Summary
Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.
Abstract
El propósito de este estudio es introducir y evaluar un enfoque quirúrgico modificado para inducir isquemia aguda en ratones que se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de animales. Contrariamente al enfoque convencional para la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), se realizó una incisión más pequeña en la región inguinal derecha para exponer la arteria femoral proximal (FA) para realizar DLFA. Luego, usando una sutura de 7-0, la incisión se arrastró a la región de la rodilla para exponer la FA distal. Se utilizó una resonancia magnética (MRI) en las extremidades posteriores bilaterales para detectar la oclusión de FA después de la cirugía. A los 0, 1, 3, 5 y 7 días después de la cirugía, la recuperación funcional de las extremidades posteriores se evaluó visualmente y se calificó utilizando la escala de Tarlov. La evaluación histológica se realizó después de la eutanasia de los animales 7 días después de DLFA. Los procedimientos se realizaron con éxito en la pierna derecha en diez ratones ApoE-/-, y ningún ratón murió durante la observación posterior. Los tamaños de la incisión en los 10 ratones fueron inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Los resultados de la resonancia magnética mostraron que el flujo sanguíneo de FA en el lado isquémico estaba claramente bloqueado. Los resultados de la escala de Tarlov demostraron que la función de la extremidad posterior disminuyó significativamente después del procedimiento y se recuperó lentamente durante los siguientes 7 días. La evaluación histológica mostró una respuesta inflamatoria significativa en el lado isquémico y una densidad microvascular reducida en la extremidad posterior isquémica. En conclusión, este estudio introduce una técnica modificada utilizando una incisión en miniatura para realizar isquemia de las extremidades posteriores (HLI) utilizando DLFA.
Introduction
Existe una necesidad insatisfecha de modelos animales preclínicos para la investigación en enfermedades vasculares como la enfermedad arterial periférica (EAP). A pesar de los avances avanzados en el diagnóstico y el tratamiento, hubo más de 200 millones de pacientes con EAP en 20181, y su número aumenta constantemente. Aunque se han descrito varios enfoques terapéuticos novedosos2,3,4,5,6,7, la traducción exitosa de estas modalidades terapéuticas en la aplicación clínica sigue siendo una tarea desalentadora. Por lo tanto, se requieren modelos experimentales in vivo confiables y relevantes que simulen la condición de la enfermedad humana para investigar el mecanismo potencial y la eficiencia de estos nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EAP6,7.
La hiperlipidemia y la aterosclerosis (EA) son los principales factores de riesgo para el desarrollo de la EAP. Los ratones ApoE-/- (con una dieta alta en grasas) muestran un metabolismo anormal de las grasas e hiperlipidemia y posteriormente desarrollan placas ateroscleróticas que convierten a los ratones en ApoE-/- como la mejor opción para simular la EAP clínicamente relevante. Los modelos animales preclínicos de HLI se generan a través de la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), que es el enfoque más utilizado en laboratorios de todo el mundo8,9,10,11, 12,13, 14,15 para simular isquemia aguda sobre crónica. Sin embargo, este enfoque generalmente requiere una incisión relativamente grande e invasiva. Además, conduce inevitablemente a que los animales (especialmente los ratones) sufran un aumento de la lesión por dolor y la inflamación, lo que también influye en los resultados experimentales posteriores5,6,16,17. Este artículo describe un modelo de HLI agudo sobre crónico en ratones APOE-/- mediante el uso de una incisión muy pequeña.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la directriz CE 2010/63/EU y han sido aprobados por la legislación local alemana (35-9185.81/G[1]239/18). Diez ratones machos ApoE-/- con el fondo C57BL /6J, con un peso de 29.6-38.0 g, fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h y alimentados con una dieta occidental (1.25% de colesterol y 21% de grasa) y agua ad libitum durante 12 semanas a partir de la edad de 8 semanas. HLI se realizó en ratones de 20 semanas de edad como se describe a continuación.
