشطف عن طريق وضع تحت الماء الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق.
- باستخدام المجهر، تحقق من شدة تلطيخ الهيماتوكسيلين. إذا كان تلطيخ تمكن من تحديد نواة الخلية بوضوح، والاستمرار في الخطوة التالية. إذا كانت شدة التلطيخ لا تسهل تحديد نواة الخلية أو إذا كانت شدة التلطيخ باهتة ، ضع الشريحة في محلول hematoxylin لمدة دقيقة واحدة ، وكرر الغسيل بالماء (الخطوة 4.4.4) ، ثم تحقق مرة أخرى.
- مضادة في حل إيوزين-Y لمدة 5 دقائق.
- يجفف الأقسام عن طريق غمس الشرائح على التوالي في حاويات تحتوي على مياه تأينية و 30٪ و 50٪ و 70٪ و 80٪ و 96٪ إيثانول على التوالي لمدة 10 s لكل منها. بعد ذلك ، ضع المقاطع بشكل تسلسلي في ثلاث حاويات من الزيلين الطازج مقابل 10 ق لكل منها.
- ضع الشرائح أفقيا على خرائط تخزين الشرائح المجهرية مع الأقسام التي تواجه لأعلى. إضافة متوسطة تركيب كافية على الشريحة، وتركيب الشرائح مع coverlips.
- إجراء تلطيخ الهسيميائي المناعي (IHC) لأقسام البارافين.
- كرر خطوات إزالة الترطيب والإماهة 4.4.1-4.4.2. ثم، تزج المقاطع في وعاء مع 10 MM الصوديوم سيترات العازلة، درجة الحموضة 6، وتقديم العينة ليغلي في الميكروويف.
ملاحظة: بما أن الإفراط في تسخين العينات أو تحتها يمكن أن يسبب تلطيخا غير متناسق، حافظ على درجة الحرارة عند أقل بقليل من نقطة الغليان لمدة 10 دقائق. - بعد ذلك، تبريد المقاطع على مقاعد البدلاء لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اغسل المقاطع في PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. جفف المنطقة المحيطة بالعينة بعناية، وارسم دائرة كبيرة حول العينة باستخدام قلم مسعور. .
ملاحظة: لا تلمس العينة أبدا. وضع علامات باستخدام قلم مسعور يخلق حدود مسعورة ، مما يسهل استخدام حجم أصغر من محلول الأجسام المضادة. - Quench نشاط البيروكسيداز الذاتية عن طريق وضع القسم في 0.3٪ H2O2 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. كتلة المقاطع مع 400 ميكرولتر من كتلة العازلة (PBS تحتوي على 3٪ الألبومين مصل البقري و 0.3٪ من المنظفات غير الأيونية) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
- غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، أضف 100-400 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة CD31 (1:250) بما يكفي لتغطية القسم. بعد ذلك، احتضان أقسام بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة رطبة.
ملاحظة: تأكد من أن القسم مغطى بالكامل بمحلول الأجسام المضادة. - إزالة الأجسام المضادة الأساسية، وغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- إعداد 3، 3'-diaminobenzidine (DAB) خليط بإضافة 1 قطرة من التركيز DAB إلى 1 مل من حمأة DAB، وتخلط جيدا. بعد ذلك، أضف 100-400 ميكرولتر من خليط DAB إلى الأقسام، وراقب عن كثب عن طريق العين لمدة دقيقتين حتى يتم ملاحظة كثافة تلطيخ مقبولة.
ملاحظة: تأكد من أن القسم مغطى بالكامل بخليط DAB. - بعد ذلك، شطف تحت الماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين كما هو موضح في الخطوات 4.4.3-4.4.5.
- تنفيذ تلطيخ eosin-Y الموصوفة في الخطوة 4.4.6. تنفيذ خطوات الجفاف الموضحة في الخطوة 4.4.7.
- تحميل المقاطع مع coverlips باستخدام تركيب المتوسطة. استخدم ImageJ لتقدير نسبة مساحة CD31 الإيجابية (٪) في 5 حقول تم اختيارها عشوائيا (40x) يمكن اعتبارها كثافة الأوعية الدموية الدقيقة كما هو موضح سابقا21.
- كرر خطوات إزالة الترطيب والإماهة 4.4.1-4.4.2. ثم، تزج المقاطع في وعاء مع 10 MM الصوديوم سيترات العازلة، درجة الحموضة 6، وتقديم العينة ليغلي في الميكروويف.
