Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Overvågning af dynamisk vækst af retinale kar i oxygeninduceret retinopati musemodel

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/62410
Automatic Translation
1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

Summary

Denne protokol beskriver en detaljeret metode til fremstilling og immunfluorescensfarvning af mus retinale flade monteringer og analyse. Brugen af fluorescein fundus angiografi (FFA) til museunger og billedbehandling er også beskrevet detaljeret.

Abstract

Oxygeninduceret retinopati (OIR) anvendes i vid udstrækning til at studere unormal karvækst i iskæmiske retinale sygdomme, herunder retinopati af præmaturitet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal veneokklusion (RVO). De fleste OIR-undersøgelser observerer retinal neovaskularisering på bestemte tidspunkter; Imidlertid er den dynamiske fartøjsvækst hos levende mus langs et tidsforløb, som er afgørende for at forstå de OIR-relaterede karsygdomme, blevet undervurderet. Her beskriver vi en trin-for-trin protokol til induktion af OIR-musemodellen, fremhæver de potentielle faldgruber og giver en forbedret metode til hurtigt at kvantificere områder med vaso-udslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) ved hjælp af immunfluorescensfarvning. Endnu vigtigere overvågede vi fartøjsgenvækst hos levende mus fra P15 til P25 ved at udføre fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musemodellen. Anvendelsen af FFA på OIR-musemodellen giver os mulighed for at observere ombygningsprocessen under genvækst af fartøjer.

Introduction

Retinal neovaskularisering (RNV), som er defineret som en tilstand, hvor nye patologiske kar stammer fra eksisterende retinale vener, strækker sig normalt langs nethindens indre overflade og vokser ind i det glasagtige (eller subretinale rum under nogle betingelser)1. Det er et kendetegn og fælles træk ved mange iskæmiske retinopatier, herunder retinopati af præmaturitet (ROP), retinal vene okklusion (RVO) og proliferativ diabetisk retinopati (PDR)2.

Talrige kliniske og eksperimentelle observationer har vist, at iskæmi er hovedårsagen til retinal neovaskularisering 3,4. I ROP udsættes nyfødte for ilt på højt niveau i lukkede inkubatorer for at øge overlevelsesraten, hvilket også er en vigtig drivkraft for anholdelse af vaskulær vækst. Efter behandlingen er udført, oplever nethinden hos nyfødte en relativt hypoxisk periode5. Andre situationer ses i okklusion af centrale eller gren retinale vener i RVO, og der observeres også skader på retinale kapillærer, som er forårsaget af mikroangiopati i PDR2. Hypoxi øger yderligere ekspressionen af angiogene faktorer såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) gennem den hypoxi-inducerede faktor-1α (HIF-1α) signalvej, som igen styrer vaskulære endotelceller til at vokse ind i det hypoxiske område og danne nye kar 6,7.

ROP er en slags vaskulær proliferativ retinopati hos for tidligt fødte spædbørn og en førende årsag til barndomsblindhed 8,9, som er karakteriseret ved retinal hypoxi, retinal neovaskularisering og fibrøs hyperplasi10,11,12. I 1950'erne fandt forskere, at høj koncentration af ilt kan forbedre respiratoriske symptomer hos for tidligt fødte spædbørn13,14. Som følge heraf blev iltbehandling i stigende grad anvendt til for tidligt fødte spædbørn på det tidspunkt15. Men samtidig med den udbredte brug af iltbehandling hos for tidligt fødte spædbørn steg forekomsten af ROP år for år. Siden da har forskere knyttet ilt til ROP og udforsket forskellige dyremodeller for at forstå patogenesen af ROP og RNV16.

Hos mennesker er det meste retinal vaskulaturudvikling afsluttet før fødslen, mens retinal vaskulaturen hos gnavere udvikler sig efter fødslen, hvilket giver et tilgængeligt modelsystem til at studere angiogenese i retinal vaskulatur2. Med forskningens fortsatte fremskridt er oxygeninducerede retinopati (OIR) modeller blevet vigtige modeller til efterligning af patologisk angiogenese som følge af iskæmi. Der er ingen specifikke dyrearter i studiet af OIR-modellen, og modellen er udviklet i forskellige dyrearter, herunder killing 17, rotte18, mus19, beaglehvalp 20 og zebrafisk21. Alle modellerne deler den samme mekanisme, hvormed de udsættes for hyperoxi under tidlig retinal udvikling og derefter vender tilbage til det normoxiske miljø. Smith et al. observerede, at udsættelse af museunger for hyperoxi fra P7 i 5 dage inducerede en ekstrem form for karregression i den centrale nethinde og bragte dem tilbage til rumluften ved P12 udløste gradvist neovaskulære tufts, som voksede mod glaslegemet19. Dette var en standardiseret OIR-musemodel, der også blev navngivet som Smith-model. Connor et al. optimerede protokollen yderligere og leverede en universelt anvendelig metode til kvantificering af arealet af VO (vaso-obliteration) og NV (neovaskularisering) i 2009, hvilket øgede accepten og udnyttelsen af model22. OIR-musemodellen er stadig den mest anvendte model nu på grund af dens lille størrelse, hurtige reproduktion, klare genetiske baggrund, gode repeterbarhed og høje succesrate.