1. Inducción de HLI en ratones ApoE-/-
- Preparar el equipo y las herramientas necesarias para la cirugía (ver la Tabla de Materiales y la Figura 1). Esterilice los instrumentos quirúrgicos mediante autoclave antes de usarlos y use un esterilizador de cuentas de vidrio durante la operación.
- Anestesiar al ratón con una inyección subcutánea (S.C.) de una mezcla de midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,05 mg/ml/kg) y fentanilo (0,5 mg/kg) antes de todos los procedimientos quirúrgicos.
- Después del inicio de la anestesia, use el ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad y confirme la ausencia del reflejo de extracción del pedal en la extremidad anterior y posterior.
- Después, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal central a aproximadamente 37 °C. Usando hisopos de algodón y crema depilatoria, elimine cuidadosamente el vello de la piel de la extremidad posterior en el lado derecho.
NOTA: La crema depilación debe usarse en cantidad suficiente para cubrir la extremidad posterior, especialmente la región inguinal donde se realizará la incisión. La crema depilatoria debe usarse durante menos de 3 minutos y debe eliminarse posteriormente con hisopos de algodón humedecidos de 2 a 3 veces. - Coloque el ratón en posición supina sobre la almohadilla térmica bajo un microscopio de disección. Use un antiséptico para la piel (consulte la Tabla de materiales)para desinfectar la piel del ratón. Después, use pinzas puntiagudas y tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de aproximadamente 3-4 mm en el medio de la región inguinal. Consulte la Figura 2 para obtener un esquema del procedimiento.
- Retire el tejido graso subcutáneo con cuidado con la ayuda de fórceps puntiagudos finos para exponer el haz neurovascular femoral proximal. Use cuidadosamente las pinzas puntiagudas finas para perforar la membrana de la vaina femoral. Use un hisopo de algodón humedecido con solución salina para mover la arteria femoral (FA) cuidadosamente lejos del nervio femoral (FN) y la vena femoral (FV).
- Pase dos suturas absorbibles 7-0 a través del FA proximal y haga nudos dobles usando tijeras de resorte para transectar el FA entre los dos lazos.
- Para exponer la FA distal, pase una sutura absorbible 7-0 a través del borde inferior de la incisión y arrastre suavemente la incisión a la región del lado derecho de la rodilla de la extremidad posterior.
- Mueva el tejido subcutáneo a un lado con cuidado para exponer el haz neurovascular. Use pinzas puntiagudas finas para perforar la membrana de la vaina femoral y diseccionar el FA del FV y FN.
- Pase dos suturas absorbibles 7-0 a través del FA distal y haga nudos dobles. Use tijeras de resorte para transectar el FA entre los dos lazos.
NOTA: No se realizó ligadura en el miembro izquierdo, que sirvió como control en cada ratón. - Después, use suturas absorbibles 6-0 para coser la incisión. Coloque el ratón en una almohadilla térmica en una jaula limpia y continúe monitoreando sus parámetros vitales hasta la recuperación. Proporcionar analgésicos postoperatorios: Buprenorfina s.c. (0,1 mg/kg de peso corporal cada 8 horas durante 48 h). 48 h después de la operación, administrar metamizol en agua potable (24 mg/5mL de agua corresponde a una dosis de 200 mg/kg 4 veces al día).
2. Resonancia magnética
NOTA: Un día después de DLFA, los ratones deben someterse a resonancias magnéticas para evaluar el bloqueo de FA.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción transparente y anestesia al ratón con 1,5-2% de isoflurano en el aire ambiente hasta la pérdida del reflejo de enderezamiento.
- Coloque el ratón en una cama de animal calentada equipada con un soporte de mordida y colocada hacia el imán con un sistema controlado por láser. Mantener la temperatura corporal a 37±1 °C.
- Durante la adquisición de imágenes, mantenga la anestesia con 1.5-2% de isoflurano en el aire ambiente y controle la respiración con una sonda de presión.
