Summary
Dit artikel demonstreert een efficiënte chirurgische aanpak om acute ischemie vast te stellen bij muizen met een kleine incisie. Deze aanpak kan door de meeste onderzoeksgroepen worden toegepast zonder laboratoriumupgrades.
Abstract
Het doel van deze studie is het introduceren en evalueren van een aangepaste chirurgische aanpak om acute ischemie bij muizen te induceren die in de meeste dierlaboratoria kan worden geïmplementeerd. In tegenstelling tot de conventionele benadering voor dubbele ligatie van de dijbeenslagader (DLFA), werd een kleinere incisie op het rechter inguinale gebied gemaakt om de proximale femorale slagader (FA) bloot te leggen om DLFA uit te voeren. Vervolgens werd de incisie met behulp van een 7-0 hechting naar het kniegebied gesleept om de distale FA bloot te leggen. Magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) op bilaterale achterpoten werd gebruikt om FA-occlusie na de operatie te detecteren. Op 0, 1, 3, 5 en 7 dagen na de operatie werd het functionele herstel van de achterpoten visueel beoordeeld en beoordeeld met behulp van de Tarlov-schaal. Histologische evaluatie werd uitgevoerd na het euthanaseren van de dieren 7 dagen na DLFA. De procedures werden met succes uitgevoerd op het rechterbeen bij tien ApoE-/- muizen, en geen muizen stierven tijdens de daaropvolgende observatie. De incisiegroottes bij alle 10 muizen waren minder dan 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRI-resultaten toonden aan dat de FA-bloedstroom in de ischemische kant duidelijk geblokkeerd was. De resultaten van de Tarlov-schaal toonden aan dat de functie van de achterpoten na de procedure aanzienlijk afnam en langzaam herstelde in de volgende 7 dagen. Histologische evaluatie toonde een significante ontstekingsreactie aan de ischemische kant en verminderde microvasculaire dichtheid in de ischemische achterpoot. Concluderend introduceert deze studie een aangepaste techniek met behulp van een miniatuurincisie om ischemie van de achterpoten (HLI) uit te voeren met behulp van DLFA.
Introduction
Er is een onvervulde behoefte aan preklinische diermodellen voor onderzoek naar vaatziekten zoals perifere arterieziekte (PAD). Ondanks de geavanceerde ontwikkelingen in diagnose en behandeling, waren er in 2018 meer dan 200 miljoen patiënten met PAD1, en hun aantal neemt voortdurend toe. Hoewel verschillende nieuwe therapeutische benaderingen2,3,4,5,6,7 zijn beschreven, blijft een succesvolle vertaling van deze therapeutische modaliteiten in klinische toepassing een ontmoedigende taak. Daarom zijn betrouwbare en relevante in vivo experimentele modellen nodig die de menselijke ziektetoestand simuleren om het potentiële mechanisme en de efficiëntie van deze nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van PAD6,7te onderzoeken.
Hyperlipidemie en atherosclerose (AS) zijn de belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van PAD. ApoE-/- muizen (op een vetrijk dieet) vertonen abnormaal vetmetabolisme en hyperlipidemie en ontwikkelen vervolgens atherosclerotische plaques waardoor ApoE-/- muizen de beste keuze zijn om de klinisch relevante PAD te simuleren. Preklinische HLI-diermodellen worden gegenereerd door dubbele ligatie van de femorale slagader (DLFA), wat de meest gebruikte aanpak is in laboratoria over de hele wereld8,9,10,11,12,13,14,15 om acute-op-chronische ischemie te simuleren. Deze aanpak vereist echter meestal een relatief grote en invasieve incisie. Bovendien leidt het er onvermijdelijk toe dat de dieren (vooral muizen) lijden aan verhoogde pijnschade en ontsteking, wat ook de daaropvolgende experimentele resultaten beïnvloedt5,6,16,17. Dit artikel beschrijft een acuut-op-chronisch HLI-model in APOE-/- muizen met behulp van een zeer kleine incisie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle experimentele procedures zijn uitgevoerd volgens de EG-richtlijn EC 2010/63/EU en zijn goedgekeurd door de lokale Duitse wetgeving (35-9185.81/G[1]239/18). Tien mannelijke ApoE-/- muizen met de C57BL/6J achtergrond, met een gewicht van 29,6-38,0 g, werden gehuisvest op een 12 h licht/donker cyclus en kregen een westers dieet (1,25% cholesterol en 21% vet) en water ad libitum gedurende 12 weken vanaf de leeftijd van 8 weken. HLI werd uitgevoerd op 20 weken oude muizen zoals hieronder beschreven.