Hos mus starter retinal vaskularisering efter fødslen med indvækst af kar fra det optiske nervehoved ind i den indre nethinde mod ora serrata. Under normal retinal udvikling spirer de første retinale kar fra synsnervehovedet omkring fødslen og danner et ekspanderende netværk (den primære plexus), der når periferien omkring postnatal dag 7 (P7) 23. Derefter begynder karrene at vokse ind i nethinden for at danne et dybt lag, trænge ind i nethinden og etablere et laminært netværk omkring det indre nukleare lag (INL) som hos menneske24. Ved udgangen af den tredje postnatale uge (P21) er dybere plexusudvikling næsten afsluttet. For OIR-musemodellen forekommer vaskulær okklusion altid i den centrale nethinden på grund af den hurtige degeneration af et stort antal umodne vaskulære netværk i det centrale område under hyperoxi-eksponering. Så væksten af patologisk neovaskularisering forekommer også i den midterste perifere nethinde, som er grænsen for ikke-perfusionsområdet og det vaskulære område. Imidlertid er menneskelige retinale kar næsten dannet før fødslen. Hvad angår for tidligt fødte spædbørn, er den perifere nethinde ikke fuldstændigt vaskulariseret, når den udsættes for hyperoxi25,26. Så vaskulær okklusion og neovaskularisering forekommer hovedsageligt i den perifere nethinde27,28. På trods af disse forskelle rekapitulerer musens OIR-model nøje de patologiske hændelser, der opstår under iskæmi-induceret neovaskularisering.

Induktionen af OIR-modellen kan opdeles i to faser29: i fase 1 (hyperoxifase) arresteres eller forsinkes retinal vaskulær udvikling med okklusion og regression af blodkar som følge af faldet i VEGF og apoptose af endotelceller 24,30; I fase 2 (hypoxifase) vil nethindens iltforsyning blive utilstrækkelig under rumluftforhold29, hvilket er afgørende for neural udvikling og homeostase 19,31. Denne iskæmiske situation resulterer normalt i ureguleret, unormal neovaskularisering.

I øjeblikket er den almindeligt anvendte modelleringsmetode skiftevis høj / lav ilteksponering: Mødre og deres hvalpe udsættes for 75% ilt i 5 dage ved P7 efterfulgt af 5 dage i rumluft, indtil P17 viste sammenlignelige resultater22, hvilket er endepunktet for OIR-musemodelinduktion. (Figur 1). Ud over at simulere ROP kan denne iskæmi-medierede patologiske neovaskularisering også bruges til at studere andre iskæmiske retinale sygdomme. De vigtigste målinger af denne model omfatter kvantificering af arealet af VO og NV, som analyseres fra retinale flade monteringer ved immunfluorescensfarvning eller FITC-dextranperfusion. Hver mus kan kun studeres én gang på grund af den dødelige operation. På nuværende tidspunkt er der få metoder til at observere dynamiske ændringer af retinal vaskulatur kontinuerligt under processen med vaskulær regression og patologisk angiogenese32. I dette papir giver vi en detaljeret protokol for OIR-modelinduktion, analyse af retinale flade monteringer samt en arbejdsgang af fluorescein fundus angiografi (FFA) på mus, hvilket ville være nyttigt for at få en mere omfattende forståelse af vaskulære dynamiske ændringer i to faser af OIR-musemodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer brug af mus, blev godkendt af dyreforsøgsetisk komité ved Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Kina (autoriseret nummer: 2020-082) og i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer fra Animal Care and Use Committee of Zhongshan Ophthalmic Center og Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring til brug af dyr i oftalmisk og synsforskning.

