Summary
מאמר זה מדגים גישה כירורגית יעילה ליצירת איסכמיה חריפה בעכברים עם חתך קטן. גישה זו יכולה להיות מיושמת על ידי רוב קבוצות המחקר ללא כל שדרוגי מעבדה.
Abstract
מטרת מחקר זה היא להציג ולהעריך גישה כירורגית שונה כדי לגרום איסכמיה חריפה בעכברים שניתן ליישם ברוב מעבדות בעלי החיים. בניגוד לגישה הקונבנציונלית לקשירה כפולה של עורק הירך (DLFA), נעשה חנק קטן יותר באזור המ מפשעתי הימני כדי לחשוף את עורק הירך הפרוקסימלי (FA) לביצוע DLFA. לאחר מכן, באמצעות תימה 7-0, החתירה נגררה לאזור הברך כדי לחשוף את FA הדיסטלי. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) על גפיים אחוריות דו-צדדיות שימשה לזיהוי חסימה FA לאחר הניתוח. ב 0, 1, 3, 5, ו 7 ימים לאחר הניתוח, התאוששות תפקודית של הגפיים האחוריות הוערך חזותית ודורג באמצעות סולם Tarlov. הערכה היסטולוגית בוצעה לאחר המתת חסד של בעלי החיים 7 ימים לאחר DLFA. ההליכים בוצעו בהצלחה ברגל ימין בעשרה עכברים ApoE-/-, ואף עכבר לא מת במהלך התצפית שלאחר מכן. גדלי החתירה בכל 10 העכברים היו פחות מ 5 מ"מ (4.2 ± 0.63 מ"מ). תוצאות ה-MRI הראו כי זרימת הדם של FA בצד האיסכמי נחסמה בבירור. תוצאות סולם Tarlov הראו כי תפקוד הגפיים האחוריות ירד באופן משמעותי לאחר ההליך ולאט לאט התאושש במהלך 7 הימים הבאים. הערכה היסטולוגית הראתה תגובה דלקתית משמעותית בצד האיסכמי וצפיפות מיקרו וסקולרית מופחתת בגפה האחורית האיסכמית. לסיכום, מחקר זה מציג טכניקה שונה באמצעות פירוק מיניאטורי כדי לבצע איסכמיה איבר אחורי (HLI) באמצעות DLFA.
Introduction
יש צורך ללא מענה במודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים למחקר במחלות כלי דם כגון מחלת עורקים היקפיים (PAD). למרות ההתפתחויות המתקדמות באבחון ובטיפול, היו יותר מ -200 מיליון חולים עם PAD בשנת2018 1, ומספרם גדל כל הזמן. למרות כמה גישות טיפוליות חדשניות2,3,4,5,6,7 תוארו, תרגום מוצלח של שיטות טיפוליות אלה ליישום קליני נשאר משימה מרתיעה. לכן, מודלים ניסיוניים אמינים ורלוונטיים ב- vivo המדמים את מצב המחלה האנושית נדרשים לחקור את המנגנון הפוטנציאלי והיעילות של גישות טיפוליות חדשות אלה לטיפול PAD6,7.
היפרליפידמיה וטרשת עורקים (AS) הם גורמי הסיכון העיקריים להתפתחות PAD. ApoE-/- עכברים (על דיאטה עתירת שומן) להציג חילוף חומרים שומן חריג היפרליפידמיה ולאחר מכן לפתח לוחותthertherosclerotic עיבוד ApoE-/- עכברים כבחירה הטובה ביותר לדמות PAD רלוונטי קלינית. מודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים HLI נוצרים באמצעות קשירה כפולה של עורק הירך (DLFA), שהיא הגישה הנפוצה ביותר במעבדות בכל רחבי העולם8,9,10,11,12,13,14,15 כדי לדמות איסכמיה חריפה על כרונית. עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל נתק גדול ו פולשני יחסית. יתר על כן, זה מוביל בהכרח לבעלי החיים (במיוחד עכברים) הסובלים מפגיעה מוגברת בכאב ודלקת, אשר משפיע גם על התוצאות הניסיוניות הבאות5,6,16,17. מאמר זה מתאר מודל HLI חריף על כרוני ב- APOE-/- עכברים באמצעות חבטה קטנה מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל ההליכים הניסיוניים בוצעו על פי הנחיה EC EC 2010/63/EU ואושרו על ידי החקיקה הגרמנית המקומית (35-9185.81/G[1]239/18). עשרה עכברים זכרים ApoE-/- עם רקע C57BL /6J, במשקל 29.6-38.0 גרם, שוכנו על מחזור בהיר /כהה 12 שעות והאכילו דיאטה מערבית (1.25% כולסטרול ו -21% שומן) ומים ad libitum במשך 12 שבועות מגיל 8 שבועות. HLI בוצע על עכברים בני 20 שבועות כמתואר להלן.