1. Inductie van HLI in ApoE-/- muizen
- Bereid de benodigde apparatuur en gereedschappen voor chirurgie voor (zie de tabel met materialen en figuur 1). Steriliseer de chirurgische instrumenten via autoclaveren voor gebruik en gebruik een glazen kraalsterilisator tijdens de operatie.
- Anesthetiseer de muis met een subcutane injectie (S.C.) van een mengsel van midazolam (5 mg/kg), medetomidine (0,05 mg/ml/kg) en fentanyl (0,5 mg/kg) vóór alle chirurgische ingrepen.
- Gebruik na het begin van de anesthesie de dierenartszalf op de ogen om droogheid te voorkomen en bevestig de afwezigheid van de pedaalontwenningsreflex in de voorpoot en achterpoot.
- Plaats de muis daarna op een verwarmingskussen om de kerntemperatuur van het lichaam op ongeveer 37 °C te houden. Gebruik wattenstaafjes en ontharingscrème om voorzichtig het haar van de huid van de achterpoten aan de rechterkant te verwijderen.
OPMERKING: De ontharingscrème moet in voldoende hoeveelheid worden gebruikt om de achterlimb te bedekken, vooral het liesgebied waar de incisie zal worden gemaakt. De ontharingscrème moet worden gebruikt voor een duur van minder dan 3 minuten en moet vervolgens 2 tot 3 keer worden verwijderd met bevochtigde wattenstaafjes. - Leg de muis in rugligging op het verwarmingskussen onder een ontleedmicroscoop. Gebruik een huidantisepticum (zie de tabel met materialen)om de huid van de muis te desinfecteren. Gebruik daarna een puntige tang en een chirurgische schaar om een incisie van ongeveer 3-4 mm te maken in het midden van het liesgebied. Zie figuur 2 voor een schema van de procedure.
- Verwijder het onderhuidse vetweefsel voorzichtig met behulp van een fijne puntige tang om de proximale femorale neurovasculaire bundel bloot te leggen. Gebruik voorzichtig de fijne puntige tang om het membraan van de dijbeenschede te doorboren. Gebruik een wattenstaafje bevochtigd met zoutoplossing om de dijbeenslagader (FA) voorzichtig weg te bewegen van de heupzenuw (FN) en de dijbeenader (FV).
- Passeer twee 7-0 absorbeerbare hechtingen door de proximale FA en maak dubbele knopen met behulp van een veerschaar om de FA tussen de twee banden te transfecteren.
- Om de distale FA bloot te leggen, passeert u een 7-0 absorbeerbare hechting door de onderrand van de incisie en sleept u de incisie voorzichtig naar het gebied van de rechterkant van de knie van de achterpoot.
- Beweeg het onderhuidse weefsel voorzichtig opzij om de neurovasculaire bundel bloot te leggen. Gebruik fijne puntige tang om het membraan van de femurschede te doorboren en ontleed de FA van de FV en FN.
- Passeer twee 7-0 absorbeerbare hechtingen door de distale FA en maak dubbele knopen. Gebruik een veerschaar om de FA tussen de twee banden te transfecteren.
OPMERKING: Er werd geen ligatie uitgevoerd op de linker ledemaat, die diende als een controle in elke muis. - Gebruik daarna 6-0 absorbeerbare hechtingen om de incisie te hechten. Plaats de muis op een verwarmingskussen in een schone kooi en blijf de vitale parameters controleren tot het herstel. Zorg voor postoperatieve analgetica: Buprenorfine s.c. (0,1 mg /kg lichaamsgewicht elke 8 uur gedurende 48 uur). Dien 48 uur na de operatie metamizol toe in drinkwater (24 mg /5 ml water komt overeen met een dosis van 200 mg / kg 4 maal daags).
2. Magnetische resonantie beeldvorming
OPMERKING: Een dag na DLFA moeten de muizen MRI-scans ondergaan om FA-blokkering te beoordelen.
- Plaats de muis in een transparante inductiekamer en verdoof de muis met 1,5-2% isofluraan in de omgevingslucht tot verlies van de rechtzettingsreflex.