5. التحليل الإحصائي
- استخدام برنامج التحليل الإحصائي للتعبير عن النتائج على أنها متوسط الانحراف المعياري ± وإجراء اختبار tغير المدفوع على المقارنات. النظر في P < 0.05 لتكون ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خصائص ApoE-/- الفئران
تم إجراء جراحات DLFA بنجاح على 10 فئران لإنشاء نموذج HLI ، ولم يمت أي من الفئران بعد العملية. لمتابعة التغيرات في وزن الجسم ، تم وزن الفئران قبل إجراء DLFA (قبل DLFA) وبعد 7 أيام من جراحة DLFA (بعد DLFA). تراوحت أوزان ما قبل DLFA من 29.6 إلى 38.0 غرام (متوسط 34.74 ± 2.47 غرام)، وتراوحت أوزان ما بعد DLFA من 26 من 5 إلى 34.1 غرام (متوسط 30.77 ± 2.15 غرام)، والتي كانت أقل بكثير من أوزان ما قبل DLFA (P < 0.05، الشكل 3A). تراوح وقت الجراحة من 15 إلى 47 دقيقة (يعني 34.2 ± 8.82 دقيقة ، وليس بما في ذلك وقت التخدير). تراوح حجم الشق في 10 فئران من 3 إلى 5 مم (متوسط 4.2 ± 0.63 مم).
التصوير بالرنين المغناطيسي والتعافي الوظيفي
التصوير بالرنين المغناطيسي يشير بوضوح شديد إلى أن المناطق القريبة والبادئة من الاتحاد الانجليزي الحق لم تظهر أي انحراف (الشكل 3C)، مما يدل على نجاح هذه الطريقة. بعد يوم واحد من الجراحة، انخفضت نتائج مقياس تارلوف بشكل ملحوظ(P < 0.05). وعلى الرغم من أن النتائج زادت ببطء خلال الأيام التالية، إلا أنها كانت لا تزال أقل من خط الأساس حتى اليوم السابع(P < 0.05، الشكل 3B). هذه الاتجاهات تتفق مع التقارير السابقة20. لم يلاحظ أي نخر أو نمو الأنسجة الغرغرينية في الجوانب الثنائية للأطراف الخلفية لأي فئران. ومع ذلك ، لم تتمكن كفوف الأطراف الخلفية الإقفارية في 7 فئران من التمدد بشكل طبيعي مقارنة بالجانب المقابل. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت كفوف الأطراف الخلفية الإقفارية في 4 فئران تلونا طفيفا مقارنة بالجانب المقابل(الشكل 3D).
التحليل النسيجي
في تلطيخ HE من العضلات المعدلة وراثيا الحق، أظهرت الألياف العضلية نخر نقص التروية غير النظامية. وقد حلت خلايا السواتل المنتشرة محل الألياف العضلية النخرية ووزعت على كتلة و/أو مع تشتت غير منتظم. أظهرت الألياف العضلية تسلل التهابي بواسطة الضامة متعددة النوى. فقدت الألياف العضلية في المناطق الالتهابية خصائصها المورفولوجية الطبيعية ، وكان هناك عدد قليل من الألياف العضلية المجددة. كانت الأقسام العرضية من هذه الألياف العضلية المجددة مستديرة ، وكانت السيتوبلازم ملطخة باللون الأحمر ، وكانت نواة صغيرة واحدة أو نواة متعددة موجودة في المركز. في المقابل ، لم يلاحظ هذا النوع من النمط الالتهابي في المعدلة وراثيا اليسرى(الشكل 4). تم إجراء تلطيخ الأجسام المضادة CD31 لتحديد الخلايا البطانية للوعاء في عينات Gm ، وتم استخدام ImageJ لتقييم المنطقة الإيجابية CD31 - بديل لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة في كل مجال من مجالات الرؤية الخمسة (40x) لكل عينة. أظهرت الأطراف الخلفية الإقفارية كثافة الأوعية الدموية الدقيقة أكثر بكثير من الجانب غير الإقفاري(P < 0.05، الشكل 5).