1. אינדוקציה של HLI ב- ApoE-/- עכברים
- הכן את הציוד והכלים הנדרשים לניתוח (ראו טבלת החומרים ואיור 1). לחטא את המכשירים הכירורגיים באמצעות autoclaving לפני השימוש ולהשתמש מחטא חרוזים זכוכית במהלך הניתוח.
- מרדים את העכבר עם זריקה תת עורית (S.C.) של תערובת של מידזולם (5 מ"ג/ק"ג), מדטומידין (0.05 מ"ג/מיליליטר/ק"ג) ופנטניל (0.5 מ"ג/ק"ג) לפני כל ההליכים הכירורגיים.
- לאחר תחילת ההרדמה, השתמש במשחת הווטרינר על העיניים כדי למנוע יובש, ולאשר את היעדר רפלקס גמילה דוושה בגפה האחורית והקדימה.
- לאחר מכן מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה בכ 37 °C (50 °F). באמצעות צמר גפן וקרם להסרת שיער, יש להסיר בזהירות את השיער מעור הגפיים האחוריות בצד ימין.
הערה: קרם הסרת שיער צריך לשמש בכמות מספקת כדי לכסות את אחורי, במיוחד את האזור מפשעתי שבו החתיכה תיעשה. קרם הסרת שיער צריך לשמש למשך של פחות מ 3 דקות ויש להסיר לאחר מכן עם צמר גפן לח 2 עד 3 פעמים. - הנח את העכבר בתנוחת העל-סמך על משטח החימום מתחת למיקרוסקופ ניתח. השתמש בחומר חיטוי לעור (ראה טבלת החומרים) כדי לחטא את עור העכבר. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מחודדים ומספריים כירורגיות כדי לבצע חתך של כ -3-4 מ"מ באמצע אזור המ מפשעה. ראה איור 2 לקבלת שרטוט של ההליך.
- הסר את רקמת השומן התת עורית בזהירות בעזרת מלקחיים מחודדים עדינים כדי לחשוף את חבילת הנוירווסקולריות של הירך הפרוקסימלית. יש להשתמש בזהירות במלקחיים המחודזרים העדינות כדי לנקב את הממברנה של נדן הירך. השתמש ספוגית כותנה לחה עם מלוחים כדי להזיז את עורק הירך (FA) בזהירות הרחק עצב הירך (FN) וריד הירך (FV).
- להעביר שני תפרים נספגים 7-0 דרך FA הפרוקסימלי, ולעשות קשרים כפולים באמצעות מספריים קפיציים כדי להעביר את FA בין שני הקשרים.
- כדי לחשוף את FA דיסטלי, להעביר תפר 7-0 נספג דרך הקצה התחתון של החתירה ולגרור בעדינות את החתירה לאזור של הצד הימני של הברך של הגפה האחורית.
- הזז את הרקמה התת עורית הצידה בזהירות כדי לחשוף את חבילת הנוירווסקולריים. השתמש במלקחיים מחודדים עדינים כדי לנקב את הממברנה של נדן הירך, ולנתח את FA מן FV ו- FN.
- העבירו שני תפרים נספגים 7-0 דרך ה-FA הדיסטלי, ובצעו קשרים כפולים. השתמש במספריים קפיציות כדי להעביר את FA בין שני הקשרים.