- Plaats de muis op een verwarmd dierenbed uitgerust met een bijthouder en gepositioneerd in de richting van de magneet met een lasergestuurd systeem. Houd de lichaamstemperatuur op 37±1 °C.
- Houd tijdens beeldacquisitie de anesthesie met 1,5-2% isofluraan in de omgevingslucht en controleer de ademhaling met behulp van een druksonde.
- Verkrijg beelden in de transversale segmentoriëntatie met behulp van een driedimensionale (3D) time of flight (TOF) angiografiesequentie met parameter echo time (TE)/repetition time (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, vier gemiddelden, een acquisitiematrix van 178 x 144 gereconstrueerd tot 256 x 192 en 121 slices, resulterend in een isotrope resolutie van 0,15 mm3. Om het signaal van de aderen te onderdrukken, plaatst u een verzadigingsschijf distaal op de achterpoten.
3. Klinische evaluatie en follow-up
- Schat het functionele herstel in de1e,3e,5een7e dag na de operatie met behulp van de functionele score Tarlov schaal18,19 (Tabel 1).
4. Histologische evaluatie
- Breng zeven dagen na de operatie pentobarbital-injectie (115 mg / kg) aan om de muizen te euthanaseren.
- Perfuseer fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% paraformaldehyde (PFA) door de linker hartkamer (100 ml per muis). Fixeer de bilaterale gastrocnemius (Gm) van de muizen in 4% PFA 's nachts bij 4 °C.
- Sluit het monster in paraffine in volgens het eerder beschreven protocol20.
- Snijd 4-5 μm dikke delen van het in paraffine ingebedde weefselblok op een microtoom. Plaats met behulp van een ronde verfkwast de gesneden weefseldelen in het waterbad dat op 42°C wordt gehouden.
- Plaats de microscoopglaas in het water onder een hoek van 45° en plaats deze voorzichtig onder de groep secties die moet worden verzameld.
- Til de glijbaan voorzichtig uit het water en laat de secties aan de glijbaan bevestigen en droog 's nachts in de incubator op de tafel bij 37 °C.
- Voer hematoxyline / eosine (HE) kleuring van de paraffine secties.
- Plaats de dia's met de secties in diahouders. Bereid 3 containers met vers xyleen voor en plaats de dia's gedurende 5 minuten in elke container om de secties te deparaffiniseren.
- Rehydrateer de secties door de plakjes achtereenvolgens in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% ethanol en gedeïoniseerd water gedurende elk 5 minuten te dopen.
- Vlek in hematoxyline-oplossing gedurende 10 min.
- Breng de plakjes over in een bak met gedeïoniseerd water en spoel af door ze gedurende 5 minuten onder stromend leidingwater te plaatsen.
- Controleer met behulp van een microscoop de intensiteit van hematoxylinekleuring. Als de kleuring het mogelijk maakt om de celkernen duidelijk te identificeren, gaat u verder met de volgende stap. Als de kleuringsintensiteit de identificatie van celkernen niet vergemakkelijkt of als de intensiteit van de kleuring zwak is, plaatst u de dia gedurende 1 minuut in de hematoxyline-oplossing, herhaalt u de was met water (stap 4.4.4) en controleert u deze opnieuw.
- Counterstain in eosine-Y oplossing gedurende 5 min.
- Droog de secties uit door de plakjes achtereenvolgens in containers met gedeïoniseerd water en 30%, 50%, 70%, 80% en 96% ethanol achtereenvolgens te dopen voor een duur van 10 s elk. Plaats vervolgens de secties achtereenvolgens in drie containers met vers xyleen gedurende 10 s elk.
- Plaats de dia's horizontaal op microscopische dia-opslagkaarten met de secties naar boven gericht. Voeg voldoende bevestigingsmedium toe op de dia en monteer de dia's met coverslips.
- Voer de immunohistochemische (IHC) kleuring van de paraffinesecties uit.
- Herhaal de deparaffinisatie- en rehydratatiestappen 4.4.1-4.4.2. Dompel de secties vervolgens onder in een container met 10 mM natriumcitraatbuffer, pH 6, en breng het monster aan de kook in een magnetron.
