Summary
यह लेख एक छोटे चीरे के साथ चूहों में तीव्र इस्केमिया स्थापित करने के लिए एक कुशल शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण को दर्शाता है। इस दृष्टिकोण को किसी भी प्रयोगशाला उन्नयन के बिना अधिकांश अनुसंधान समूहों द्वारा लागू किया जा सकता है।
Abstract
इस अध्ययन का उद्देश्य चूहों में तीव्र इस्केमिया को प्रेरित करने के लिए एक संशोधित शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण को लागू करना और मूल्यांकन करना है जिसे अधिकांश पशु प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है। फेमोरल धमनी (डीएलएफए) के दोहरे बंधन के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण के विपरीत, डीएलएफए करने के लिए समीपस्थ फेमोरल धमनी (एफए) को बेनकाब करने के लिए सही इंजीनियङ्क्षरग क्षेत्र पर एक छोटा चीरा बनाया गया था। फिर, एक 7-0 सीवन का उपयोग कर, चीरा घुटने क्षेत्र के लिए घसीटा गया था डिस्टल एफए का पर्दाफाश करने के लिए । द्विपक्षीय हिंद अंगों पर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) सर्जरी के बाद एफए occlusion का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सर्जरी के 0, 1, 3, 5 और 7 दिनों में, हिंद अंगों की कार्यात्मक वसूली का नेत्रहीन मूल्यांकन किया गया था और टारलोव पैमाने का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया था। डीएलएफए के 7 दिन बाद जानवरों को इच्छामृत्यु देने के बाद हिस्टोलॉजिक मूल्यांकन किया गया था। प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक दस ApoE में दाहिने पैर पर प्रदर्शन कियागया-/चूहों, और कोई चूहों बाद में अवलोकन के दौरान मर गया । सभी 10 चूहों में चीरा आकार 5 मिमी (4.2 ± 0.63 मिमी) से कम थे। एमआरआई परिणामों से पता चला है कि इस्कीमिक पक्ष में एफए रक्त प्रवाह स्पष्ट रूप से अवरुद्ध था । टारलोव स्केल के परिणामों ने दिखा दिया कि प्रक्रिया के बाद हिंद अंग समारोह में काफी कमी आई और धीरे-धीरे अगले 7 दिनों में बरामद हुआ। हिस्टोलॉजिक मूल्यांकन ने इस्कीमिक पक्ष पर एक महत्वपूर्ण भड़काऊ प्रतिक्रिया दिखाई और इस्कीमिक हिंद अंग में माइक्रोवैस्कुलर घनत्व कम कर दिया। अंत में, यह अध्ययन डीएलएफए का उपयोग करके हिंद अंग इस्केमिया (एचली) करने के लिए एक लघु चीरा का उपयोग करके एक संशोधित तकनीक का परिचय देता है।
Introduction
परिधीय धमनी रोग (पैड) जैसे संवहनी रोगों में अनुसंधान के लिए प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल की अपूर्ण आवश्यकता है। निदान और उपचार में उन्नत विकास के बावजूद, 20181में पैड के साथ 200 मिलियन से अधिक रोगी थे, और उनकी संख्या लगातार बढ़ रही है। यद्यपि कई उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण2,3,4,5,6, 7 का वर्णन किया गया है, लेकिन नैदानिक अनुप्रयोग में इन चिकित्सीय तौर-तरीकों का सफल अनुवाद एक चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है। इसलिए , मानव रोग की स्थिति का अनुकरण करने वाले वीवो प्रयोगात्मक मॉडलों में विश्वसनीय और प्रासंगिक होना आवश्यक है ताकि पैड6,7के इलाज के लिए इन नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों के संभावित तंत्र और दक्षता की जांच की जा सके ।
हाइपरलिपिडेमिया और एथेरोस्क्लेरोसिस (एएस) पैड के विकास के लिए मुख्य जोखिम कारक हैं। ApoE-/-चूहों (एक उच्च वसा आहार पर) असामान्य वसा चयापचय और हाइपरलिपिडेमिया प्रदर्शित करते हैं और बाद में चिकित्सकीय प्रासंगिक पैड अनुकरण करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प के रूप में ApoE-/-चूहों प्रतिपादन atherosclerotic सजीले टुकड़े विकसित करते हैं । प्रीक्लिनिकल एचली पशु मॉडल फेमोरल धमनी (डीएलएफए) के दोहरे बंधन के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, जो दुनिया भर की प्रयोगशालाओं में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है8,9,10,11,12,13,14, 15 तीव्र-ऑन-क्रॉनिक इस्केमिया का अनुकरण करने के लिए। हालांकि, इस दृष्टिकोण को आमतौर पर अपेक्षाकृत बड़े और आक्रामक चीरा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह अनिवार्य रूप से जानवरों (विशेष रूप से चूहों) को दर्द की चोट और सूजन से पीड़ित करता है, जो बाद के प्रयोगात्मक परिणामों को भी प्रभावित करता है5,6,16,17। यह कागज एक बहुत छोटे चीरा का उपयोग करके APOE में एक तीव्र पर पुरानी HLI मॉडल का वर्णन करताहै-/चूहों ।