הערה: לא בוצע קשירה על הגפה השמאלית, אשר שימשה כשליטה בכל עכבר. - לאחר מכן, יש להשתמש בתפרים נספגים 6-0 כדי לתפור את החבטה. הנח את העכבר על כרית חימום בכלוב נקי והמשיך לעקוב אחר הפרמטרים החיוניים שלו עד להתאוששות. לספק משקולת כבידה לאחר הניתוח: Buprenorphine s.c. (0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף כל 8 שעות במשך 48 שעות). 48 שעות לאחר הניתוח, לנהל metamizole במי שתייה (24 מ"ג / 5mL של מים מתאים למנה של 200 מ"ג / קילוגרם 4 פעמים ביום).
2. הדמיית תהודה מגנטית
הערה: יום אחד לאחר DLFA, העכברים חייבים לעבור סריקות MRI כדי להעריך את חסימת FA.
- מקם את העכבר בתא אינדוקציה שקוף, והכנס את העכבר עם איזופלוראן של 1.5-2% באוויר הסביבה עד לאובדן רפלקס ההתקן.
- הניחו את העכבר על מיטת בעלי חיים מחוממת המצוידת במחזיק נשיכה ומוצבת לכיוון המגנט עם מערכת הנשלטת בלייזר. לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37±1 °C (50 °F).
- במהלך רכישת התמונה, לשמור על הרדמה עם 1.5-2% איזופלוראן באוויר הסביבה, ולנטר את הנשימה באמצעות בדיקה לחץ.
- השג תמונות בכיוון הפרוסה הרוחבי באמצעות רצף אנגיוגרפיה תלת-ממדי (3D) של טיסה (TOF) עם זמן הד פרמטר (TE)/time חזרה (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, ארבעה ממוצעים, מטריצת רכישה של 178 x 144 משוחזרת ל- 256 x 192 ו- 121 פרוסות, וכתוצאה מכך רזולוציה איזוטרופית של 0.15 מ"מ3. כדי לדכא את האות מן הוורידים, מניחים פרוסת רוויה distally לגפיים האחוריות.
3. הערכה קלינית ומעקב
- הערכת ההתאוששות התפקודיתב- 1,3,5ו -7 ימים לאחר הניתוח באמצעות סולם טרלוב הניקוד התפקודי18,19 (לוח 1).
4. הערכה היסטולוגית
- שבעה ימים לאחר הניתוח, להחיל הזרקת pentobarbital (115 מ"ג/ קילוגרם) כדי להרדים את העכברים.
- לשוטט תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 1% paraformaldehyde (PFA) דרך חדר הלב השמאלי (100 מ"ל לעכבר). תקן את gastrocnemius הדו-צדדי (Gm) של העכברים ב 4% PFA לילה ב 4 °C (50 °F).
- הטמע את המדגם בפרפין על פי הפרוטוקול המתואר קודם לכן20.
- חותכים חלקים בעובי 4-5 מיקרומטר של בלוק הרקמה המוטבע בפרפין על מיקרוטום. בעזרת מברשת צבע עגולה, מניחים את מקטעי הרקמה החתוכים באמבט המים המתוחזקים ב-42°C.
- הכנס את שקופית המיקרוסקופ למים בזווית של 45°, ומיקם אותה בזהירות מתחת לקבוצת המקטעים שיש לאסוף.
- הרם בזהירות את המגלשה מהמים, ואפשר לחלקים להתחבר למגלשה ולייבש לילה באינקובטור הספסל בשעה 37 מעלות צלזיוס.
- בצע המטוקסילין / eosin (HE) כתמים של מקטעי פרפין.
- מקם את השקופיות המכילות את המקטעים במחזיקי שקופיות. הכן 3 מיכלים של קסילן טרי, ומניחים את השקופיות בכל מיכל במשך 5 דקות כדי deparaffinize את החלקים.
- Rehydrate את החלקים על ידי טבילת הפרוסות ברציפות ב 96%, 80%, 70%, 50%, 30% אתנול, ומים deionized במשך 5 דקות כל אחד.
- כתם בתמיסת המטוקסילין למשך 10 דקות.
- מעבירים את הפרוסות למיכל של מים מתויגים ושטפים על ידי הצבה מתחת למי ברז זורמים במשך 5 דקות.