OPMERKING: Aangezien over- of onderverhitting van monsters inconsistente vlekken kan veroorzaken, moet u de temperatuur gedurende 10 minuten op net onder het kookpunt houden. - Koel vervolgens de secties op een bankje gedurende 30 minuten. Was daarna de secties in PBS drie keer gedurende 5 minuten. Droog het gebied rond het monster zorgvuldig af en teken een grote cirkel rond het monster met een hydrofobe pen. .
OPMERKING: Raak het monster nooit aan. Markering met een hydrofobe pen creëert een hydrofobe grens, die het gebruik van een kleiner volume antilichaamoplossing vergemakkelijkt. - Demp endogene peroxidase-activiteit door de sectie gedurende 10 minuten in PBS in 0,3%H2 O2 te plaatsen. Bloksecties met 400 μL blokbuffer (PBS bevatten 3% runderserumalbumine en 0,3% niet-ionisch wasmiddel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
- Was de secties in PBS gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 100-400 μL verdund anti-CD31-antilichaam (1:250) voldoende toe om de sectie te bedekken. Incubateer vervolgens secties 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de sectie volledig bedekt is met de antilichaamoplossing. - Verwijder het primaire antilichaam en was de secties driemaal in PBS voor een duur van elk 5 minuten.
- Bereid het 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) mengsel door 1 druppel dab-concentraat toe te voegen aan 1 ml van het DAB-verdunningsmiddel en meng goed. Voeg daarna 100-400 μL DAB-mengsel toe aan de secties en controleer nauwlettend met het oog gedurende 2 minuten totdat een aanvaardbare kleurintensiteit wordt waargenomen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het gedeelte volledig bedekt is met het DAB-mengsel. - Daarna 5 min. afspoelen onder stromend leidingwater. Voer hematoxylinekleuring uit zoals beschreven in stappen 4.4.3-4.4.5.
- Voer eosine-Y-kleuring uit zoals beschreven in stap 4.4.6. Voer uit dehydratiestappen die worden beschreven in stap 4.4.7.
- De secties met coverslips gemonteerd met behulp van montagemedium. Gebruik ImageJ om het percentage CD31-positieve gebieden (%) in 5 willekeurig geselecteerde velden (40x) te schatten dat kan worden beschouwd als microvasculaire dichtheid zoals eerder beschreven21.
- Herhaal de deparaffinisatie- en rehydratatiestappen 4.4.1-4.4.2. Dompel de secties vervolgens onder in een container met 10 mM natriumcitraatbuffer, pH 6, en breng het monster aan de kook in een magnetron.
5. Statistische analyse
- Gebruik statistische analysesoftware om de resultaten uit te drukken als gemiddelde ± standaarddeviatie en om ongepaarde t-testuit te voeren op de vergelijkingen. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kenmerken van ApoE-/- muizen
DLFA-operaties werden met succes uitgevoerd op 10 muizen om het HLI-model vast te stellen, en geen van de muizen stierf na de procedure. Om veranderingen in lichaamsgewicht te volgen, werden muizen gewogen vóór de DLFA-procedure (Pre-DLFA) en 7 dagen na de DLFA-operatie (Post-DLFA). Pre-DLFA-gewichten varieerden van 29,6 tot 38,0 g (gemiddeld 34,74 ± 2,47 g) en post-DLFA-gewichten varieerden van 26,5 tot 34,1 g (gemiddeld 30,77 ± 2,15 g), die aanzienlijk lager waren dan de pre-DLFA-gewichten (P < 0,05, figuur 3A). De tijd voor de operatie varieerde van 15 tot 47 minuten (gemiddeld 34,2 ± 8,82 min, exclusief de anesthesietijd). De incisiegrootte bij 10 muizen varieerde van 3 tot 5 mm (gemiddeld 4,2 ± 0,63 mm).
MRI-scan en functioneel herstel
De MRI-scans gaven heel duidelijk aan dat de proximale en distale regio's van de rechter FA geen perfusie vertoonden(figuur 3C),wat wijst op het succes van deze methode. Een dag na de operatie waren de resultaten van de Tarlov-schaal significant verlaagd(P < 0,05). Hoewel de resultaten de volgende dagen langzaam toenamen, waren ze nog steeds lager dan de uitgangswaarde tot dag 7(P < 0,05, figuur 3B). Deze trends komen overeen met eerdere rapporten20. Er werd geen necrose of gangreneuze weefselontwikkeling waargenomen in de bilaterale zijden van de achterpoten van muizen. De poten van de ischemische achterpoten bij 7 muizen waren echter niet in staat om op natuurlijke wijze uit te rekken in vergelijking met de contralaterale kant. Bovendien vertoonden poten van de ischemische achterpoten bij 4 muizen een lichte verkleuring in vergelijking met de contralaterale zijde(figuur 3D).