الشكل 1: المعدات والأدوات اللازمة للتجربة. (أ) تشريح المجهر ووسادة التدفئة المطلوبة للجراحة. (ب) الأدوات الجراحية: 1. 7-0 و 6-0 الغرز القابلة للامتصاص، 2. حامل إبرة، 3. ملقط بلا أسنان، 4. مقص الربيع، 5. ملقط مدببة غرامة، 6. ملقط مدببة، و 7. مقص الجراحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:رسم تخطيطي للإجراء. (A و D) يتم إجراء شق صغير على المنطقة الأربية لفضح الفخذ القريب A، الذي يتم ربطه. (B و E) يتم استخدام خياطة 6-0 لسحب الشق إلى منطقة الركبة لفضح عظم الفخذ A، الذي هو ربط. (C, F, و G) خياطة الشق. المختصرات: الفخذ A = الشريان الفخذي; الفخذ N = العصب الفخذي; الفخذ الخامس = الوريد الفخذي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خصائص نموذج الماوس PAD. (أ) مقارنة وزن الجسم قبل و 7 أيام بعد DLFA. (ب)الانتعاش الوظيفي تقييمها من قبل مقياس تارلوف. (ج)يشير تصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي إلى الاتحاد الإنجليزي القريب والقاصي في الطرف الخلفي الأيسر (السهم الأبيض) ، وعلى الجانب الأيمن ، يختفي الاتحاد الإنجليزي القريب والقاصي. (د) التغيرات في مظهر الطرف الخلفي الثنائي للفئران رقم 2 ورقم 4 و 1 و 7 أيام بعد DLFA. القيم المعروضة هي متوسط الانحراف المعياري ±. *P < 0.05 ، ** ف < 0.001 ، *** ف < 0.0001 ، **** ف < 0.00001 ؛ غير مدفوعة ر-اختبار. المختصرات: PAD = مرض الشريان المحيطي; DLFA = ربط مزدوج من الشريان الفخذي; FA = الشريان الفخذي; L = اليسار; R = الحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: HE تلطيخ العضلات gastrocnemius. (أ) صورة منخفضة التكبير تظهر انه تلطيخ من حق جنرال موتورز 7 أيام بعد إجراء DLFA. لوحظ التهاب في حق Gm. (ب) في المعدلة وراثيا الحق، أظهرت الألياف العضلية النخرية تسلل التهابات بواسطة الضامة (السهم الأبيض). ألياف العضلات تفقد خصائصها المورفولوجية الطبيعية. كان هناك عدد قليل جدا من الألياف العضلية المجددة (السهم الأسود). (ج) HE تلطيخ الألياف العضلية العادية من Gm. (D)العضلات المعدلة وراثيا /اليسار (nonischemic) العادي يظهر نمط الهسطولوجية العادية. أشرطة المقياس: A = 200 ميكرومتر، B-D = 50 ميكرومتر. المختصرات: HE = هيماتوكسيلين-إيوسين; DLFA = ربط مزدوج من الشريان الفخذي; جنرال موتورز = الجهاز الهضمي; L = اليسار; R = الحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة كثافة الأوعية الدموية الدقيقة للعضلات gastrocnemius الثنائية. (أ) CD31-IHC تلطيخ يمين قسم جنرال موتورز (السهام السوداء). (ب) CD31-IHC تلطيخ اليسار قسم جنرال موتورز (الأسهم السوداء). (ج)تحديد كمي لكثافة الأوعية الدموية الدقيقة في الجانب الأيمن، والتي كانت أقل بكثير من تلك الموجودة على الجانب الأيسر. القيم المعروضة هي متوسط الانحراف المعياري ±. P < 0.00001; غير مدفوعة ر-اختبار. أشرطة المقياس: A، B = 20 ميكرومتر. المختصرات: CD31 = مجموعة التمايز 31؛ IHC = الكيميائي المناعي; جنرال موتورز = المعدة والأمعاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تارلوف نقاط | 0 | لا حركة |
| 1 | حركة بالكاد محسوسة، تحمل غير الوزن | |
| 2 | حركة متكررة، تحمل غير الوزن | |
| 3 | يدعم الوزن، تحمل الوزن الجزئي | |
| 4 | يمشي مع عجز خفيف | |
| 5 | المشي العادي ولكن البطيء | |
| 6 | المشي الكامل والسريع |
الجدول 1: التهديف الوظيفي.