- באמצעות מיקרוסקופ, לבדוק את עוצמת הכתמת המטוקסילין. אם הכתמים מאפשרים זיהוי ברור של גרעיני התא, המשך לשלב הבא. אם עוצמת הכתמים אינה מקלה על זיהוי גרעיני תאים או אם עוצמת הכתמים חלשה, מניחים את השקופית בתמיסת המטוקסילין למשך דקה אחת, חוזרים על הכביסה במים (שלב 4.4.4) ולאחר מכן בדקו שוב.
- tain בפתרון אאוזין-Y למשך 5 דקות.
- ייבשו את הסעיפים על ידי טבילת הפרוסות ברציפות במיכלים המכילים מים דה-יונים ו-30%, 50%, 70%, 80%, ו-96% אתנול ברציפות למשך 10 שניות כל אחת. לאחר מכן, מניחים את המקטעים ברצף בשלושה מיכלים של קסילן טרי עבור 10 s כל אחד.
- מקם את השקופיות אופקית במפות אחסון שקופיות מיקרוסקופיות כשהסעיפים פונים כלפי מעלה. הוסף מספיק אמצעי הרכבה בשקופית וטען את השקופיות עם כיסויים.
- בצע את הכתמת האימונוהיסטוכימית (IHC) של מקטעי הפרפין.
- חזור על דפרפיניזציה והידרציה שלבים 4.4.1-4.4.2. לאחר מכן, לטבול את החלקים במיכל עם 10 mM נתרן סיטראט חוצץ, pH 6, ולהביא את המדגם לרתיחה במיקרוגל.
הערה: כמו מעל או תת חימום של דגימות יכול לגרום כתמים לא עקביים, לשמור על הטמפרטורה ממש מתחת לנקודת הרתיחה במשך 10 דקות. - לאחר מכן, מצננים את החלקים על ספסל במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את החלקים PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות. ייבשו בזהירות את האזור סביב המדגם, וציירו עיגול גדול סביב המדגם באמצעות עט הידרופובי. .
הערה: לעולם אל תיגע במדגם. סימון בעט הידרופובי יוצר גבול הידרופובי, המאפשר שימוש בנפח קטן יותר של תמיסת נוגדנים. - פעילות פרוקסידאז אנדוגני להרוות על ידי הצבת הסעיף ב 0.3% H2O2 ב- PBS במשך 10 דקות. מקטעי בלוק עם 400 μL של חוצץ בלוק (PBS מכילים 3% אלבומין סרום בקר ו 0.3% של חומר ניקוי לא יוני) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
- לשטוף את החלקים PBS במשך 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 100-400 μL של נוגדן נגד CD31 מדולל (1:250) מספיק כדי לכסות את החלק. לאחר מכן, חלקים דגירה לילה ב 4 °C (5 °F) בתא לח.
הערה: ודא שהסעיף מכוסה לחלוטין בתמיסת הנוגדנים. - הסר את הנוגדן העיקרי, ולשטוף את החלקים שלוש פעמים PBS למשך 5 דקות כל אחד.
- מכינים את תערובת 3, 3'-דיאמינובנזידין (DAB) על ידי הוספת טיפה אחת של תרכיז DAB ל 1 מ"ל של דילול DAB, ומערבבים היטב. לאחר מכן, להוסיף 100-400 μL של תערובת DAB לחלקים, ולנטר מקרוב על ידי העין במשך 2 דקות עד עוצמת הכתמים מקובלת הוא ציין.
הערה: ודאו שהמקטע מכוסה לחלוטין בתערובת DAB. - לאחר מכן, יש לשטוף תחת מי ברז זורמים למשך 5 דקות. בצע כתמי המטוקסילין כמתואר בשלבים 4.4.3-4.4.5.
- בצע כתמי אאוזין-Y המתוארים בשלב 4.4.6. בצע את שלבי התייבשות המתוארים בשלב 4.4.7.
- רכוב על המקטעים עם כיסויים באמצעות אמצעי הרכבה. השתמש ב- ImageJ כדי להעריך את אחוז האזור החיובי CD31 (%) ב-5 שדות שנבחרו באקראי (40x) שניתן להתייחס אליו כצפיפות מיקרו-וסקולרית כפי שתואר בעבר21.