Histologische analyse
Bij HE-kleuring van de rechter Gm-spier vertoonden myofibers onregelmatige ischemische necrose. Prolifererende satellietcellen hadden de necrotische myofiberen vervangen en werden verdeeld in een massa en/of met onregelmatige dispersie. Myofibers vertoonden inflammatoire infiltratie door multinucleaire macrofagen. Myofiberen in de ontstekingsgebieden hadden hun normale morfologische kenmerken verloren en er waren weinig geregenereerde myofiberen. Dwarse delen van deze geregenereerde myofiberen waren rond, het cytoplasma was rood gekleurd en één kleine kern of meerdere kernen bevonden zich in het midden. Daarentegen werd dit soort ontstekingspatroon niet waargenomen in de linker Gm(figuur 4). CD31-antilichaamkleuring werd uitgevoerd om endotheelcellen van het vat in de Gm-monsters te identificeren, en ImageJ werd gebruikt om het CD31-positieve gebied te evalueren - een surrogaat voor microvasculaire dichtheid - in elk van de vijf gezichtsvelden (40x) voor elk monster. Ischemische achterpoten vertoonden significant meer microvasculaire dichtheid dan de niet-ischemische zijde (P < 0,05, figuur 5).
Figuur 1: Apparatuur en gereedschappen die nodig zijn voor het experiment. (A) Ontleden van microscoop en verwarmingskussen die nodig zijn voor de operatie. (B) Chirurgisch gereedschap: 1. 7-0 en 6-0 absorbeerbare hechtingen, 2. naaldhouder, 3. tandeloze tang, 4. veerschaar, 5. fijne punttang, 6. punttang en 7. chirurgische schaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van de procedure. (A en D) Er wordt een kleine incisie gemaakt op het liesgebied om de proximale femur A, die geligeerd is, bloot te leggen. (B en E)Een 6-0 hechting wordt gebruikt om de incisie naar het kniegebied te slepen om de distale foetale A, die is geligeerd, bloot te leggen. (C, Fen G) Hechting van de incisie. Afkortingen: Femoral A = femorale slagader; Femorale N = femorale zenuw; Femoraal V = femorale ader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kenmerken van het PAD-muismodel. (A) Vergelijking van het lichaamsgewicht vóór en 7 dagen na DLFA. (B) Functioneel herstel geëvalueerd door de Tarlov-schaal. ( C) Magnetische resonantie angiografie geeft de proximale en distale FA in de linker achterpoot (witte pijl) aan, en aan de rechterkant verdwijnen de proximale en distale FA. D.Veranderingen in het uiterlijk van de bilaterale achterpoot van muizen nr. 2 en nr. 4, 1 en 7 dagen na DLFA. De getoonde waarden zijn gemiddeld ± standaarddeviatie. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; ongepaarde t-test. Afkortingen: PAD = perifere slagaderziekte; DLFA = dubbele ligatie van de dijbeenslagader; FA = dijbeenslagader; L = links; R = rechts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: HE kleuring van de gastrocnemius spier. (A) Lage vergrotingsbeeld toont HE kleuring van de rechter Gm 7 dagen na de DLFA procedure. Ontsteking werd waargenomen in de rechter Gm. (B) In de rechter Gm vertoonden necrotische myofibers inflammatoire infiltratie door macrofagen (witte pijl). De spiervezels verliezen hun normale morfologische eigenschappen. Er waren zeer weinig geregenereerde myofibers (zwarte pijl). (C) HE kleuring van normale myofiberen van de rechter Gm. (D) De contralaterale/linker Gm (niet ischemische) spier vertoont een normaal histologisch patroon. Schaalstaven: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Afkortingen: HE = hematoxyline-eosin; DLFA = dubbele ligatie van de dijbeenslagader; Gm = gastrocnemius; L = links; R= rechts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van de microvasculaire dichtheid van bilaterale gastrocnemiusspier. (A) CD31-IHC kleuring van rechter Gm sectie (zwarte pijlen). (B) CD31-IHC kleuring van linker Gm sectie (zwarte pijlen). (C) Kwantificering van de microvasculaire dichtheid van de rechterkant, die veel minder was dan die aan de linkerkant. De getoonde waarden zijn gemiddeld ± standaarddeviatie. P < 0,00001; ongepaarde t-test. Schaalbalken: A, B = 20 μm. Afkortingen: CD31 = cluster van differentiatie 31; IHC = immunohistochemisch; Gm = gastrocnemius. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tarlov Score | 0 | Geen beweging |
| 1 | Nauwelijks waarneembare beweging, niet-gewichtdragend | |
| 2 | Frequente beweging, niet-gewichtdragend | |
| 3 | Ondersteunt gewicht, gedeeltelijk gewicht dragen | |
| 4 | Wandelingen met een licht tekort | |
| 5 | Normaal maar langzaam lopen | |
| 6 | Vol en snel lopen |
Tabel 1: Functionele scoring.