- Adquirir imágenes en la orientación de corte transversal utilizando una secuencia de angiografía tridimensional (3D) de tiempo de vuelo (TOF) con parámetro de tiempo de eco (TE)/tiempo de repetición (TR)/ángulo de volteo (FA) = 2 ms/12 ms/13°, cuatro promedios, una matriz de adquisición de 178 x 144 reconstruida a 256 x 192 y 121 cortes, resultando en una resolución isotrópica de 0.15 mm3. Para suprimir la señal de las venas, coloque una rebanada de saturación distalmente a las extremidades posteriores.
3. Evaluación clínica y seguimiento
- Estimar la recuperación funcional en los días1º,3º,5ºy 7º después de la cirugíamediante el uso de la puntuación funcional escala de Tarlov18,19 (Tabla 1).
4. Evaluación histológica
- Siete días después de la cirugía, aplique la inyección de pentobarbital (115 mg / kg) para sacrificar a los ratones.
- Solución salina tamponada con fosfato de perfusa (PBS) que contiene paraformaldehído al 1% (PFA) a través del ventrículo cardíaco izquierdo (100 ml por ratón). Fijar el gastrocnemio bilateral (Gm) de los ratones en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.
- Incrustar la muestra en parafina de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente20.
- Corte secciones de 4-5 μm de espesor del bloque de tejido incrustado en parafina en un microtomo. Con la ayuda de un pincel redondo, coloque las secciones de tejido cortado en el baño de agua mantenido a 42 ° C.
- Inserte el portaobjetos del microscopio en el agua en un ángulo de 45° y colóquelo cuidadosamente debajo del grupo de secciones que se van a recoger.
- Levante con cuidado el tobogán del agua y permita que las secciones se adhieran al tobogán y se sequen durante la noche en la incubadora de sobremesa a 37 ° C.
- Realizar tinción de hematoxilina/eosina (HE) de las secciones de parafina.
- Coloque las diapositivas que contienen las secciones en soportes deslizantes. Prepare 3 recipientes de xileno fresco y coloque las diapositivas en cada recipiente durante 5 minutos para desparafinar las secciones.
- Rehidrate las secciones sumergiendo las rodajas sucesivamente en 96%, 80%, 70%, 50%, 30% de etanol y agua desionizada durante 5 min cada una.
- Tinción en solución de hematoxilina durante 10 min.
- Transfiera las rodajas a un recipiente con agua desionizada y enjuague colocándolas debajo del agua corriente del grifo durante 5 minutos.
- Con un microscopio, verifique la intensidad de la tinción de hematoxilina. Si la tinción permite la identificación de los núcleos celulares claramente, continúe con el siguiente paso. Si la intensidad de la tinción no facilita la identificación de los núcleos celulares o si la intensidad de la tinción es débil, coloque el portaobjetos en la solución de hematoxilina durante 1 min, repita el lavado con agua (paso 4.4.4) y luego verifique nuevamente.
- Contratinción en solución eosin-Y durante 5 min.
- Deshidrate las secciones sumergiendo las rodajas sucesivamente en recipientes que contengan agua desionizada y 30%, 50%, 70%, 80% y 96% de etanol sucesivamente durante una duración de 10 s cada uno. A continuación, coloque las secciones secuencialmente en tres recipientes de xileno fresco durante 10 s cada uno.
- Coloque las diapositivas horizontalmente en mapas de almacenamiento de diapositivas microscópicas con las secciones hacia arriba. Agregue suficiente medio de montaje en la diapositiva y monte las diapositivas con fundas.
- Realizar la tinción inmunohistoquímica (IHC) de las secciones de parafina.
- Repita los pasos de desparafinación y rehidratación 4.4.1-4.4.2. Luego, sumerja las secciones en un recipiente con tampón de citrato de sodio de 10 mM, pH 6, y lleve la muestra a ebullición en un microondas.
NOTA: Como el sobrecalentamiento o el subcalentamiento de las muestras puede causar manchas inconsistentes, mantenga la temperatura justo por debajo del punto de ebullición durante 10 minutos. - A continuación, enfríe las secciones en una mesa de trabajo durante 30 minutos. A partir de entonces, lave las secciones en PBS tres veces durante 5 min. Seque cuidadosamente el área alrededor de la muestra y dibuje un círculo grande alrededor de la muestra con una pluma hidrofóbica. .