- חזור על דפרפיניזציה והידרציה שלבים 4.4.1-4.4.2. לאחר מכן, לטבול את החלקים במיכל עם 10 mM נתרן סיטראט חוצץ, pH 6, ולהביא את המדגם לרתיחה במיקרוגל.
5. ניתוח סטטיסטי
- השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטית כדי לבטא את התוצאות כממוצע ± סטיית התקן ולבצע t-testלא משולה על ההשוואות. שקול P < 0.05 להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאפיינים של ApoE-/- עכברים
ניתוחי DLFA בוצעו בהצלחה על 10 עכברים כדי להקים את מודל HLI, ואף אחד מהעכברים לא מת לאחר ההליך. כדי לעקוב אחר שינויים במשקל הגוף, עכברים נשקלו לפני הליך DLFA (Pre-DLFA) ו 7 ימים לאחר ניתוח DLFA (לאחר DLFA). משקלי Pre-DLFA נעו בין 29.6 ל-38.0 גרם (ממוצע 34.74 ± 2.47 גרם), ומשקולות שלאחר DLFA נעו בין 26.5 ל-34.1 גרם (ממוצע 30.77 ± 2.15 גרם), שהיו נמוכות משמעותית ממשקלות טרום-DLFA(P < 0.05, איור 3A). זמן הניתוח נע בין 15 ל -47 דקות (ממוצע 34.2 ± 8.82 דקות, לא כולל זמן ההרדמה). גודל ההחתכה ב-10 עכברים נע בין 3 ל-5 מ"מ (ממוצע 4.2 ± 0.63 מ"מ).
סריקת MRI ושחזור פונקציונלי
סריקות ה-MRI הצביעו בבירור על כך שהאזורים הפרוקסימליים והדיסטליים של ה-FA הימני לא הראו זלוף (איור 3C),המציין את הצלחתה של שיטה זו. יום אחד לאחר הניתוח, תוצאות סולם טרלוב ירדו באופן משמעותי (P < 0.05). למרות שהתוצאות עלו בהדרגה בימים שלאחר מכן, הן עדיין היו נמוכות מהקו הבסיסי עד היום השביעי (P < 0.05, איור 3B). מגמות אלה עולות בקנה אחד עם דוחות קודמים20. לא נצפו נמק או התפתחות רקמת נמק בצדדים הדו-צדדיים של הגפיים האחוריות של עכברים כלשהם. עם זאת, כפות הרגליים של הגפיים האחוריות האיסכמיות ב -7 עכברים לא הצליחו למתוח באופן טבעי בהשוואה לצד הנגדי. בנוסף, כפות הרגליים של הגפיים האחוריות האיסכמיות ב-4 עכברים הציגו שינוי צבע קל בהשוואה לצד הנגדי(איור 3D).
ניתוח היסתולוגי
ב- HE מכתים את שריר GM הימני, myofibers הפגינו נמק איסכמי לא סדיר. תאי לווין מתרבים החליפו את המיאופייברים הנמקיים והופצו במסה ו /או בפיזור לא סדיר. Myofibers הפגין חדירה דלקתית על ידי מקרופאגים רב-גרעיניים. מיופיברים באזורים הדלקתיים איבדו את המאפיינים המורפולוגיים הרגילים שלהם, והיו מעט מיופיברים מחודשים. חלקים רוחביים של מיופיברים מחודשים אלה היו עגולים, הציטופלסמה הייתה מוכתמת באדום, וגרעין קטן אחד או גרעינים מרובים היו ממוקמים במרכז. לעומת זאת, דפוס דלקתי מסוג זה לא נצפה ב-Gm השמאלי(איור 4). כתמי נוגדנים CD31 בוצעו כדי לזהות תאי אנדותל של הכלי בדגימות Gm, ו- ImageJ שימש להערכת האזור החיובי CD31 - תחליף לצפיפות מיקרו-וסקולרית - בכל אחד מחמישה שדות ראייה (40x) עבור כל דגימה. הגפיים האחוריות האיסכמיות הציגו צפיפות מיקרו-וסקולרית גבוהה משמעותית מהצד הלא איסכמי(P < 0.05, איור 5).