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Protocol
नोट: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं चुनाव आयोग दिशानिर्देश चुनाव आयोग 2010/63/यूरोपीय संघ के अनुसार प्रदर्शन किया गया और स्थानीय जर्मन कानून (35-9185.81/G[1] 239/18) द्वारा अनुमोदित किया गया है । C57BL/6J पृष्ठभूमि के साथ दस पुरुष ApoE-/-चूहों, 29.6-38.0 ग्राम वजनी, एक 12 घंटे प्रकाश पर रखे गए थे/ HLI 20 सप्ताह पुराने चूहों पर प्रदर्शन के रूप में नीचे वर्णित किया गया था ।
1. ApoE में एचली का शामिल करना-/-चूहों
- सर्जरी के लिए आवश्यक उपकरण और उपकरण तैयार करें (सामग्री और चित्रा 1की तालिका देखें)। उपयोग से पहले ऑटोक्लेविंग के माध्यम से सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें और ऑपरेशन के दौरान ग्लास मनका स्टरलाइजर का उपयोग करें।
- सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं से पहले मिदाजोलम (5 मिलीग्राम/किलो), मेडेटोमीडीन (०.०५ मिलीग्राम/मिलीग्राम/किलो), और फेन्टनाइल (०.५ मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन (एस.C) के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें ।
- संज्ञाहरण की शुरुआत के बाद, सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें, और अग्रअंग और हिंद अंग में पेडल निकासी पलटा की अनुपस्थिति की पुष्टि करें।
- बाद में माउस को एक हीटिंग पैड पर रखें ताकि कोर शरीर का तापमान लगभग 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सके। कॉटन स्वैब्स और हेयर रिमूवल क्रीम का इस्तेमाल करते हुए ध्यान से दाईं ओर हिंद अंग की त्वचा से बालों को हटा दें।
नोट: हेयर रिमूवल क्रीम का उपयोग हिंडलिब को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में किया जाना चाहिए, विशेष रूप से इंगिनल क्षेत्र जहां चीरा लगाया जाएगा। बालों को हटाने क्रीम का उपयोग 3 मिनट से कम अवधि के लिए किया जाना चाहिए और बाद में 2 से 3 बार गीले कपास झाड़ू के साथ हटा दिया जाना चाहिए। - एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे हीटिंग पैड पर रीढ़ की स्थिति में माउस रखना। माउस की त्वचा को कीटाणुरहित करने के लिए त्वचा एंटीसेप्टिक (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। बाद में, इंगिनल क्षेत्र के बीच में लगभग 3-4 मिमी चीरा बनाने के लिए नुकीले संदंश और सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। प्रक्रिया की एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 2 देखें।
- समीपस्थ फेमोरल न्यूरोवैस्कुलर बंडल को बेनकाब करने के लिए ठीक नुकीले संदंश की मदद से चमड़े के नीचे वसा ऊतक को ध्यान से निकालें। फीमोरल म्यान की झिल्ली को छेदने के लिए ठीक नुकीले संदंश का सावधानीपूर्वक उपयोग करें। एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें नमकीन के साथ नम करने के लिए नारी धमनी (एफए) ध्यान से फीमोरल तंत्रिका (एफए) और फीमोरल नस (FV) से दूर ले जाने के लिए ।
- समीपस्थ एफए के माध्यम से दो 7-0 अवशोषित टांके पास, और दो संबंधों के बीच एफए पार करने के लिए वसंत कैंची का उपयोग कर डबल समुद्री मील बनाते हैं ।
- डिस्टल एफए को बेनकाब करने के लिए, चीरा के निचले किनारे के माध्यम से 7-0 अवशोषित सीवन पास करें और धीरे-धीरे चीरा को हिंद अंग के घुटने के दाईं ओर के क्षेत्र में खींचें।
- न्यूरोवैस्कुलर बंडल को बेनकाब करने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतकों को ध्यान से ले जाएं। फेमोरल म्यान की झिल्ली को छेदने के लिए ठीक नुकीले संदंश का उपयोग करें, और एफए को एफवी और एफए से विच्छेदन करें।