NOTA: Nunca toque la muestra. El marcado con una pluma hidrofóbica crea un límite hidrofóbico, lo que facilita el uso de un volumen menor de solución de anticuerpos. - Apague la actividad de la peroxidasa endógena colocando la sección en 0.3% H2O2 en PBS durante 10 min. Secciones de bloque con 400 μL de tampón de bloque (PBS contiene 3% de albúmina sérica bovina y 0,3% de detergente no iónico) durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
- Lave las secciones en PBS durante 5 min. A continuación, agregue 100-400 μL de anticuerpo anti-CD31 diluido (1:250) suficiente para cubrir la sección. Después de esto, incubar las secciones durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada.
NOTA: Asegúrese de que la sección esté completamente cubierta con la solución de anticuerpos. - Retire el anticuerpo primario y lave las secciones tres veces en PBS durante 5 minutos cada una.
- Prepare la mezcla de 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) agregando 1 gota del concentrado dab a 1 ml del diluyente DAB y mezcle bien. Después, agregue 100-400 μL de mezcla dab a las secciones y monitoree de cerca a ojo durante 2 minutos hasta que se observe una intensidad de tinción aceptable.
NOTA: Asegúrese de que la sección esté completamente cubierta con la mezcla DAB. - Después, enjuague con agua corriente del grifo durante 5 min. Realice la tinción de hematoxilina como se describe en los pasos 4.4.3-4.4.5.
- Realice la tinción de eosina-Y descrita en el paso 4.4.6. Realice los pasos de deshidratación descritos en el paso 4.4.7.
- Montaje de las secciones con fundas utilizando medio de montaje. Utilice ImageJ para estimar el porcentaje de área cd31 positiva (%) en 5 campos seleccionados al azar (40x) que pueden considerarse como densidad microvascular como se describió anteriormente21.
- Repita los pasos de desparafinación y rehidratación 4.4.1-4.4.2. Luego, sumerja las secciones en un recipiente con tampón de citrato de sodio de 10 mM, pH 6, y lleve la muestra a ebullición en un microondas.
5. Análisis estadístico
- Utilice un software de análisis estadístico para expresar los resultados como media ± desviación estándar y para realizar una prueba tno emparejada en las comparaciones. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.
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Representative Results
Características de los ratones ApoE-/-
Las cirugías DLFA se realizaron con éxito en 10 ratones para establecer el modelo HLI, y ninguno de los ratones murió después del procedimiento. Para seguir los cambios en el peso corporal, los ratones fueron pesados antes del procedimiento DLFA (Pre-DLFA) y 7 días después de la cirugía DLFA (Post-DLFA). Los pesos pre-DLFA variaron de 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g), y los pesos post-DLFA variaron de 26,5 a 34,1 g (media 30,77 ± 2,15 g), que fueron significativamente más bajos que los pesos pre-DLFA (P < 0,05, Figura 3A). El tiempo para la cirugía varió de 15 a 47 min (media 34,2 ± 8,82 min, sin incluir el tiempo de anestesia). El tamaño de la incisión en 10 ratones varió de 3 a 5 mm (media de 4,2 ± 0,63 mm).
Resonancia magnética y recuperación funcional
Las resonancias magnéticas indicaron muy claramente que las regiones proximal y distal de la AF derecha no mostraron perfusión(Figura 3C),lo que indica el éxito de este método. Un día después de la cirugía, los resultados de la Escala de Tarlov disminuyeron significativamente(P < 0,05). Aunque los resultados aumentaron lentamente en los días siguientes, todavía fueron más bajos que el valor basal hasta el día 7(P < 0,05, Figura 3B). Estas tendencias son coherentes con informes anteriores20. No se observó necrosis ni desarrollo de tejido gangrenoso en los lados bilaterales de las extremidades posteriores de ningún ratón. Sin embargo, las patas de las extremidades posteriores isquémicas en 7 ratones no pudieron estirarse naturalmente en comparación con el lado contralateral. Además, las patas de las extremidades posteriores isquémicas en 4 ratones exhibieron una ligera decoloración en comparación con el lado contralateral(Figura 3D).