איור 1: ציוד וכלים הנדרשים לניסוי. (א)ניתוח מיקרוסקופים ורפידת חימום הנדרשים לניתוח. (B)כלים כירורגיים: 1. 7-0 ו 6-0 תפרים נספגים, 2. מחזיק מחט, 3. מלקחיים חסרי שיניים, 4. מספריים קפיציים, 5. מלקחיים מחודדים עדינים, 6. מלקחיים מחודדים, ו -7. מספריים כירורגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור סכמטי של ההליך. (A ו- D) נעשה חתך קטן באזור המשרתה כדי לחשוף את הירך הפרוקסימלית A, אשר קשור. (B ו- E)תיל 6-0 משמש כדי לגרור את החתירה לאזור הברך כדי לחשוף את הירך הדיסטלי A, אשר קשור. (C, Fו- G) תפירת החבטה. קיצורים: הירך A = עורק הירך; הירך N = עצב הירך; הירך החמישי = וריד הירך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מאפייני דגם העכבר PAD. (A)השוואת משקל הגוף לפני ו- 7 ימים לאחר DLFA. (B)התאוששות תפקודית המוערכת על ידי סולם טרלוב. (C)אנגיוגרפיה תהודה מגנטית מציינת את FA פרוקסימלי ודיסטלי בגפה האחורית השמאלית (חץ לבן), ובצד ימין, FA הפרוקסימלי והדיסטלי נעלם. (ד)שינויים במראה הגפה האחורית הדו-צדדית של עכברים מס ' 2 ו - No. 4, 1 ו - 7 ימים לאחר DLFA. הערכים המוצגים הם סטיית תקן ממוצעת ±. *P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001, **** P < 0.00001; t-test לא מנופה. קיצורים: PAD = מחלת עורקים היקפיים; DLFA = קשירה כפולה של עורק הירך; FA = עורק הירך; L = שמאל; R = ימינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הוא מכתים את שריר הגסטרוקנמיוס. (A)תמונה בהגדלה נמוכה מראה שהוא מכתים את ה- GM הימני 7 ימים לאחר הליך DLFA. דלקת נצפתה Gm הימני. (B) ב GM הימני, myofibers נמק הפגין חדירה דלקתית על ידי מקרופאגים (חץ לבן). סיבי השריר מאבדים את המאפיינים המורפולוגיים הרגילים שלהם. היו מעט מאוד myofibers מחודש (חץ שחור). (ג)הוא מכתים מיופיברים רגילים של Gm הימני (D)שריר ה- GM הנגדי / השמאלי (לא איסכמי) מראה דפוס היסטולוגי נורמלי. סרגלי קנה מידה: A = 200 מיקרומטר, B-D = 50 מיקרומטר. קיצורים: HE = המטוקסילין-אאוזין; DLFA = קשירה כפולה של עורק הירך; Gm = גסטרוקנמיוס; L = שמאל; ר= נכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואה בין צפיפות כלי הדם של שריר הגסטרוקנמיוס הדו-צדדי. (A)מכתים CD31-IHC של מקטע Gm הימני (חצים שחורים). (B)מכתים CD31-IHC של מקטע Gm שמאלי (חצים שחורים). (C)כימות צפיפות כלי הדם של הצד הימני, שהיה הרבה פחות מזה בצד שמאל. הערכים המוצגים הם סטיית תקן ממוצעת ±. P < 0.00001; t-test לא מנופה. מוטות קנה מידה: A, B = 20 מיקרומטר. קיצורים: CD31 = אשכול של בידול 31; IHC = אימונוהיסטוכימי; Gm = גסטרוקנמיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ציון טרלוב | 0 | אין תנועה |
| 1 | תנועה בקושי מורגשת, נושאת לא משקל | |
| 2 | תנועה תכופה, נושאת שאינה במשקל | |
| 3 | תומך במשקל, מיסבים חלקיים במשקל | |
| 4 | הולך עם גירעון קל | |
| 5 | הליכה רגילה אך איטית | |
| 6 | הליכה מלאה ומהירה |
טבלה 1: ניקוד פונקציונלי.