- डिस्टल एफए के माध्यम से दो 7-0 अवशोषित टांके पास करें, और डबल नॉट बनाएं। दोनों संबंधों के बीच एफए को पार करने के लिए स्प्रिंग कैंची का उपयोग करें।
नोट: बाएं अंग पर कोई बंधन नहीं किया गया था, जो प्रत्येक माउस में नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। - बाद में, चीरा सिलाई करने के लिए 6-0 अवशोषित टांके का उपयोग करें। माउस को एक साफ पिंजरे में हीटिंग पैड पर रखें और वसूली तक इसके महत्वपूर्ण मापदंडों की निगरानी जारी रखें। पोस्टऑपरेटिव एनाल्जेसिक प्रदान करें: बुप्रेनोरफिन एस.c (0.1 मिलीग्राम/किलो शरीर का वजन हर 8 घंटे में 48 घंटे के लिए)। ऑपरेशन के बाद 48 घंटे, पीने के पानी में मेटामिजोल का प्रशासन करें (24 मिलीग्राम/5mL पानी की खुराक से मेल खाती है 4 बार दैनिक)।
2. चुंबकीय अनुलाता इमेजिंग
नोट: DLFA के बाद एक दिन, चूहों एफए रुकावट का आकलन करने के लिए एमआरआई स्कैन से गुजरना होगा ।
- माउस को एक पारदर्शी प्रेरण कक्ष में रखें, और राइटिंग पलटा के नुकसान तक परिवेशी हवा में 1.5-2% आइसोफ्लुन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें।
- माउस को काटने के धारक से लैस गर्म पशु बिस्तर पर रखें और लेजर-नियंत्रित प्रणाली के साथ चुंबक की ओर तैनात करें। शरीर का तापमान 37±1 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
- छवि अधिग्रहण के दौरान, परिवेशी हवा में 1.5-2% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें, और दबाव जांच का उपयोग करके श्वसन की निगरानी करें।
- पैरामीटर इको टाइम (टीई) /पुनरावृत्ति समय (टीआर) /फ्लिप एंगल (एफए) = 2 एमएस/12 एमएस/13 डिग्री के साथ उड़ान (टीओएफ) एंजियोग्राफी अनुक्रम के त्रि-आयामी (3 डी) समय का उपयोग करके ट्रांसवर्स स्लाइस ओरिएंटेशन में छवियां प्राप्त करें चार औसत, 178 x 144 के अधिग्रहण मैट्रिक्स को 256 x 192 और 121 स्लाइस तक खंगाला गया, जिसके परिणामस्वरूप 0.15 मिमी3का आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन हुआ। नसों से संकेत को दबाने के लिए, पिछले अंगों के लिए एक संतृप्ति टुकड़ा जगह है।
3. नैदानिक मूल्यांकन और अनुवर्ती
- कार्यात्मक स्कोरिंग टार्लोव स्केल 18, 19 (तालिका1)का उपयोग करके सर्जरीके1, 3, 5 वें और 7 दिनों में कार्यात्मक वसूली का अनुमानलगाएं।
4. हिस्टोलॉजिक मूल्यांकन
- सर्जरी के सात दिन बाद चूहों को इच्छामृत्यु देने के लिए पेंटोबार्बिटल इंजेक्शन (115 मिलीग्राम/किलो) लगाएं।
- परफयूज फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) जिसमें बाएं कार्डियक वेंट्रिकल (100 एमएल प्रति माउस) के माध्यम से 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) होता है। चूहों के द्विपक्षीय गैस्ट्रोकनेमियस (जीएम) को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पीएफए में ठीक करें।
- पहले वर्णित प्रोटोकॉल20के अनुसार पैराफिन में नमूना एम्बेड करें ।
- एक माइक्रोटॉम पर पैराफिन एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक के 4-5 माइक्रोन मोटी वर्गों को काटें। एक गोल पेंट ब्रश की मदद से, 42 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए पानी के स्नान में कट टिश्यू सेक्शन रखें।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड को 45 डिग्री कोण पर पानी में डालें, और इसे एकत्र किए जाने वाले वर्गों के समूह के नीचे सावधानीपूर्वक रखें।
- ध्यान से पानी से स्लाइड उठाएं, और अनुभागों को स्लाइड से संलग्न करने और बेंचटॉप इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सूखने की अनुमति दें।
- पैराफिन वर्गों के हेमेटॉक्सीलिन/ियोसिन (एचई) धुंधला प्रदर्शन करें।
- स्लाइड होल्डर्स में सेक्शन वाली स्लाइड्स... ताजा जाइलीन के 3 कंटेनर तैयार करें, और वर्गों को डिपैराफिनाइज करने के लिए प्रत्येक कंटेनर में स्लाइड 5 मिनट के लिए रखें।
- स्लाइस को क्रमिक रूप से 96%, 80%, 70%, 50%, 30% इथेनॉल और 5 मिनट प्रत्येक के लिए डिवोनाइज्ड पानी में डुबोकर वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें।