Análisis histológico
En la tinción HE del músculo Gm derecho, las miofibras exhibieron necrosis isquémica irregular. Las células satélite proliferantes habían reemplazado a las miofibras necróticas y se distribuían en masa y/o con dispersión irregular. Las miofiberes exhibieron infiltración inflamatoria por macrófagos multinucleados. Las miofibras en las regiones inflamatorias habían perdido sus características morfológicas normales, y había pocas miofibras regeneradas. Las secciones transversales de estas miofibras regeneradas eran redondas, el citoplasma estaba teñido de rojo y un núcleo pequeño o múltiples núcleos se encontraban en el centro. En contraste, este tipo de patrón inflamatorio no se observó en el Gm izquierdo(Figura 4). La tinción de anticuerpos CD31 se realizó para identificar las células endoteliales del vaso en las muestras de Gm, y ImageJ se utilizó para evaluar el área CD31 positiva, un sustituto de la densidad microvascular, en cada uno de los cinco campos de visión (40x) para cada muestra. Las extremidades posteriores isquémicas exhibieron significativamente más densidad microvascular que el lado no isquémico (P < 0.05, Figura 5).
Figura 1: Equipo y herramientas necesarios para el experimento. (A) Microscopio de disección y almohadilla térmica necesarios para la cirugía. (B) Herramientas quirúrgicas: 1. Suturas absorbibles 7-0 y 6-0, 2. soporte de aguja, 3. pinzas sin dientes, 4. tijeras de resorte, 5. pinzas puntiagudas finas, 6. pinzas puntiagudas y 7. tijeras quirúrgicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración esquemática del procedimiento. (A y D) Se realiza una pequeña incisión en la región inguinal para exponer el amoral femoral proximal, que está ligado. (B y E) Se utiliza una sutura 6-0 para arrastrar la incisión a la región de la rodilla para exponer el femoral a distal, que está ligado. (C, Fy G) Costura de la incisión. Abreviaturas: Femoral A = arteria femoral; N femoral = nervio femoral; V femoral = vena femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Características del modelo de ratón PAD. (A) Comparación del peso corporal antes y 7 días después de DLFA. (B) Recuperación funcional evaluada por la Escala de Tarlov. (C) La angiografía por resonancia magnética indica que la AF proximal y distal en el miembro posterior izquierdo (flecha blanca), y en el lado derecho, la AF proximal y distal desaparecen. (D) Cambios en la apariencia de la extremidad posterior bilateral de ratones No. 2 y No. 4, 1 y 7 días después de DLFA. Los valores mostrados son la media ± la desviación estándar. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; prueba t no apareada. Abreviaturas: PAD = enfermedad arterial periférica; DLFA = doble ligadura de la arteria femoral; FA = arteria femoral; L = izquierda; R = derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción HE del músculo gastrocnemio. ( A )Imagende bajo aumento que muestra la tinción HE del Gm derecho 7 días después del procedimiento DLFA. Se observó inflamación en el Gm derecho. (B) En el Gm derecho, las miofibras necróticas exhibieron infiltración inflamatoria por macrófagos (flecha blanca). Las fibras musculares pierden sus características morfológicas normales. Había muy pocos miofiberes regenerados (flecha negra). (C) Tinción HE de miofibras normales del Gm derecho. (D) El músculo gm contralateral/izquierdo (no isquémico) muestra un patrón histológico normal. Barras de escala: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Abreviaturas: HE = hematoxilina-eosina; DLFA = doble ligadura de la arteria femoral; Gm = gastrocnemio; L = izquierda; R= derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comparación de la densidad microvascular del músculo gastrocnemio bilateral. (A) Tinción CD31-IHC de la sección gm derecha (flechas negras). (B) Tinción CD31-IHC de la sección Gm izquierda (flechas negras). (C) Cuantificación de la densidad microvascular del lado derecho, que era mucho menor que la del lado izquierdo. Los valores mostrados son la media ± la desviación estándar. P < 0,00001; prueba t no apareada. Barras de escala: A, B = 20 μm. Abreviaturas: CD31 = grupo de diferenciación 31; IHC = inmunohistoquímico; Gm = gastrocnemio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Partitura de Tarlov | 0 | Sin movimiento |
| 1 | Movimiento apenas perceptible, sin soporte de peso | |
| 2 | Movimiento frecuente, sin soporte de peso | |
| 3 | Soporta peso, soporte de peso parcial | |
| 4 | Caminatas con déficit leve | |
| 5 | Caminar normal pero lento | |
| 6 | Caminata completa y rápida |
Tabla 1: Puntuación funcional.