الجدول التكميلي S1: ملخص 25 ورقة من المؤلفات الحالية عن إنشاء نموذج PAD. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الدراسة تقارير تعديل, مبسطة, ونهج فعال جراحيا لإنشاء نموذج HLI في ApoE-/- الفئران باستخدام الربط المزدوج في المناطق القريبة والقاصية من الاتحاد الانجليزي من خلال شق 3-4 ملم دون أي ترقيات المختبر المطلوبة. السمة الرئيسية لهذه الطريقة هي أصغر حجم الشق مقارنة مع الدراسات التي سبق الإبلاغ عنها واصفا الماوس HLI نماذج8،9،10،11،12،15،20،22،23،24 .
تاريخيا، وقد بذلت شق من الركبة إلى وسائل الإعلام ضيق، الأربية، أو حتى البطن للحصول على أفضل التعرض، تتراوح بين 0.5 إلى 2 سم أو أكثر9،11،15،19،22،25،26 (ملخصة في الجدول التكميلي S1). تصف هذه الورقة تقنية جراحية لتحقيق DLFA ونتيجة لذلك ، HLI ، في الفئران ذات الشق < 5 مم (4.2 ± 0.63 ملم). تم ربط الاتحاد الإنجليزي قبل أن يتفرع إلى الشريان البوبلايتي والشريان السابهيني ، مما تسبب في نقص التروية في عدة مجموعات عضلية في الطرف الخلفي مما أدى إلى إجهاد معتدل في الفئران. على الرغم من أن الفئران تعافى وظيفيا من قبل 7 اليومبعد العملية (تارلوف يسجل قبل يوم من العملية 6 ± 0، 1st بعد يوم من العملية 3.9 ± 0.99 مقابل7 اليوم بعد العملية 5.2 ± 0.92)، لوحظ الضرر الإقفاري في جنرال موتورز على المستوى النسيجي. أولا، أظهرت جنرال موتورز في الألياف العضلية الساق الإقفارية نخر نقص التروية غير النظامية واخترقت من قبل الضامة متعددة النوى، على غرار ما تم الإبلاغ عنه في مرضى PAD27،28. على الرغم من ضمور الألياف العضلية ، لوحظ أيضا بعض الألياف العضلية المجددة ، وهو ما يتماشى مع تقرير سابق29. ثانيا، كانت كثافة الأوعية الدموية الدقيقة في الإقفارية المعدلة وراثيا فياليوم السابع بعد الربط أعلى مما كانت عليه في الساق غير الإقفارية، والتي تم الإبلاغ عنها أيضا من قبل وزارةوآخرون. التركيز الأخير في العلاج PAD لا يقتصر فقط على زيادة كثافة الأوعية الدموية الدقيقة مقارنة مع الجانب غير الإقفاري، ولكن أيضا على استعادة فقدان نقص التروية الناجم عن الأنسجة العضلية قابلة للحياة، والذي يدعم تشكيل وعاء جديد من خلال توفير مصفوفة من عوامل النمو والدعم الميكانيكي الحيوي31. وبالتالي، يعطي هذا النموذج أيضا نافذة واسعة لاختبار فعالية العلاجات الجديدة مع هذه البؤر. وعلاوة على ذلك، تحقيق HLI مع شق أصغر يتناسب مع مفهوم 3R من التجارب الحيوانية كصقل الإجراء الجراحي، أي حجم شقي الجلد الصغيرة يقلل من الصدمة والألم بعد الجراحة.
نموذج مثالي يوفر أيضا نافذة علاجية طويلة نسبيا. وقد تم الإبلاغ عن مختلف العمليات الجراحية لتحديد نقص التروية في الفئران وتطبيقها، وأنها تمارس تأثيرات مختلفة على استعادة تدفق الدم21. لتحريض HLI ، تركز الطرق الجراحية عادة على الشريان الحرقفي12،19،23،32، الشريان الفخذي24،33،34، وفروعها11،35، بعضها بما في ذلك الوريد الفخذي وكذلك36،37. كما مستوى ربط الأوعية الدموية ليس له أي تأثير على استعادة تدفق الدم، والعامل الحاسم هو مدى الإصابة في شجرة الأوعية الدموية21. لعملية ربط واحدة من الشريان الفخذي أو الحرقفي ، يتم إجراء شق صغير في المنطقة الأربية أو البطنية ، في حين لا تزال تفاعلات الفرع الأخرى مستمرة ، واستعادة التشوه في الطرف الخلفي للفأرة يتعافى تماما في غضون 7 أيام21،38. وبالتالي ، فإن ربط واحد غير كاف من حيث توفير نافذة علاجية مناسبة لاختبار آثار العلاجات المختلفة. إذا كانت الفروع من الاتحاد الإنجليزي تحتاج أيضا إلى ربط ، فيجب إجراء شق الجلد بشكل أكبر ، مما يطيل الوقت الجراحي. لذلك، HLI بواسطة DLFA في الماوس يقدم نافذة علاجية مناسبة التي يمكن رصدها بكفاءة التحسينات الناجمة عن العلاج9،21،22،25.