Aanvullende tabel S1: Samenvatting van 25 artikelen uit de huidige literatuur over de totstandkoming van het PAD-model. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie rapporteert een aangepaste, vereenvoudigde en chirurgisch efficiënte aanpak om een HLI-model vast te stellen in ApoE-/- muizen met behulp van dubbele ligatie in de proximale en distale regio's van de FA via een incisie van 3-4 mm zonder vereiste laboratoriumupgrades. Het belangrijkste kenmerk van deze methode is de kleinere omvang van de incisie in vergelijking met eerder gerapporteerde studies die HLI-modellen van muizenbeschrijven 8,9,10,11, 12,15,20,22,23,24 .
Historisch gezien is een incisie gemaakt van de knie naar de media strak, inguinaal of zelfs de buik voor een betere blootstelling, variërend van 0,5 tot 2 cm of meer9,11,15,19,22,25,26 (samengevat in aanvullende tabel S1). Dit artikel beschrijft een chirurgische techniek om DLFA te bereiken en als gevolg daarvan HLI, bij muizen met een incisie < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). De FA werd geligeerd voordat het zich vertakt in de popliteale slagader en de sapheneuze slagader, waardoor ischemie in verschillende spiergroepen in de achterpoot ontstond en resulteerde in matige stress bij muizen. Hoewel muizen functioneel herstelden opde 7e dag na de operatie (Tarlov-score dag vóór operatie 6 ± 0,1e dag na de operatie 3,9 ± 0,99 versus 7e dag na de operatie 5,2 ± 0,92), werd ischemische schade waargenomen in Gm op histologisch niveau. Ten eerste vertoonde Gm in het ischemische been myofibers onregelmatige ischemische necrose en werden geïnfiltreerd door multinucleaire macrofagen, vergelijkbaar met wat is gemeld bij PAD-patiënten27,28. Ondanks myofiberatrofie werden ook enkele geregenereerde myofiberen waargenomen, wat in lijn is met een eerder rapport29. Ten tweede was de microvasculaire dichtheid in de ischemische Gm op de7e dag na ligatie hoger dan in het niet-ischemische been, wat ook is gemeld door Ministro et al.30. De recente focus in PAD-therapie is niet alleen beperkt tot het verhogen van de microvasculaire dichtheid in vergelijking met de niet-ischemische kant, maar ook op het herstel van door ischemie geïnduceerd verlies van levensvatbaar spierweefsel, dat nieuwe vatvorming ondersteunt door een matrix van groeifactoren en biomechanische ondersteuning te bieden31. Dit model geeft dus ook een breed venster om de effectiviteit van nieuwe therapieën met deze foci te testen. Bovendien past het bereiken van HLI met kleinere incisie in het 3R-concept van dierproeven als een verfijning van de chirurgische procedure, d.w.z. de kleine huidincisiegrootte vermindert het trauma en de postoperatieve pijn.