Tabla suplementaria S1: Resumen de 25 artículos de la literatura actual sobre el establecimiento del modelo PAD. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Este estudio informa un enfoque modificado, simplificado y quirúrgicamente eficiente para establecer un modelo de HLI en ratones ApoE-/- utilizando doble ligadura en las regiones proximal y distal de la FA a través de una incisión de 3-4 mm sin ninguna actualización de laboratorio requerida. La principal característica de este método es el menor tamaño de la incisión en comparación con los estudios previamente informados que describen modelos de HLI deratón 8,9,10,11, 12,15,20,22,23,24.
Históricamente, se ha hecho una incisión desde la rodilla hasta el medio apretado, inguinal, o incluso el abdomen para una mejor exposición, que va desde 0,5 a 2 cm o más9,11,15,19,22,25,26 (resumido en la Tabla Suplementaria S1). Este trabajo describe una técnica quirúrgica para lograr DLFA y como resultado, HLI, en ratones con una incisión < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). La FA se aligó antes de que se ramifique en la arteria poplítea y la arteria safena, causando isquemia en varios grupos musculares en la extremidad posterior y resultando en estrés moderado en ratones. Aunque los ratones se recuperaron funcionalmente alos 7º días después de la operación (puntuación de Tarlov día antes de la operación 6 ± 0, 1º día después de la operación 3,9 ± 0,99 vs 7º día después de la operación 5,2 ± 0,92), se observó daño isquémico en Gm a nivel histológico. En primer lugar, los Gm en la pierna isquémica miofiberes exhibieron necrosis isquémica irregular y fueron infiltrados por macrófagos multinucleados, similar a lo que se ha reportado en pacientes con EAP27,28. A pesar de la atrofia por miofibra, también se observaron algunas miofibras regeneradas, lo que está en línea con un informe anterior29. En segundo lugar, la densidad microvascular en el Gm isquémico en eldía 7 después de la ligadura fue mayor que en la pierna no isquémica, lo que también ha sido reportado por Ministro et al.30. El enfoque reciente en la terapia de EAP no solo se limita a aumentar la densidad microvascular en comparación con el lado no isquémico, sino también a la restauración de la pérdida inducida por isquemia del tejido muscular viable, que apoya la formación de nuevos vasos al proporcionar una matriz de factores de crecimiento y soporte biomecánico31. Así, este modelo también da una amplia ventana para probar la efectividad de nuevas terapias con estos focos. Además, lograr HLI con incisión más pequeña encaja con el concepto 3R de experimentación animal como un refinamiento del procedimiento quirúrgico, es decir, el pequeño tamaño incisional de la piel disminuye el trauma y el dolor postoperatorio.