- 10 मिनट के लिए हेमेटॉक्सीलिन समाधान में दाग।
- स्लाइस को डिएकाइज्ड वॉटर के कंटेनर में ट्रांसफर करें और 5 मिनट के लिए रनिंग नल के पानी के नीचे रखकर कुल्ला करें ।
- माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, हेमेटॉक्सीलिन धुंधला की तीव्रता की जांच करें। यदि धुंधला कोशिका नाभिक की पहचान स्पष्ट रूप से सक्षम बनाता है, तो अगले चरण तक जारी रखें। यदि धुंधला तीव्रता कोशिका नाभिक की पहचान की सुविधा नहीं देती है या यदि धुंधला होने की तीव्रता बेहोश हो जाती है, तो स्लाइड को हेमटॉक्सीलिन समाधान में 1 मिनट के लिए रखें, पानी के साथ धोने को दोहराएं (चरण 4.4.4), और फिर फिर से जांच करें।
- 5 मिनट के लिए ियोसिन-वाई समाधान में काउंटरटाइन।
- स्लाइस को क्रमिक रूप से डिएकीकृत पानी और 30%, 50%, 70%, 80%, और 96% इथेनॉल वाले कंटेनरों में धीरे-धीरे 10 एस प्रत्येक अवधि के लिए धीरे-धीरे डीहाइड्रेट करें। इसके बाद, 10 एस प्रत्येक के लिए ताजा जाइलीन के तीन कंटेनरों में क्रमबद्ध रूप से वर्गों को रखें।
- आगे की ओर आ रहे अनुभागों के साथ सूक्ष्म स्लाइड भंडारण मानचित्रों पर क्षैतिज रूप से स्लाइड रखें। स्लाइड पर पर्याप्त बढ़ते माध्यम जोड़ें, और कवरस्लिप के साथ स्लाइड माउंट ।
- पैराफिन सेक्शन के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला प्रदर्शन करें।
- रिपीट डिपैराफिनाइजेशन और रिहाइड्रेशन स्टेप्स 4.4.1-4.4.2। फिर, 10 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर, पीएच 6 के साथ एक कंटेनर में वर्गों को विसर्जित करें, और नमूना को माइक्रोवेव में उबाल लें।
नोट: नमूनों के अधिक या कम हीटिंग के रूप में असंगत धुंधला पैदा कर सकता है, 10 मिनट के लिए उबलते बिंदु के ठीक नीचे तापमान बनाए रखें । - इसके बाद, 30 मिनट के लिए एक बेंचटॉप पर वर्गों को ठंडा करें। इसके बाद पीबीएस में सेक्शन को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं। ध्यान से नमूने के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं, और हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके नमूने के चारों ओर एक बड़ा चक्र बनाएं। .
नोट: नमूना कभी न छुएं। हाइड्रोफोबिक पेन के साथ मार्किंग एक हाइड्रोफोबिक सीमा बनाती है, जो एंटीबॉडी समाधान की एक छोटी मात्रा के उपयोग की सुविधा प्रदान करती है। - 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.3% एच2O2 में अनुभाग रखकर एंडोजेनस पेरोक्सिडेस गतिविधि को बुझाएं। ब्लॉक बफर के 400 माइक्रोन के साथ ब्लॉक अनुभाग (पीबीएस में एक आर्द्रीकृत कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और गैर-आयनिक डिटर्जेंट का 0.3% होता है) ।
- पीबीएस में वर्गों को 5 मिनट के लिए धोएं। इसके बाद, अनुभाग को कवर करने के लिए पतला एंटी-सीडी31 एंटीबॉडी (1:250) के 100-400 माइक्रोन जोड़ें। इसके बाद, एक आर्द्रीकृत कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट सेक्शन।
नोट: सुनिश्चित करें कि अनुभाग पूरी तरह से एंटीबॉडी समाधान से ढका हुआ है। - प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें, और प्रत्येक 5 मिनट की अवधि के लिए पीबीएस में तीन बार वर्गों को धोएं।
- डीएबी ध्यान की 1 बूंद को 1 एमएल में जोड़कर 3, 3'-डायामिनोबेंजिडीन (डीएबी) मिश्रण तैयार करें, और अच्छी तरह से मिलाएं। बाद में, वर्गों में डीएबी मिश्रण के 100-400 माइक्रोन जोड़ें, और एक स्वीकार्य धुंधला तीव्रता पाए जाने तक 2 मिनट के लिए आंखों से बारीकी से निगरानी करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि अनुभाग पूरी तरह से DAB मिश्रण के साथ कवर किया गया है। - बाद में, 5 मिनट के लिए चल रहे नल के पानी के नीचे कुल्ला । कदम 4.4.3-4.4.5 में वर्णित हेमेटॉक्सीलिन धुंधला प्रदर्शन करें।
- स्टेप 4.4.6 में वर्णित eosin-Y धुंधला प्रदर्शन करें। चरण 4.4.7 में वर्णित निर्जलीकरण चरणों को करें।
- बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवरस्लिप के साथ वर्गों पर चढ़कर। 5 बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों (40x) में सीडी 31 सकारात्मक क्षेत्र (%) के प्रतिशत का अनुमान लगाने के लिए ImageJ का उपयोग करें जिसे पहले वर्णित21के रूप में माइक्रोवैस्कुलर घनत्व माना जा सकता है।
- रिपीट डिपैराफिनाइजेशन और रिहाइड्रेशन स्टेप्स 4.4.1-4.4.2। फिर, 10 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर, पीएच 6 के साथ एक कंटेनर में वर्गों को विसर्जित करें, और नमूना को माइक्रोवेव में उबाल लें।
5. सांख्यिकीय विश्लेषण
- मानक विचलन के ± मतलब के रूप में परिणामों को व्यक्त करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और तुलना पर अकर्पित टी-परीक्षणकरें। 0.05 < पी पर विचार सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है।
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Representative Results
ApoE कीविशेषताएं-/-चूहों
DLFA सर्जरी सफलतापूर्वक 10 चूहों पर किया गया HLI मॉडल स्थापित करने के लिए, और चूहों में से कोई भी प्रक्रिया के बाद मर गया । शरीर के वजन में बदलाव का पालन करने के लिए चूहों को डीएलएफए प्रक्रिया (प्री-डीएलएफए) से पहले और डीएलएफए सर्जरी (पोस्ट-डीएलएफए) के 7 दिन बाद तौला गया था । प्री-डीएलएफए वजन 29.6 से 38.0 ग्राम तक (मतलब 34.74 ± 2.47 ग्राम), और पोस्ट-डीएलएफए वजन 26 से लेकर.5 से 34.1 ग्राम (मतलब 30.77 ± 2.15 ग्राम), जो प्री-डीएलएफए वजन(पी < 0.05, से काफी कम थे, चित्रा 3A)। सर्जरी के लिए समय 15 से ४७ मिनट (मतलब ३४.२ ± ८.८२ मिनट, संज्ञाहरण समय सहित नहीं) । 10 चूहों में चीरा आकार 3 से 5 मिमी (मतलब 4.2 ± 0.63 मिमी) से था।
एमआरआई स्कैन और कार्यात्मक वसूली
एमआरआई स्कैन बहुत स्पष्ट रूप से संकेत दिया है कि समीपस्थ और सही एफए के डिस्टल क्षेत्रों कोई पर्फ्यूजन(चित्रा 3C),इस विधि की सफलता का संकेत दिखाया । सर्जरी के एक दिन बाद, Tarlov स्केल परिणाम काफी कम हो गए(पी < ०.०५) । हालांकि परिणाम धीरे-धीरे अगले दिनों में वृद्धि हुई है, वे अभी भी 7 दिन(पी < ०.०५, चित्रा 3B)तक बेसलाइन से कम थे । ये रुझान पिछलीरिपोर्टों केअनुरूप हैं । किसी भी चूहों के पिछले अंगों के द्विपक्षीय पक्षों में कोई परिगलन या गैंगरीन ऊतक विकास नहीं देखा गया। हालांकि, 7 चूहों में इस्कीमिक हिंद अंगों के पंजे कॉन्ट्रालेटरल साइड की तुलना में स्वाभाविक रूप से खिंचाव करने में असमर्थ थे। इसके अलावा, 4 चूहों में इस्कीमिक हिंद अंगों के पंजे ने कॉन्ट्रालेटरल साइड(चित्रा 3 डी)की तुलना में मामूली मलिनकिरण का प्रदर्शन किया।
हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
सही जीएम मांसपेशी के वह धुंधला में, myofibers अनियमित इस्कीमिक परिगलन का प्रदर्शन किया । उपग्रह कोशिकाओं का प्रसार ने गल माइफबरों को बदल दिया था और उन्हें द्रव्यमान और/या अनियमित फैलाव के साथ वितरित किया गया था । मायोफिबर्स ने बहुनीय मैक्रोफेज द्वारा भड़काऊ घुसपैठ का प्रदर्शन किया । भड़काऊ क्षेत्रों में मायोफिबर्स ने अपनी सामान्य रूपात्मक विशेषताओं को खो दिया था, और कुछ पुनर्जीवित माइफबर थे। इन पुनर्जीवित माइफबररों के ट्रांसवर्स सेक्शन गोल थे, साइटोप्लाज्म लाल रंग का था, और केंद्र में एक छोटा नाभिक या कई नाभिक स्थित थे। इसके विपरीत, बाएं जीएम(चित्रा 4)में इस तरह का भड़काऊ पैटर्न नहीं देखा गया था। CD31 एंटीबॉडी धुंधला जीएम नमूनों में पोत के एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था, और ImageJ CD31-सकारात्मक क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था-माइक्रोवैस्कुलर घनत्व के लिए एक किराए-देखने के पांच क्षेत्रों में से प्रत्येक में (40x) प्रत्येक नमूने के लिए । इस्कीमिक हिंद अंगों ने गैर-इस्कीमिक पक्ष(पी < 0.05, चित्रा 5)की तुलना में काफी अधिक माइक्रोवैस्कुलर घनत्व का प्रदर्शन किया।