טבלה משלימה S1: סיכום של 25 מאמרים מהספרות הנוכחית על הקמת מודל PAD. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מדווח על גישה שונה, פשוטה ויעילה בניתוח כדי להקים מודל HLI ב- ApoE-/- עכברים באמצעות קשירה כפולה באזורים הפרוקסימליים והדיסטליים של ה- FA באמצעות חתך של 3-4 מ"מ ללא כל שדרוגי מעבדה נדרשים. המאפיין העיקרי של שיטה זו הוא הגודל הקטן יותר של ההסתה בהשוואה למחקרים שדווחו בעבר המתארים מודלים HLI עכבר8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .
מבחינה היסטורית, נעשה זעזוע מהברך לתקשורת הדוקה, מפשעתית, או אפילו הבטן לחשיפה טובה יותר, הנעה בין 0.5 ל -2 ס"מ או יותר9,11,15,19,22,25,26 (מסוכם בטבלה משלימה S1). מאמר זה מתאר טכניקה כירורגית להשגת DLFA וכתוצאה מכך, HLI, בעכברים עם חתך < 5 מ"מ (4.2 ± 0.63 מ"מ). ה- FA נקשר לפני שהוא מסתעף לעורק הפופליטים ול בעורק הסאפנוס, מה שגרם לאיסכמיה במספר קבוצות שרירים בגפיים האחוריות וכתוצאה מכך מתח מתון בעכברים. למרות עכברים התאוששו מבחינה תפקודית על ידי7 יום לאחר הניתוח (ציון Tarlov יום לפני המבצע 6 ± 0, 1יום לאחר הניתוח 3.9 ± 0.99 לעומת7 יום לאחר הניתוח 5.2 ± 0.92), נזק איסכמי נצפה ב- GM ברמה ההסטולוגית. ראשית, Gm ברגל האיסכמית myofibers הפגינו נמק איסכמי לא סדיר והסתננו על ידי מקרופאגים רב-גרעיניים, בדומה למה שדווח בחולי PAD27,28. למרות ניוון myofiber, כמה myofibers מחודש נצפו גם, אשר עולה בקנה אחד עם דו"ח קודם29. שנית, צפיפות המיקרו-וסקולרי ב- Gm האיסכמי ביוםהשביעי לאחר הקשירה הייתה גבוהה יותר מאשר ברגל הלא איסכמית, אשר דווחה גם על ידי Ministro et al.30. ההתמקדות האחרונה בטיפול PAD אינה מוגבלת רק כדי להגדיל את צפיפות המיקרו-וסקולרי בהשוואה לצד הלא איסכמי, אלא גם על שיקום אובדן איסכמיה של רקמת שריר בת קיימא, התומכת בהיווצרות כלי שיט חדשים על ידי מתן מטריצה של גורמי גדילה ותמיכה ביומכנית31. לכן, מודל זה גם נותן חלון רחב כדי לבדוק את האפקטיביות של טיפולים חדשים עם מוקדים אלה. יתר על כן, השגת HLI עם חתך קטן יותר מתאימה לתפיסת 3R של ניסויים בבעלי חיים ועידון של ההליך הכירורגי, כלומר, גודל החתך הקטן של העור מקטין את הטראומה והכאב לאחר הניתוח.
מודל בעלי חיים אידיאלי מספק גם חלון טיפולי ארוך יחסית. הליכים כירורגיים שונים להקמת איסכמיה בעכברים דווחו ויושמה, והם מפעילים השפעות שונות על שיקום זרימת הדם21. עבור אינדוקציה של HLI, שיטות כירורגיות בדרך כלל להתמקד בעורק הכסל12,19,23,32,עורק הירך24,33,34, וענפיהם11,35, חלקם כולל וריד הירך, כמו גם36,37. כמו רמת קשירת כלי הדם אין השפעה על שיקום זרימת הדם, הגורם המכריע הוא היקף הפגיעה בעץ כלי הדם21. עבור קשירה אחת של עורק הירך או הכסל, חתיכה קטנה נעשית באזור מפשעתי או הבטן, בעוד אינטראקציות הענף האחרות עדיין נשמרות, ואת שחזור זלוף בגפה האחורית של העכבר מתאושש לחלוטין בתוך 7 ימים21,38. לכן, קשירה אחת אינה מספיקה מבחינת מתן חלון טיפולי מתאים כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים שונים. אם גם יש צורך קשירה של ענפים מה-FA, יש נעשה חתך עור גדול עוד יותר, מה שמאריך את זמן הניתוח. לכן, HLI על ידי DLFA בעכבר מציע חלון טיפולי מתאים שבו השיפורים הנגרמים על ידי טיפול ניתן לפקח ביעילות9,21,22,25.