1. Induktion af mus OIR model

  1. Brug mus med en lavere grad af medfødt misdannelse af øjnene, fx C57BL/6J mus, og parr dem i et forhold mellem han/hun = 1:2. Få hvalpene født samme dag og begynd at inducere OIR-modellen på P7. Optag kropsvægten af museunger strengt inden modellering.
    BEMÆRK: Bemærk fødselsdagen som P0. Optag vægten af hver mus regelmæssigt. Kropsvægten af nyfødte hvalpe er meget vigtig under induktionen af OIR, da følsomheden hos mus i forskellige tilstande til ilt er anderledes. Ekskluder hvalpene mere end 5 g ved P7 for at sikre sammenlignelige resultater.
  2. Sørg for et passende opholdsmiljø for ammende mødre og deres hvalpe, såsom at indstille temperaturen til 23 °C ± 2 °C, kontrollere fugtigheden ved 40%-65%, skiftevis 12 timers lys og 12 timers mørke hver dag, tilføje noget bomuldsuld til buret til nesting, sikre tilstrækkelig steriliseret mad og vand og opbevare dem i individuelt ventilerede bure (IVC).
  3. Overvåg fugtighedsniveauet og temperaturen inde i kammeret. Kontroller fugtigheden mellem 40% og 65%, og hold temperaturen på 23 °C ± 2 °C.
  4. Kontroller iltforsyningen med iltfølere, hold et konstant iltniveau på 75% og kontroller iltstrømningshastigheden ved 0,5-0,75 l / min. Sæt 50 g sodavand i bunden af kammeret for at absorbere overdreven CO2 og opretholde CO2-værdier under 3%22.
  5. Overvåg ammende mødres adfærd, såsom redebygningsadfærd, bide deres hvalpe og nægte amning mindst en gang om dagen. Eliminer ammende mødre med dårligt moderskab.
  6. Placer P7-hvalpene (mandlige og kvindelige) og deres ammende mødre i et iltkammer, hvor iltniveauet er 75% i 5 dage til P12. Undgå unødvendig åbning af kammeret i perioden med modelinduktion. Sørg for, at der er ekstra surrogatmødre til erstatning, hvis de ammende mødre dør på grund af lungeskade, mens de er i hyperoxi.
    BEMÆRK: For at sikre eksperimentets sammenlignelighed skal du begrænse antallet til 6-8 hvalpe for hver mor. Vær opmærksom på det potentielle problem med ilttoksicitet, som forårsager nogle ammende mødres død. Tegnene på hyperoxisk lungeskade hos ammende mødre omfatter, men er ikke begrænset til, svingende respirationsfrekvens, nedsat aktivitet og nedsat fodring. Når ovenstående fænomen opstår, skal du aflive den ammende mor med 1% pentobarbital natrium (50 mg/kg) så hurtigt som muligt. Forbered nogle surrogatmødre, f.eks. 129S1/SvImJ til udskiftning, og brug dem kun, hvis det er nødvendigt. Det anbefales ikke at erstatte ammende mødre som en rutine, da dette vil føre til hyppig åbning af et iltkammer, hvilket resulterer i ustabile iltniveauer og moderens aggression.
  7. Bring hvalpene og deres ammende mødre tilbage til stueluften på P12 og overvåg vægten af alle hvalpene kontinuerligt indtil P17. Gruppér hvalpene baseret på vægten for at sikre, at hver forsøgsgruppe har en lignende vægtfordeling.

2. Fremstilling af retinale hele monteringer og immunofluorescensfarvning

  1. Optag hvalpenes kropsvægt. Ofr hvalpene ved en overdosis bedøvelsesmiddel (1% pentobarbital natrium 50 mg / kg) eller CO2 indånding. Andre metoder til eutanasi, såsom cervikal dislokation og bilateral thoracotomi, kan anvendes, hvis det er nødvendigt.
  2. Brug buet saks til at frigøre forbindelsen mellem øjenkugler og orbitalvæv. Sæt derefter buede tang ind i den bageste del af øjeæblet, klem synsnerven og løft hurtigt øjet ud fra kredsløbet. Vask øjenkuglerne i en forkølet 1x fosfatbuffersaltvand (PBS) for at fjerne hår og blod fra overfladen af øjenkuglerne.
  3. Anbring de rensede øjenkugler i et 2 ml mikrocentrifugerør fyldt med 4% paraformaldehyd (PFA) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur på en ryster med en hastighed på 12-15 omdrejninger pr. Minut (omdr./min.) (indledende fiksering).
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd er kendt for at være allergifremkaldende, generelt giftig og ekstremt cytotoksisk. Følg sikkerhedsinstruktionerne nøje og undgå indånding og hudkontakt.
  4. Brug en kulturskål og læg en dråbe 1x PBS i den centrale del og udfør følgende trin under et dissekerende mikroskop og læg et øjeæble i denne dråbe. Hold øjeæblet med et par tang og punktere forsigtigt hornhinden ved hornhindeslimhinden ved hjælp af en 1 ml sprøjtenål. Indsæt spidsen af saksen i dette hul og skær hornhinden forsigtigt langs hornhinden limbus. Pas på ikke at skære nethinden.
  5. Fjern iris og linse med et par tang. Placer derefter den resterende øjenkop i 4% PFA og fastgør igen i yderligere 45 minutter ved stuetemperatur på en ryster med en hastighed på 12-15 o / min (sekundær fiksering).
  6. Brug en kulturret og læg en dråbe 1x PBS i den centrale del. Placer det faste øjeæble i denne dråbe. Hold øjeæblet med et par tang. Adskil forsigtigt nethinden og sclera lagene ved hjælp af to tang. Placer spidsen af saksen mellem nethinden og sclera-lagene og skær sclera mod synsnerven. Skræl sclera af nethinden og få nethinden.
    BEMÆRK: Hold den bageste kop ved synsnerven med tang, og brug derefter den buede ende af en anden tang til at trykke ned på sclera ved synsnervehovedet og massér forsigtigt nethinden ud i en fremadgående fejende bevægelse som et alternativ til at frigøre nethinden.
  7. Brug tang til at frigøre forbindelsen mellem radiale hyaloidkar og perifer nethinde, klem roden af hyaloidkarrene, der er tæt på det optiske nervehoved, og skær hyaloidkarrene forsigtigt af.
  8. Brug en 2 ml pipette med spidsen afskåret for at overføre nethindekoppen. Anbring nethindekoppen i en brønd i en 48-brønds plade og vask den i 3 x 5 minutter med 1x PBS ved stuetemperatur på en ryster med en hastighed på 12-15 o / min.
  9. Retinalkoppen inkuberes i en blandet opløsning af 1% Triton X-100 (i PBS) og 5% normalt æselserum (i PBS) natten over ved 4 °C.
    1. Alternativt kan du blokere og gennemtrænge nethinder ved stuetemperatur i 1 time som et alternativ. Skift blokerende serum i henhold til kilden til det sekundære antistof.
  10. Hvis du mærker retinal vaskulaturen ved hjælp af Isolectin B4, skal du inkubere nethinden i en brønd med 48-brøndplade med 0,1% normalt æselserum (400 μL) og IsolectinB4-594 (1:400) natten over ved 4 ° C på en ryster med en hastighed på 12-15 o / min.
    BEMÆRK: Hvis du mærker blodkarrene med andre markører, såsom CD31, eller mærkning af andre celler, skal du bruge specifikke primære antistoffer til at mærke dem.
  11. Inkuber nethinden med 1:100-1:500 specifikke primære antistoffer (i 400 μL 0,1% normalt æselserum) ved 4 °C på en ryster med en hastighed på 12-15 omdr./min. i 48 timer (valgfrit)
  12. Efter tilbagevenden til stuetemperatur vaskes nethinden med 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 i PBS) i 3 x 20 minutter på en ryster med en hastighed på 12-15 o / min.
  13. Inkuber nethinden med 1:1.000 sekundære antistoffer (i 400 μL 0,1% normalt æselserum) natten over ved 4 °C på en ryster med en hastighed på 12-15 o / min. (valgfrit)
    1. Alternativt inkuberes nethinden med sekundære antistoffer med høj affinitet ved stuetemperatur i 1 time.
  14. Inkuber nethinden med DAPI (1:1.000) ved stuetemperatur i 20-25 minutter for at mærke kernen.
    BEMÆRK: Test de optimale fortyndingsforhold for alle antistoffer, der anvendes i trin 10-11 og 13-14 i præeksperimentet.
  15. Vask nethinden i 3 x 30 min med 0,1% PBST på en ryster med en hastighed på 12-15 o / min ved stuetemperatur.
  16. Overfør nethindekoppen til et rent dias med åbningen opad. Skær nethinden radialt ved stillingen 3, 6, 9 og 12 fra perifer til central ved at skære ca. 1-1,5 mm væk fra synsnervehovedet.
  17. Tilsæt et par dråber 1x PBS for at skylle nethinden tre gange. Brug luftlagt papir til at tørre og flade nethinden. Tilsæt en dråbe monteringsmedium (se Materialetabel) til midten af dækslippen, og stop med at tilføje det, indtil dråbens diameter stiger til halvdelen af dækslippen. Vend hurtigt dækslippen og læg den oven på den udspredte nethinde. Undgå at danne bobler.
  18. Tag billeder af nethindens flade beslag, eller opbevar og beskyt lysbillederne mod lys ved 4 °C.