Een ideaal diermodel biedt ook een relatief lang therapeutisch venster. Verschillende chirurgische procedures voor het vaststellen van ischemie bij muizen zijn gemeld en toegepast, en ze oefenen verschillende effecten uit op het herstel van de bloedstroom21. Voor inductie van HLI richten chirurgische methoden zich normaal gesproken op de iliacaleslagader 12,19,23,32,femoraleslagader 24,33,34en hun takken11,35,sommige inclusief de femorale ader en36,37. Aangezien het niveau van vasculaire ligatie geen effect heeft op het herstel van de bloedstroom, is de beslissende factor de mate van letsel in de vasculaire boom21. Voor een enkele ligatie van de femorale of iliacale slagader wordt een kleine incisie gemaakt in het inguinale of abdominale gebied, terwijl de andere takinteracties nog steeds worden gehandhaafd en het perfusieherstel in de achterste ledemaat van de muis volledig herstelt binnen 7 dagen21,38. Een enkele ligatie is dus niet voldoende om een geschikt therapeutisch venster te bieden om de effecten van verschillende behandelingen te testen. Als takken van de FA ook moeten worden geligeerd, moet de huidincisie nog groter worden gemaakt, wat de operatietijd verlengt. Daarom biedt HLI by DLFA in muis een geschikt therapeutisch venster waarin de door de therapie geïnduceerde verbeteringen efficiënt kunnen worden bewaakt9,21,22,25.
Het vaststellen van een klinisch relevant HLI-diermodel is belangrijk om de efficiëntie van nieuwe therapeutische benaderingen te testen, d.w.z. cel-, stamcel- of gentherapie voor PAD2,3,4. Verschillende PAD-modellen zijn ontwikkeld bij muizen15,21,ratten39en konijnen40,41. Del Giudice en collega's hebben een konijnen hindlimb ischemie model gemaakt door percutane, transauriculaire, distale foetale slagader embolisatie met gekalibreerde deeltjes die enkele van de beperkingen van bestaande diermodellen kunnen overwinnen40. Liddell et al.41 creëerden ook een konijnenPAD-model door de oppervlakkige FA op te rollen via een endovasculaire benadering, wat resulteerde in verminderde reperfusie van de achterpoten. Hoewel grotere dieren, zoals konijnen, overtuigender resultaten kunnen opleveren40,41, waardoor de therapieën een stap dichter bij klinische toepassing komen, vereisen ze echter hogere kosten en tijd om resultaten te verkrijgen.
Ondanks het heterogene risicoprofiel van de meeste patiënten met PAD, inclusief erfelijke en gedragsfactoren42, ApoE- vertonen muizen abnormaal vetmetabolisme en hyperlipidemiesymptomen, zoals totaal cholesterol, triglyceriden, lipoproteïne met zeer lage dichtheid en lipoproteïne met gemiddelde dichtheid, waarbij enkele van de belangrijkste kenmerken worden gerepliceerd die zijn waargenomen bij patiënten met PAD. Bovendien nemen deze indicatoren met het vetrijke dieet aanzienlijk toe. Lo Sasso et al. meldden dat bij deze muizen arteriële vetophoping optreedt op de leeftijd van 3 maanden43, en dat een toename van AS-laesies optreedt met het vorderen van de leeftijd van43. ApoE-/- muizen zijn dus bijzonder geschikt voor het acute-op-chronische ischemie-PAD-model omdat ze de hypercholesterolemie die vaak aanwezig is bij patiënten met PAD samenvatten en een geschikt platform bieden om verschillende therapieën te evalueren die gericht zijn op het bevorderen van neovascularisatie van ischemische ledematen. Bovendien is de prijs-prestatieverhouding van het testen van nieuwe therapieën met ApoE-/- muizen onverslaanbaar.
Ondanks de voordelen die in de bovenstaande paragrafen worden genoemd, zijn er twee beperkingen aan dit model. Ten eerste vereist het beheersen van deze methode dat de experimentator voldoende microchirurgische ervaring en bekendheid heeft met de anatomie van de achterpoot van de muis. Ten tweede verhogen de beperkte chirurgische blootstelling en de hoeveelheid onderhuids vetweefsel in de achterpoot van ApoE- / - muizen de chirurgische moeilijkheidsgraad. Daarom is enige gerelateerde praktijk vereist voor een succesvolle implementatie van deze techniek. Concluderend rapporteert deze studie een aangepaste en eenvoudig te implementeren, chirurgisch efficiënte aanpak voor het opzetten van een HLI-model in ApoE- / - muizen met behulp van een kleine incisie. De kleine incisie vermindert het trauma aan het dier aanzienlijk en kan door de meeste onderzoeksgroepen worden toegepast zonder laboratoriumupgrades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat de inhoud van het artikel is samengesteld bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Auteurs bedanken Viktoria Skude, Alexander Schlund en Felix Hörner voor de uitstekende technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