चित्र 1:प्रयोग के लिए आवश्यक उपकरण और उपकरण। (ए)सर्जरी के लिए आवश्यक माइक्रोस्कोप और हीटिंग पैड को विच्छेदन करना। (ख)सर्जिकल उपकरण: 1. 7-0 और 6-0 अवशोषित टांके, 2. सुई धारक, 3. दंतहीन संदंश, 4. वसंत कैंची, 5. ठीक नुकीले संदंश, 6. नुकीले संदंश, और 7. सर्जिकल कैंची । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। (ए और डी)समीपस्थ फेमोरल ए को बेनकाब करने के लिए इंजिनियल क्षेत्र पर एक छोटा चीरा लगाया जाता है, जिसे लिगाटेड किया जाता है। (बी और ई)एक 6-0 सीवन का उपयोग घुटने के क्षेत्र में चीरा खींचने के लिए किया जाता है, जो लिटल फेमोरल ए को बेनकाब करता है। (C, F,और जी) चीरा की सिलाई। संक्षिप्त: फेमोरल ए = फीमोरल धमनी; फेमोरल एन = फेमोरल तंत्रिका; फेमोरल वी = फेमोरल नस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:पैड माउस मॉडल की विशेषताएं। (A)डीएलएफए से पहले और 7 दिनों के बाद शरीर के वजन की तुलना । (ख)टारलोव स्केल द्वारा मूल्यांकन कार्यात्मक वसूली । (ग)चुंबकीय अनुनाद एंजियोग्राफी बाएं हिंद अंग (सफेद तीर) में समीपस्थ और डिस्टल एफए को इंगित करती है, और दाईं ओर, समीपस्थ और डिस्टल एफए गायब हो जाते हैं । (घ)डीएलएफए के बाद चूहों के नंबर 2 और नंबर 4, 1 और 7 दिन के द्विपक्षीय हिंद अंग की उपस्थिति में परिवर्तन । दिखाए गए मूल्यों का मतलब मानक विचलन ± है। *पी < 0.05, ** पी < 0.001, *** पी < 0.0001, **** पी < 0.00001; अकर्पित टी-टेस्ट। संक्षिप्त रूप: पैड = परिधीय धमनी रोग; DLFA = फेमोरल धमनी का डबल लिगेशन; एफए = नारी धमनी; एल = छोड़ दिया; आर = सही। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:वह गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी का धुंधला । (A)कम आवर्धन छवि दिखा रहा है कि वह डीएलएफए प्रक्रिया के 7 दिन बाद सही जीएम का धुंधला हो रहा है । दाहिने जीएम में सूजन देखी गई ।(ख)सही जीएम में, परिगलित myofibers मैक्रोफेज (सफेद तीर) द्वारा भड़काऊ घुसपैठ का प्रदर्शन किया । मांसपेशी फाइबर अपनी सामान्य रूपात्मक विशेषताओं को खो देते हैं। बहुत कम पुनर्जीवित मायोफिबर (काला तीर) थे। (ग)वह दाएं जीएम के सामान्य मायोफिबर का धुंधला होना ।(D)कॉन्ट्रालेटरल/लेफ्ट जीएम (नॉनइस्केमिक) मांसपेशी एक सामान्य हिस्टोलॉजिक पैटर्न दिखाती है । स्केल बार: ए = 200 माइक्रोन, बी-डी = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: वह = हेमेटॉक्सिलिन-इओसिन; DLFA = फेमोरल धमनी का डबल लिगेशन; जीएम = गैस्ट्रोकनेमियस; एल = छोड़ दिया; आर = सही। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5:द्विपक्षीय गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के माइक्रोवैस्कुलर घनत्व की तुलना। (A)सीडी 31-आईएचसी सही जीएम अनुभाग (काले तीर) का धुंधला । (ख)सीडी 31-आईएचसी बाएं जीएम सेक्शन (काले तीर) का धुंधला । (ग)दाईं ओर के माइक्रोवैस्कुलर घनत्व का मात्राकरण, जो बाईं ओर की तुलना में बहुत कम था । दिखाए गए मूल्यों का मतलब मानक विचलन ± है। पी < 0.00001; अकर्पित टी-टेस्ट। स्केल बार: ए, बी = 20 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: CD31 = भेदभाव का क्लस्टर 31; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिकल; जीएम = गैस्ट्रोकनेमियस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| टार्लोव स्कोर | 0 | कोई आंदोलन नहीं |
| 1 | बमुश्किल प्रत्यक्ष आंदोलन, गैर वजन असर | |
| 2 | लगातार आंदोलन, गैर वजन असर | |
| 3 | वजन, आंशिक वजन असर का समर्थन करता है | |
| 4 | हल्के घाटे के साथ चलता है | |
| 5 | सामान्य लेकिन धीमी गति से चलना | |
| 6 | पूर्ण और तेजी से चलना |
तालिका 1: कार्यात्मक स्कोरिंग।
पूरक तालिका S1: पैड मॉडल की स्थापना पर वर्तमान साहित्य से 25 पत्रों का सारांश। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह अध्ययन किसी भी आवश्यक प्रयोगशाला उन्नयन के बिना 3-4 मिमी चीरा के माध्यम से एफए के समीपस्थ और डिस्टैल क्षेत्रों में डबल लिगेशन का उपयोग करकेAPOE-/-चूहों में एक HLI मॉडल स्थापित करने के लिए एक संशोधित, सरलीकृत और शल्य चिकित्सा कुशल दृष्टिकोण की रिपोर्ट करता है । इस विधि की मुख्य विशेषता चीरा का छोटा आकार है , जो पहले बताए गए अध्ययनों की तुलना में माउस एचली मॉडल 8 ,9,10 ,11,12,15,20,22,23,24का वर्णन करता है .