Un modelo animal ideal también proporciona una ventana terapéutica relativamente larga. Se han reportado y aplicado diversos procedimientos quirúrgicos para establecer la isquemia en ratones, y ejercen diferentes efectos sobre la restauración del flujo sanguíneo21. Para la inducción de HLI, los métodos quirúrgicos normalmente se centran en la arteria ilíaca12,19,23,32, arteria femoral24,33,34, y sus ramas11,35, algunas incluyendo la vena femoral también36,37. Como el nivel de ligadura vascular no tiene ningún efecto sobre la restauración del flujo sanguíneo, el factor decisivo es la extensión de la lesión en el árbol vascular21. Para una sola ligadura de la arteria femoral o ilíaca, se realiza una pequeña incisión en la región inguinal o abdominal, mientras que las otras interacciones de la rama aún se mantienen, y la restauración de la perfusión en la extremidad posterior del ratón se recupera por completo dentro de los 7 días21,38. Por lo tanto, una sola ligadura no es suficiente en términos de proporcionar una ventana terapéutica adecuada para probar los efectos de diferentes tratamientos. Si las ramas de la FA también necesitan ser ligadas, la incisión en la piel debe hacerse aún más grande, lo que alarga el tiempo quirúrgico. Por lo tanto, HLI por DLFA en ratón ofrece una ventana terapéutica adecuada en la que las mejoras inducidas por la terapia pueden ser monitoreadas eficientemente9,21,22,25.
El establecimiento de un modelo animal HLI clínicamente relevante es importante para probar la eficiencia de nuevos enfoques terapéuticos, es decir, células, células madre o terapia génica para la EAP2,3,4. Se han desarrollado varios modelos de PAD en ratones15,21,ratas 39y conejos40,41. Del Giudice y sus colegas establecieron un modelo de isquemia de extremidades posteriores de conejo creado por embolización percutánea, transauricular, de la arteria femoral distal con partículas calibradas que pueden superar algunas de las limitaciones de los modelos animales existentes40. Liddell et al.41 también crearon un modelo de EAP de conejo enrollando la FA superficial a través de un enfoque endovascular, lo que resultó en una reducción de la reperfusión de las extremidades posteriores. Aunque los animales más grandes, como los conejos, pueden producir resultados más convincentes40,41,llevando las terapias un paso más cerca de la aplicación clínica, sin embargo requieren un mayor costo y tiempo para obtener resultados.
A pesar del heterogéneo perfil de riesgo de la mayoría de los pacientes con EAP, incluidos los factores hereditarios y conductuales42,los ratones ApoE-/- exhiben un metabolismo anormal de las grasas y síntomas de hiperlipidemia, como colesterol total, triglicéridos, lipoproteínas de muy baja densidad y lipoproteínas de densidad intermedia, replicando algunas de las principales características observadas en pacientes con EAP. Además, con la dieta alta en grasas, estos indicadores aumentan significativamente. Lo Sasso et al. informaron que en estos ratones, la acumulación de grasa arterial ocurre a los 3 meses de edadde 43años, y que un aumento en las lesiones de EA ocurre con la edad avanzadade 43años. Por lo tanto, los ratones ApoE-/- son particularmente adecuados para el modelo de ISQUEMIA AGUDA EN CRÓNICA-EAP porque recapitulan la hipercolesterolemia comúnmente presente en pacientes con EAP y proporcionan una plataforma adecuada para evaluar diversas terapias dirigidas a promover la neovascularización de las extremidades isquémicas. Además, la relación precio-rendimiento de probar nuevas terapias con ratones ApoE-/- es inmejorable.
A pesar de las ventajas mencionadas en los párrafos anteriores, hay dos limitaciones para este modelo. Primero, dominar este método requiere que el experimentador tenga suficiente experiencia microquirúrgica y familiaridad con la anatomía de la extremidad posterior del ratón. En segundo lugar, la exposición quirúrgica limitada y la cantidad de tejido graso subcutáneo en la extremidad posterior de los ratones ApoE-/- aumentan la dificultad quirúrgica. Por lo tanto, se requiere alguna práctica relacionada para la implementación exitosa de esta técnica. En conclusión, este estudio informa un enfoque modificado y fácil de implementar, quirúrgicamente eficiente para establecer un modelo HLI en ratones ApoE-/- utilizando una pequeña incisión. La pequeña incisión reduce significativamente el trauma en el animal y puede ser aplicada por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.
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Disclosures
Los autores declaran que el contenido del artículo fue compuesto en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Viktoria Skude, Alexander Schlund y Felix Hörner por el excelente soporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
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