3. Analyse og kvantificering af retinale flade monteringer

BEMÆRK: For OIR-musemodellen registrerer forskerne ofte området for central retinal vaskulær okklusion og perifer retinal patologisk neovaskularisering under P12-P25. Tidligere undersøgelser har vist, at det centrale avaskulære område af nethinden når maksimum ved P12 og gradvist krymper fra P13 til P17; samtidig når nethinden hos OIR-mus toppen af neovaskulariseringsområdet omkring P1722,29. Fra P17 går neofartøjer gradvist tilbage, og funktionelle fartøjer vokser ind i det avaskulære område. Nethindevaskulaturen vender stort set tilbage til normal ved P2533.

  1. Tag billeder af retinale flade beslag ved hjælp af et fluorescensmikroskop (se Materialetabel) med 10x objektivlinse. Vælg først DAPI-kanalen og sæt det optiske nervehoved i midten af synsfeltet. Juster derefter andre kanaler og fokuser på nethindens overfladiske vaskulatur. Kontroller fliser i en fotosoftware (se Materialetabel), og indstil antallet af fotos, der skal sys. Klik på Start eksperiment for at fange hele nethinden.
  2. Brug et billedbehandlingsprogram (se Materialetabel) til at kvantificere området med vaso-udslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) efter immunfluorescensfarvning.
    1. Klik først på Magic Wand Tool og indstil en passende tolerance i henhold til forskellen i lysstyrke og flyt markøren til baggrunden og klik med musen. Vælg derefter Vælg invers for at få en grundlæggende kontur af nethinden. Brug Lasso-værktøjet til yderligere at skitsere detaljerne i nethinden. Brug Histogram-funktionen til at registrere pixelværdien af hele nethinden og skrive den ned eller generere en tabel i et databaseprogram.
    2. Opdel nethindebilledet i fire kvadranter. I hver kvadrant skal du bruge Lasso-værktøjet til at tegne VO-området (figur 2A-C) og bruge tryllestavsværktøjet til at vælge NV-området (figur 2D-F). Gennem pixeloplysningerne i histogrammet beregnes pixelforholdet mellem VO og NV til hele nethinden, det vil sige procentdelen af VO eller NV-området i forhold til hele nethinden.
      BEMÆRK: Der er også en open source og fuldautomatisk pipeline til kvantificering af VO- og NV-områder i OIR-billeder ved hjælp af deep learning neurale netværk (http://oirseg.org/), som giver en pålidelig og tidsbesparende måde for forskere samt forener standarden for kvantificeringen34.
  3. Optag pixeloplysninger i en regnearkstabel, hvilket er praktisk til efterfølgende analyse.