ऐतिहासिक रूप से, घुटने से मीडिया तंग, इंगिनल, या यहां तक कि बेहतर एक्सपोजर के लिए पेट तक एक चीरा लगाया गया है, जिसमें 0.5 से 2 सेमी याउससे अधिक9,11, 15,19,22,25,26 (पूरक तालिका S1में संक्षेप) शामिल हैं। यह पेपर डीएलएफए को प्राप्त करने के लिए एक शल्य चिकित्सा तकनीक का वर्णन करता है और नतीजतन, एचएलआई, चूहों में 5 मिमी (4.2 ± 0.63 मिमी) < चीरा के साथ। एफए को पॉपलाइटल धमनी और सैफेनस धमनी में शाखाओं से पहले लिगाटेड किया गया था, जिससे हिंद अंग में कई मांसपेशी समूहों में इस्केमिया होता है और जिसके परिणामस्वरूप चूहों में मध्यम तनाव होता है। हालांकि चूहों को ऑपरेशन के बाद7 दिन तक कार्यात्मक रूप से बरामद किया गया (ऑपरेशन से पहले टारलोव स्कोर दिन 6 ± 0, 1दिन ऑपरेशन के बाद 3.9 ± 0.99 बनाम7 दिन ऑपरेशन 5.2 ± 0.92) के बाद, अपने स्तर पर जीएम में इस्कीमिक क्षति देखी गई। सबसे पहले, इस्कीमिक लेग मायोफिबरर्स में जीएम ने अनियमित इस्कीमिक नेक्रोसिस का प्रदर्शन किया और पैड रोगियों27, 28में जो कुछ भी बताया गया है, उसके समान बहुनीय मैक्रोफेज द्वारा घुसपैठ की गई। मायोफिबर शोष के बावजूद, कुछ पुनर्जीवित मायोफिबर भी देखे गए, जो पिछली रिपोर्ट29के अनुरूप हैं । दूसरा, इस्कीमिक जीएम में 7वें दिन इस्कीमिक डेंजेशन नॉन-इस्कीमिक लेग की तुलना में अधिक था, जिसे मिनिस्ट्रो एट अल30ने भी सूचित किया है । पैड थेरेपी में हाल ही में ध्यान केंद्रित सिर्फ गैर इस्कीमिक पक्ष की तुलना में माइक्रोवैस्कुलर घनत्व बढ़ाने के लिए सीमित नहीं है, लेकिन यह भी व्यवहार्य मांसपेशी ऊतक है, जो विकास कारकों और जैव यांत्रिक समर्थन31के मैट्रिक्स प्रदान करके नए पोत गठन का समर्थन करता है की इस्केमिया प्रेरित नुकसान की बहाली पर । इस प्रकार, यह मॉडल इन फोसी के साथ नए उपचारों की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए एक विस्तृत खिड़की भी देता है। इसके अलावा, छोटे चीरा के साथ एचली को प्राप्त करना शल्य प्रक्रिया के शोधन के रूप में पशु प्रयोग की 3R अवधारणा के साथ फिट बैठता है, यानी, छोटी त्वचा चीरा आकार आघात और पश्चात दर्द को कम कर देता है।
एक आदर्श पशु मॉडल अपेक्षाकृत लंबी चिकित्सीय खिड़की भी प्रदान करता है। चूहों में इस्केमिया स्थापित करने के लिए विभिन्न शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की रिपोर्ट की गई है और लागू किया गया है, और वे रक्त प्रवाह बहाली21पर विभिन्न प्रभाव डालती हैं। एचआईएलआई को शामिल करने के लिए, सर्जिकल विधियां सामान्य रूप सेइलियाकधमनी 12,19,23, 32,फेमोरलधमनी 24,33, 34और उनकी शाखाओं11,35,कुछ सहित फीमोरल नस के साथ- साथ 36,37पर केंद्रित होती हैं। चूंकि संवहनी बंधन के स्तर का रक्त प्रवाह बहाली पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, इसलिए निर्णायक कारक संवहनी वृक्ष21में चोट की सीमा है। फेमोरल या इलियाक धमनी के एकल बंधन के लिए, इंजिनियल या पेट क्षेत्र में एक छोटा सा चीरा बनाया जाता है, जबकि अन्य शाखा बातचीत अभी भी बनाए रखी जाती है, और माउस हिंद अंग में परफ्यूजन बहाली 7 दिनों के भीतर पूरी तरह से ठीक हो जाती है21,38। इस प्रकार, विभिन्न उपचारों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक उपयुक्त चिकित्सीय खिड़की प्रदान करने के मामले में एक एकल लिगेशन पर्याप्त नहीं है। यदि एफए से शाखाओं को भी लिगामेंट करने की आवश्यकता है, तो त्वचा चीरा को और भी बड़ा बनाया जाना चाहिए, जो सर्जिकल समय को लंबा करता है। इसलिए , माउस में डीएलएफए द्वारा एचएलआरआई एक उपयुक्त चिकित्सीय खिड़की प्रदान करता है जिसमें चिकित्सा द्वारा प्रेरित सुधारों की कुशलतापूर्वक निगरानी की जा सकती है9,21,22,25.