הקמת מודל בעלי חיים HLI רלוונטי מבחינה קלינית חשובה כדי לבדוק את היעילות של גישות טיפוליות חדשניות, כלומר, תאים, תאי גזע, או טיפול גנטי עבור PAD2,3,4. מספר דגמי PAD פותחו בעכברים15,21,חולדות39,וארנבות40,41. דל ג'ודיצה ועמיתיו הקימו מודל איסכמיה של ארנבת אחורית שנוצר על ידי תסחיף עורק הירך הלוהבי, הטרנסאוריקולרי, הדיסטלי עם חלקיקים מכוילים שעשויים להתגבר על חלק מהמגבלות של מודלים בעלי חיים קיימים40. לידל ואח '41 גם יצר מודל PAD ארנב על ידי סליל FA שטחי באמצעות גישה אנדווסקולרית, וכתוצאה מכך reperfusion גפיים אחוריות מופחתות. למרות בעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות, עשויים להניב תוצאות משכנעות יותר40,41, לוקח את טיפולים צעד קרוב יותר ליישום קליני, עם זאת הם דורשים עלות מוגברת וזמן כדי להשיג תוצאות.
למרות פרופיל הסיכון ההטרוגני של רוב החולים עם PAD, כולל גורמים תורשתיים והתנהגותיים42, ApoE-/- עכברים להפגין חילוף חומרים חריג שומן היפרליפידמיה, כגון כולסטרול הכולל, טריגליצרידים, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד, ליפופרוטאין בצפיפות בינונית, שכפול חלק מהמאפיינים העיקריים שנצפו בחולים עם PAD. יתר על כן, עם דיאטה עתירת שומן, אינדיקטורים אלה להגדיל באופן משמעותי. Lo Sasso ואח ' דיווח כי בעכברים אלה, הצטברות שומן עורקים מתרחשת בגיל 3 חודשים של גיל43, וכי עלייה בנגעות AS מתרחשת עם גיל מתקדם43. לכן, עכברי ApoE-/- מתאימים במיוחד למודל איסכמיה-PAD אקוטי-על-כרוני מכיוון שהם מסכמים מחדש את ההיפרכולסטרולמיה הנפוצה בחולים עם PAD ומספקים פלטפורמה מתאימה להערכת טיפולים שונים המיועדים לקידום ניאו-וסקולריזציה של גפיים איסכמיות. יתר על כן, יחס המחיר-ביצועים של בדיקת ניתוחים חדשניים עם עכברים ApoE-/- הוא בלתי מנוצח.
למרות היתרונות המוזכרים בסעיפים לעיל, קיימות שתי מגבלות למודל זה. ראשית, שליטה בשיטה זו דורשת מהנסיין ניסיון מיקרו-כירורגי מספיק והיכרות עם האנטומיה של הגפה האחורית של העכבר. שנית, החשיפה הכירורגית המוגבלת וכמות רקמת השומן התת עורית בגפה האחורית של ApoE-/- עכברים מגבירים את הקושי הכירורגי. לכן, פרקטיקה קשורה מסוימת נדרשת ליישום מוצלח של טכניקה זו. לסיכום, מחקר זה מדווח על גישה מותאמת וקלה ליישום, יעילה כירורגית להקמת מודל HLI ב- ApoE-/- עכברים באמצעות חתך קטן. החתכים הקטנים מפחיתים באופן משמעותי את הטראומה לחיה ויכולים להיות מיושמים על ידי רוב קבוצות המחקר ללא כל שדרוגי מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי תוכן המאמר חובר בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
Acknowledgments
המחברים מודים לויקוריה סקודה, אלכסנדר שלונד ופליקס הרנר על התמיכה הטכנית המצוינת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