4. In vivo-billeddannelse med fluorescein fundus angiografi (FFA)

BEMÆRK: For OIR-mus kan både FITC-perfusion og immunfluorescensfarvning kun bruges én gang på grund af forsøgsdyrs død. Sammenlignet med dette er en af fordelene ved FFA observationen af de dynamiske ændringer af musens retinale kar under udvikling og patologisk tilstand in vivo35,36.

  1. Væg hvalpene før anæstesi.
  2. Anæstetik hvalpe ved intraperitoneal injektion af 0,3% pentobarbital natrium i en dosis på 30-50 mg/kg.
    BEMÆRK: For mus inden for 1 måned skal du være opmærksom på bedøvelsesdoserne. Brug lavere koncentrationer og doser af bedøvelsesmiddel for at reducere musens død forårsaget af anæstesi. Når hvalpene er bedøvet, skal du bruge en lille varmepude til at opretholde kropstemperaturen. Hypotermi påvirker ikke kun hvalpes fysiologiske funktion, men fører også til ændringer i krystallinsk og fremskynder udviklingen af grå stær.
  3. Brug 20 μL mydriatiske øjendråber (0,5% tropicamid + 0,5% phenylephrinhydrochlorid) til hver hvalp og vent i 5 minutter for at opnå langvarig pupiludvidelse (figur 3A, B).
  4. Bring de bedøvede hvalpe foran billeddannelsesenheden (se Materialetabel). Hold hvalpene på en lille varmepude, placer hvalpene i en stabil position, og brug kunstige tårer regelmæssigt for at opretholde fugt i hornhinden. Klik på tilstanden Infrarød Fundus Imaging (IR) for at justere det optiske nervehoved til midten af skærmen.
    BEMÆRK: Når du observerer hvalpenes ene øje, skal du ikke glemme at beskytte det andet øje. Brug Hypromellose øjendråber for at forhindre hornhinden i at blegne på grund af tørhed.
  5. Efter intraperitoneal injektion af 0,15 ml 0,5% fluoresceinnatriumsaltopløsning skal du klikke på FA-knappen og injektionsknappen straks på berøringspanelet på billeddannelsesenheden for at starte timingen. Optag billederne efter 3 min, når blodcirkulationen i nethinden går ind i venøs fase og observer nethinden ikke mindre end 6-8 min.
    BEMÆRK: Efter intraperitoneal injektion af fluoresceinnatriumsaltopløsning viser hvalpenes hud, slimhinde og urin tydelig gullig grøn. Det meste af fluorescein udskilles af hvalpene inden for en dag. Injektion af fluoresceinnatrium intraperitonealt hver anden dag i seks gange forårsager ikke signifikante bivirkninger37.
  6. Flyt synsnervehovedet til midten af billedoptagelsesområdet, og tag det første billede af den centrale nethinde. Flyt derefter linsen på billeddannelsesenheden vandret til næsesiden af øjet, indtil det optiske nervehoved er placeret i midtpunktet på den ene side af billedoptagelsesområdet og tag det andet billede. Fortsæt med at tage billeder af henholdsvis den tidsmæssige, overlegne og ringere nethinden ved hjælp af denne metode (figur 3C).
    BEMÆRK: Tag "Fem-orientering" billeder inden for 12 minutter, når regressionsfasen opstår. Placeringen af det optiske nervehoved i det ringere billede må ikke falde på sidelinjen på grund af linsens begrænsede vinkeljustering.
  7. Gem billederne, og brug et billedbehandlingsprogram til syning.

5. Billedbehandling af fluorescein fundus angiografi (FFA)

  1. Åbn billedbehandlingsprogrammet, og klik på Ny i fil for at oprette et nyt lærred med en sort baggrund (figur 4A).
  2. Åbn et billede af den centrale nethinde først i baggrundslaget. Klik på Filer og tilføj det andet billede. Juster opaciteten af det andet billede til 60%, flyt og tilpas størrelsen på det andet billede, indtil de samme dele af de to billeder overlapper hinanden meget. Klik på knappen Skift mellem fri transformation og kædetilstande, og foretag om nødvendigt subtile justeringer af fartøjerne. Drej derefter uigennemsigtigheden af det andet billede tilbage til 100% (figur 4A, B).
  3. Vælg to billeder på samme tid, og klik på Automatisk blandingslag. Kontroller Panorama som blandingsmetode, og vælg følgende to sætninger. Klik på OK og afslut billedsyningen af de to første billeder (figur 4C, D).
  4. Tag de to første syede billeder som helhed, tilføj det tredje billede, og fortsæt med at blande. Gentag metoderne ovenfor for at fuldføre syningen af fem billeder (figur 4E).
  5. Brug beskæringsværktøjet til at klippe billeder af FFA på forskellige tidspunkter til en ensartet størrelse og observere dynamiske ændringer af retinal vaskulatur fra P15 til P25 i både normale og OIR hvalpe.