إنشاء نموذج HLI ذات الصلة سريريا مهم لاختبار كفاءة النهج العلاجية الجديدة، أي الخلية، الخلايا الجذعية، أو العلاج الجيني لPAD2،3،4. وقد وضعت نماذج PAD عدة في الفئران15،21، الفئران39، والأرانب40،41. أنشأ ديل Giudice وزملاؤه نموذج نقص التروية الخلفية أرنب التي أنشأتها عن طريق الجلد، عبر المفصلي، وانصمام الشريان الفخذي البعيدة مع الجسيمات معايرة التي قد تتغلب على بعض القيود المفروضة على النماذج الحيوانية القائمة40. كما ابتكر ليدل وآخرون41 نموذجا ل PAD الأرانب من خلال لف الاتحاد الإنجليزي السطحي من خلال نهج الأوعية الدموية ، مما أدى إلى انخفاض إعادة التروية في الأطراف الخلفية. على الرغم من أن الحيوانات الكبيرة، مثل الأرانب، قد تسفر عن نتائج أكثر إقناعا40،41، مع اتخاذ العلاجات خطوة أقرب إلى التطبيق السريري، ومع ذلك فإنها تتطلب زيادة التكلفة والوقت للحصول على النتائج.
على الرغم من ملف المخاطر غير المتجانس لمعظم المرضى الذين يعانون من PAD ، بما في ذلك العوامل الوراثية والسلوكية42، تظهر ApoE-/- الفئران استقلاب الدهون غير الطبيعي وأعراض فرط الدهون ، مثل الكوليسترول الكلي والدهون الثلاثية والبروتين الدهني منخفض الكثافة للغاية ، والبروتين الدهني متوسط الكثافة ، وتكرار بعض الخصائص الرئيسية التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من PAD. وعلاوة على ذلك، مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون، وهذه المؤشرات زيادة كبيرة. لو ساسو وآخرون ذكرت أن في هذه الفئران, تراكم الدهون الشريانية يحدث في 3 أشهر من العمر43, وأن زيادة في الآفات AS يحدث مع تقدم سن43. وهكذا، فإن الفئران ApoE-/- مناسبة بشكل خاص لنموذج نقص التروية الحاد على المزمن-PAD لأنها تلخص ارتفاع الكوليسترول في الدم الموجود عادة في المرضى الذين يعانون من PAD وتوفر منصة مناسبة لتقييم العلاجات المختلفة التي تستهدف تعزيز الأوعية الدموية الجديدة للأطراف الإقفارية. وعلاوة على ذلك، فإن نسبة السعر إلى الأداء لاختبار العلاجات الجديدة مع ApoE-/- الفئران لا تضاهى.
10- ورغم المزايا المذكورة في الفقرات أعلاه، هناك قيدان على هذا النموذج. أولا ، يتطلب اتقان هذه الطريقة من المجرب أن يكون لديه خبرة جراحية دقيقة كافية وألفة مع تشريح الطرف الخلفي للفأر. ثانيا، التعرض الجراحي المحدود وكمية الأنسجة الدهنية تحت الجلد في الطرف الخلفي من ApoE-/- الفئران تزيد من الصعوبة الجراحية. ولذلك، يلزم بعض الممارسات ذات الصلة للتنفيذ الناجح لهذه التقنية. في الختام، تشير هذه الدراسة إلى نهج معدل وسهل التنفيذ وفعال جراحيا لإنشاء نموذج HLI في ApoE-/- الفئران باستخدام شق صغير. يقلل الشق الصغير بشكل كبير من الصدمة على الحيوان ويمكن تطبيقه من قبل معظم مجموعات الأبحاث دون أي ترقيات مختبرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفان أن محتوى المادة قد ألف في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون فيكتوريا سكودي وألكساندر شلوند وفيليكس هورنر على الدعم الفني الممتاز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