एक चिकित्सकीय प्रासंगिक एचली पशु मॉडल की स्थापना के लिए उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण, यानी, सेल, स्टेमसेल, या पैड2,3,4के लिए जीन थेरेपी की दक्षता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है । चूहों में 15 ,21,चूहों के39और खरगोश 40 ,41में कई पैड मॉडल तैयार किए गए हैं . डेल गिडहिम और उनके सहयोगियों ने एक खरगोश हिंडलिब इस्केमिया मॉडल की स्थापना की जो अंशांकित कणों के साथ परक्यूटेनियस, ट्रांसएरिकुलर, डिस्टल फेमोरल धमनी एम्बोलाइजेशन द्वारा बनाया गया है जो मौजूदा पशु मॉडल40की कुछ सीमाओं को दूर कर सकता है। लिडडेल एट अल41 ने एंडोवैस्कुलर दृष्टिकोण के माध्यम से सतही एफए को कुंडलित करके एक खरगोश पैड मॉडल भी बनाया, जिसके परिणामस्वरूप हिंद अंग रिपरफ्यूजन कम हो गया। यद्यपि खरगोश जैसे बड़े जानवर, अधिक ठोस परिणाम40,41प्राप्त कर सकते हैं, उपचारों को नैदानिक अनुप्रयोग के करीब ले जा सकते हैं, हालांकि उन्हें परिणाम प्राप्त करने के लिए लागत और समय में वृद्धि की आवश्यकता होती है।
पैड के साथ अधिकांश रोगियों के विषम जोखिम प्रोफ़ाइल के बावजूद, वंशानुगत और व्यवहार कारकों सहित४२,ApoE-/-चूहों असामान्य वसा चयापचय और हाइपरलिपिडेमिया लक्षण, जैसे कुल कोलेस्ट्रॉल, ट्राइग्लिसराइड्स, बहुत कम घनत्व लिपोप्रोटीन, और मध्यवर्ती घनत्व लिपोप्रोटीन, पैड के साथ रोगियों में मनाया मुख्य विशेषताओं में से कुछ नकल प्रदर्शित करते हैं । इसके अलावा, उच्च वसा वाले आहार के साथ, ये संकेतक काफी बढ़ जाते हैं। लो सासो एट अल ने बताया कि इन चूहों में धमनी वसा संचय43वर्ष की आयु के 3 महीने में होता है और एएस घावों में वृद्धि43वर्ष की आयु को आगे बढ़ाने के साथ होती है। इस प्रकार,एपोई-/-चूहे विशेष रूप से तीव्र-ऑन-क्रॉनिक इस्केमिया-पैड मॉडल के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं क्योंकि वे पैड के साथ रोगियों में आमतौर पर मौजूद हाइपरकोलेस्टेरियोमिया को फिर से रीकैपिटेट करते हैं और इस्केमिक अंगों के नवसकुलीकरण को बढ़ावा देने में लक्षित विभिन्न उपचारों का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयुक्त मंच प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ApoE के साथ परीक्षण उपन्यास चिकित्सा के मूल्य प्रदर्शनअनुपात-/-चूहों अपराजेय है ।
उपरोक्त पैराग्राफ में उल्लिखित फायदों के बावजूद, इस मॉडल की दो सीमाएं हैं। सबसे पहले, इस विधि में महारत हासिल करने के लिए प्रयोगकर्ता को माउस हिंद अंग के शरीर रचना विज्ञान के साथ पर्याप्त माइक्रोसर्जिकल अनुभव और परिचित होने की आवश्यकता होती है। दूसरा, सीमित सर्जिकल एक्सपोजर और एपोई के पिछले अंग में चमड़े के नीचे वसा ऊतक की मात्रा-/चूहों सर्जिकल कठिनाई को बढ़ाते हैं । इसलिए, इस तकनीक के सफल कार्यान्वयन के लिए कुछ संबंधित अभ्यास की आवश्यकता है। अंत में, यह अध्ययन एक छोटे चीरा का उपयोग कर APOE में एक HLI मॉडल की स्थापना के लिए एक संशोधित और आसान करने के लिए लागू करनेके लिए, शल्य चिकित्सा कुशल दृष्टिकोण की रिपोर्ट । छोटे चीरा काफी जानवर के लिए आघात कम कर देता है और किसी भी प्रयोगशाला उन्नयन के बिना सबसे अनुसंधान समूहों द्वारा लागू किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि लेख सामग्री किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों है कि हितों के एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है की अनुपस्थिति में बना था ।
Acknowledgments
लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए विटोरिया स्कुड, अलेक्जेंडर श्लुंड और फेलिक्स होर्नर का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
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