6. Statistisk analyse

  1. Nutidsværdier som gennemsnit ± standardafvigelse (s.d.).
  2. Brug elevens t-test til at sammenligne to uafhængige prøver. Brug One-Way ANOVA til at sammenligne flere datasæt og kombinere med Dunnett eller Tukeys test, som er en almindeligt anvendt multiple sammenligningstest.
  3. For ikke-normalt distribuerede data skal du bruge Mann-Whitney U-test eller Kruskal Wallis-test. Overvej signifikante statistiske forskelle, når P < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I OIR-musemodellen er det vigtigste og grundlæggende resultat kvantificeringen af VO- og NV-området. Efter at have levet i hyperoxia-miljøet i 5 dage fra P7, viste hvalpenes centrale nethinde det største ikke-perfusionsområde. Under stimulering af hypoxi i yderligere 5 dage blev retinal neovaskularisering gradvist produceret, som fluorescerede mere intenst end omgivende normale kar. Efter P17 regresserede fluorescenssignalet for patologisk neovaskularisering hurtigt som ombygning af nethinden (figur 5A). Ved at kontrollere kuldstørrelsen og hvalpenes postnatale vægtforøgelse viste arealet af VO og NV i OIR-musemodellen god repeterbarhed og stabilitet, og toppen af retinal neovaskularisering forekom ved P17, hvilket var i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser (figur 5B, C).

FFA er et ideelt værktøj til at studere retinal vaskulatur. I betragtning af anvendelsen af FFA in vivo viser det en stor reduktion i spild af forsøgsdyr samt viser de dynamiske ændringer i nethindekarrene med tiden. I tidligere undersøgelser blev FFA ikke ofte brugt til museunger og blev præsenteret i et enkeltvisningsbillede, hvilket var vanskeligt at studere yderligere. I denne protokol blev "Fem-orientering" -billederne af nethindens vaskulatur syet sammen ved hjælp af en billedbehandlingssoftware for at vise et bredere felt af nethinden ad gangen, hvilket var nyttigt til efterfølgende analyse, hvis det var nødvendigt (figur 4). Desuden viste OIR-museungerne en langvarig øjenåbning, så FFA-billederne blev taget fra P15 for at opfylde kravene i dyreetik. I nethinden i OIR-musemodellen steg diameteren af blodkar tydeligt og blev meget snørklet, når man sammenlignede med normale mus. Desuden viste FFA en lignende tendens til dynamiske ændringer af retinal vaskulatur med immunfluorescensfarvning med isolectin B4-594 fra P15-P25 uden hvalpenes død (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Tegneserieskema af OIR-musemodel. OIR musemodel blev induceret ved at holde hvalpe og deres ammende mødre i et rum i nogen tid (P0-P7). På P7 blev de begge udsat for 75% ilt i 5 dage, hvilket hæmmede nethindekarvæksten og forårsagede betydeligt fartøjstab i den centrale nethinde. Mus blev derefter bragt tilbage til rumluft ved P12, og den avaskulære nethinde begyndte at blive relativt hypoxisk, hvilket udløste både normal genvækst af kar og et patologisk respons omkring den midterste perifere nethinde. Den maksimale neovaskularisering (NV) blev set ved P17. Derefter gennemgik patologisk neovaskularisering en proces med spontan regression. Det retinale vaskulære system var tilbage til det normale igen omkring P25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Måling af vaso-udslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) i musens nethinde. (A) Billede af 10x P12 OIR retinal helmontering farvet til endotelceller med isolectin B4-594. (B) Skærmbillede af en nethinde med det avaskulære område valgt. Værktøjer, der er nødvendige for at foretage denne måling, fremhæves med hvide pile: Magic Wand Tool og Lasso Tool. (C) Fremhæv det avaskulære område af nethinden og gem billedet som en kopi. (D) Billede af 10x P17 OIR retinal helmontering farvet til endotelceller med isolectin B4-594. (E) Skærmbillede af en nethinde med neovaskulære tufts valgt. Brug Magic Wand Tool, og indstil en optimal tolerance for at fremhæve NV. Indstil tolerancen til 3-5, og marker anti-alias og tilstødende felter. (F) Gem kun neovaskulariseringsområdet som en kopi. Skalabjælker repræsenterer 1.000 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Erhvervelse af billederne "Fem-orientering" i musens nethinde. (A) Den normale museelev. (B) Museelev i mydriasis. (C) De "fem-orienterede" billeder af det centrale, nasale, tidsmæssige, overordnede og ringere område af nethinden blev indsamlet henholdsvis (P17 hvalpe i rumluft). Vægtstænger repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Generel arbejdsgang med syning af "Fem-orientering" billeder fra fluorescein fundus angiografi (FFA). (A) Opret et nyt lærred med en sort baggrund, og åbn FFA-billedet af den centrale nethinde. (B) Åbn et FFA-billede af den tidsmæssige nethinde, og juster opaciteten af det andet billede til 60%; Flyt og tilpas størrelsen på billedet, indtil de samme dele af de to billeder overlapper hinanden meget. Klik på Skift mellem Free Transform og Warp Modes for at foretage subtile justeringer, hvis det er nødvendigt. Drej uigennemsigtigheden af det andet billede tilbage til 100%. (C) Vælg to billeder på samme tid, og klik på Automatisk blandingslag. (D) Brug Panorama som blandingsmetode til at afslutte billedsyningen af de to første billeder. (E) Fortsæt med at sy billeder ved at gentage metoderne ovenfor for at fuldføre syningen af alle billederne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Kvantificering af vaso-udslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) i nethinden i OIR-musemodellen. (A) Billede af 10x OIR retinale helmonteringer farvet til endotelceller med isolectin B4-594 fra P12 til P25. Efter at have været udsat for 75% ilt i 5 dage blev hvalpe og deres ammende mødre bragt tilbage til rumluften på P12, hvor området med vaso-udslettelse nåede maksimum. Den relative hypoxi i den centrale nethinde førte til genvækst af kar i dette område såvel som patologisk angiogenese i den midterste perifere nethinde. Ved P17 nåede præ-retinale neovaskulære tufts maksimum og skrumpede derefter hurtigt. NV gik helt tilbage, og nethinden syntes at være normal omkring P25. (B) Kvantificering af VO-arealet viste en top ved P12 og forsvinden omkring P25. (C) Kvantificering af NV-arealet viste en top ved P17 og regression ved omkring P25. Skalabjælker repræsenterer 1.000 μm i A. (Envejs ANOVA, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: In vivo-billeddannelse af fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musemodellen. I nethinden i OIR-musemodellen steg diameteren af blodkar tydeligt og blev meget snørklet, når man sammenlignede med normale mus. Desuden viste FFA en lignende tendens til dynamiske ændringer af retinal vaskulatur med immunfluorescensfarvning med isolectin B4-594 fra P15-P25 uden død af musepopper. Vægtstænger repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Musens modtagelighed for OIR påvirkes af mange faktorer. Hvalpe med forskellig genetisk baggrund og stammer kan ikke sammenlignes. I BALB/c albinomus vokser karrene hurtigt ind i VO-området med signifikant reducerede neovaskulære tufts38, hvilket medfører nogle vanskeligheder for forskningen. Hos C57BL/6-mus er der øget fotoreceptorskade sammenlignet med BALB/cJ-musestamme39,40. Det samme gælder for forskellige typer transgene mus41,42,43. Desuden viser C57BL/6-mus et lavere niveau af angiogenese sammenlignet med 129S3/SvIM-mus44.

Postnatal vægtforøgelse (PWG) er også vigtig at overveje45 og er en af indikatorerne til evaluering af nyfødtes ernæringsstatus. Det er også blevet en pålidelig metode til at forudsige ROP, som tiltrækker mange dyremodellerers opmærksomhed46. PWG påvirker musens reaktion på hyperoxi og hypoxi. På P7 viser hvalpe med øget kropsvægt (>5 g) en utilstrækkelig vaso-udslettelse og retinal neovaskularisering, mens hvalpe med nedsat kropsvægt (<5 g) viser indlysende reaktion på hyperoxi og hypoxi. Desuden viser hvalpe med dårlig (<5 g) og omfattende (>7,5 g) vægtforøgelse ved P17 en nedsat NV. Hvalpe med dårlig vægtøgning (<5 g) har imidlertid signifikant forlænget vaso-udslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) stadium med en forsinkelse i forekomsten af NV peak45. Derfor er det nødvendigt at registrere og kontrollere PWG af hvalpe på P7 og P17 og eliminere hvalpe med lav PWG (< 6 g ved P17) for at sikre repeterbarheden og sammenligneligheden af eksperimentet.

Kuldstørrelsen har større indflydelse på PWG, og nogle forskere foreslår, at den bør begrænses til 6-8 hvalpe / dæmning for at opfylde kravene til PWG22,31. Den ammende mors tilstand kræver også en overvejelse. Ammende mødre er mere tilbøjelige til at dø af lungeskader i et hyperoxisk miljø47. Hvis ammende mødre dør eller forsømmer deres hvalpe under og efter introduktionen af OIR, vil hvalpe let tabe sig eller endda dø på grund af manglen på ernæring32. Derfor er det nødvendigt at sikre, at der er nok surrogatmødre til at erstatte dem. Disse surrogatmødre foreslås dog kun at blive brugt, når moderen udløber, hvilket normalt sker i perioden med hyperoxi-eksponering eller vender tilbage til rumluften22. At give tilstrækkelig mad til ammende mødre er også nyttigt for at forbedre deres hvalpes ernæringsstatus.

En nyttig note til at forberede de retinale flade monteringer er, at en optimal fikseringstid normalt er nødvendig for yderligere langvarig farvning. Som mus af P12-P25 anbefales en 15 min + 45 min fiksering ved stuetemperatur29. Fastsættelse af nethinden til 4 °C natten over er et alternativ, hvis tiden er begrænset. Desuden reducerer den permeable og blokerende buffer med en højere koncentration på 1% Triton X-100 og 5% normalt æselserum effektivt baggrunden for immunfluorescensfarvning ifølge vores erfaring.

Isolectin B4 farvning og FITC-dextran perfusion er almindeligt anvendte metoder til at visualisere og kvantificere den neovaskulære48,49. En væsentlig begrænsning ved disse to metoder er, at musene skal ofres. Så metoderne til in vivo-billeddannelse og kvantificering af NV er nødvendige29. Paques et al. udviklede en teknik ved navn Topical Endoskopi fundus imaging (TEFI), som giver digitale fotografier i høj opløsning af nethinden i levende mus50. TEFI kan detektere retinale vaskulære ændringer så tidligt som P15, og de opnåede billeder er i overensstemmelse med de konventionelle vurderingsmetoder. Mezu-Ndubuisi et al. leverede derefter metoderne til in vivo retinal vaskulær iltspænding (PO2) målinger og fluorescein angiografi (FA), hvilket forbedrede forståelsen af retinale vaskulære ændringer og iltningsændringer på grund af ROP og andre iskæmiske retinale sygdomme37. Selvom hverken TEFI eller FA er så nøjagtige som konventionelle metoder, reducerer de forsøgsdyrs død og kan udføres gentagne gange. Desuden tillader de hver mus at fungere som sin egen kontrol, hvilket gør OIR-dataene mere sammenlignelige. I dette papir leveres en forbedret metode til FFA-billeddannelse og billedsyning. Udførelse af FFA på hvalpe inden for 1 måned er ikke let, fordi overdreven anæstesi og hypotermi direkte forårsager hvalpenes død. Prøv således at bruge den mindste dosis anæstesi og vær særlig opmærksom på at opretholde hvalpes kropstemperatur gennem og efter processen ved hjælp af en lille varmepude. Fugt altid den okulære overflade med saltvand og Hypromellose i tilfælde af svigt af følgende observation.

Sammenfattende er OIR-musemodellen en meget almindelig og udbredt model af retinal iskæmi og patologisk neovaskularisering. Et af de største problemer ved denne model er, at de neonatale museunger i det væsentlige er sunde og ikke har metabolisk ustabilitet eller åndedrætsproblemer sammenlignet med for tidligt fødte spædbørn. En anden forskel mellem OIR-musemodellen og mennesker er, at der altid er fibrovaskulær proliferation i human retinal neovaskularisering, mens den retinale neovaskulære ikke er forbundet med fibrose i OIR-musemodellen51. For at udnytte denne model bedre og få mere information gives en detaljeret beskrivelse af brugen af FFA til at overvåge de dynamiske ændringer i OIR's retinale vaskulatur, herunder metoderne til at tage "Fem-orientering" billeder og billedbehandling. Det antages, at FFA vil blive en effektiv metode helt eller delvist til at erstatte immunfluorescensfarvningen for at observere og evaluere morfologien og funktionen af retinal vaskulatur49. Selvom OIR-musemodellen ikke fuldt ud ligner mikromiljøet og patogenesen af forskellige iskæmiske retinopati hos mennesker, giver den os mulighed for at udføre lægemiddel- og transgene eksperimenter samt at udforske mekanismen for patologisk angiogenese på den iskæmiske nethinde51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmer fra vores laboratorium og Ophthalmic Animal Laboratory of Zhongshan Ophthalmic Center for deres tekniske assistance. Vi takker også prof. Chunqiao Liu for eksperimentel støtte. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Beijing, Kina), Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (tilskud nr. 2019A1515011347) og hospitalsbyggeri på højt niveau fra State Key Laboratory of Ophthalmology ved Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sterile syringe Solarbio YA0550 For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech  FG701-01 For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube Corning MCT-200-C For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3548 For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides Various For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019 Adobe Inc. For image analysis
Carbon dioxide gas Various For sacrifice
Cover slide Various For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps World Precision Instruments 14127 For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution Abcam ab228549 For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope Olmpus SZ61 For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium Sigma-Aldrich F6377 For in vivo imaging
Fluorescent Microscope  Zeiss AxioImager.Z2 For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech  0100-01 For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose Maya 89161 For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody Invitrogen I21413 For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J GemPharmatech of Jiangsu Province For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242 For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps World Precision Instruments  501978-6 For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum Abcam ab7475 For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor Various For monitoring the level of O2
OxyCycler Biospherix A84XOV For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG For tissue fixation
Pentobarbital sodium Various For anesthesia
Soda lime Various For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT Heidelberg HC00500002 For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0 IBM For statistical analysis
Tansference decloring shaker Kylin-Bell ZD-2008 For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment) Corning 3261-20EA For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes Various For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100 Sigma-Aldrich  SLBW6818 For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide Various For in vivo imaging
ZEN Imaging Software ZEISS For image acquisition and export

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
  4. Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), Pt 2 7-17 (1957).
  5. Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
  6. Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473 (2018).
  7. Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
  8. Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O'Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
  9. Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
  10. Fielder, A., Blencowe, H., O'Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
  11. Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 7 Suppl 69-73 (2006).
  12. Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
  13. Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
  14. Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
  15. Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
  16. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  17. Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
  18. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  19. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  20. McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
  21. Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748 (2008).
  22. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  23. Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
  24. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  25. Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241 (2017).
  26. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  27. Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
  28. Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
  29. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  30. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
  31. Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  32. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  33. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  34. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
  35. McLeod, D. S., D'Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
  36. Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
  37. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  38. Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546 (2014).
  39. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  40. Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
  41. Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
  42. Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
  43. Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
  44. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  45. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  46. Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
  47. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  48. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
  49. Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
  50. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  51. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).

Tags

Biologi udgave 170
Overvågning af dynamisk vækst af retinale kar i oxygeninduceret retinopati musemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic… More

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model. J. Vis. Exp. (170), e62410, doi:10.3791/62410 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter