Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Övervakning av dynamisk tillväxt av retinala kärl i syreinducerad retinopati musmodell

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/62410
Automatic Translation
1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

Summary

Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för beredning och immunofluorescensfärgning av möss retinala platta fästen och analys. Användningen av fluorescein fundus angiografi (FFA) för mössungar och bildbehandling beskrivs också i detalj.

Abstract

Syreinducerad retinopati (OIR) används ofta för att studera onormal kärltillväxt vid ischemiska retinala sjukdomar, inklusive retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) och retinal venocklusion (RVO). De flesta OIR-studier observerar retinal neovaskularisering vid specifika tidpunkter; den dynamiska kärltillväxten hos levande möss längs en tidskurs, som är avgörande för att förstå de OIR-relaterade kärlsjukdomarna, har dock understuderats. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för induktion av OIR-musmodellen, belyser de potentiella fallgroparna och tillhandahåller en förbättrad metod för att snabbt kvantifiera områden med vaso-utplåning (VO) och neovaskularisering (NV) med hjälp av immunofluorescensfärgning. Ännu viktigare var att vi övervakade kärlåterväxten hos levande möss från P15 till P25 genom att utföra fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musmodellen. Tillämpningen av FFA på OIR-musmodellen gör att vi kan observera ombyggnadsprocessen under fartygsåterväxt.

Introduction

Retinal neovaskularisering (RNV), som definieras som ett tillstånd där nya patologiska kärl härstammar från befintliga retinala vener, sträcker sig vanligtvis längs näthinnans inre yta och växer in i glaskroppen (eller subretinalt utrymme under vissa förhållanden)1. Det är ett kännetecken och vanligt inslag i många ischemiska retinopatier, inklusive retinopati av prematuritet (ROP), retinal venocklusion (RVO) och proliferativ diabetisk retinopati (PDR)2.

Många kliniska och experimentella observationer har visat att ischemi är den främsta orsaken till retinal neovaskularisering 3,4. I ROP utsätts nyfödda för syre på hög nivå i slutna inkubatorer för att öka överlevnadsgraden, vilket också är en viktig drivkraft för att stoppa vaskulär tillväxt. Efter att behandlingen är klar upplever näthinnorna hos nyfödda en relativt hypoxisk period5. Andra situationer ses vid ocklusion av centrala eller grena retinala vener i RVO och skador på retinala kapillärer observeras också vilket orsakas av mikroangiopati i PDR2. Hypoxi ökar ytterligare uttrycket av angiogena faktorer såsom vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) genom den hypoxiinducerade faktor-1α (HIF-1α) signalvägen som i sin tur leder vaskulära endotelceller att växa in i det hypoxiska området och bilda nya kärl 6,7.

ROP är en slags vaskulär proliferativ retinopati hos för tidigt födda barn och en ledande orsak till barnblindhet8,9, som kännetecknas av retinal hypoxi, retinal neovaskularisering och fibrös hyperplasi10,11,12. På 1950-talet fann forskare att hög koncentration av syre kan förbättra andningssymtomen hos för tidigt födda barn13,14 avsevärt. Som ett resultat användes syrebehandling alltmer hos för tidigt födda barn vid den tiden15. Men samtidigt med den utbredda användningen av syrebehandling hos för tidigt födda barn ökade förekomsten av ROP år för år. Sedan dess har forskare kopplat syre till ROP och utforskat olika djurmodeller för att förstå patogenesen av ROP och RNV16.

Hos människor är de flesta retinala vaskulaturutvecklingen avslutad före födseln medan retinal vaskulatur hos gnagare utvecklas efter födseln, vilket ger ett tillgängligt modellsystem för att studera angiogenes i retinal vaskulatur2. Med den kontinuerliga utvecklingen av forskningen har syreinducerad retinopati (OIR) -modeller blivit viktiga modeller för att efterlikna patologisk angiogenes till följd av ischemi. Det finns inga specifika djurarter i studien av OIR-modellen och modellen har utvecklats i olika djurarter, inklusive kattunge 17, råtta18, mus19, beaglevalp 20 och zebrafisk 21. Alla modeller delar samma mekanism genom vilken de utsätts för hyperoxi under tidig retinal utveckling och sedan återgår till den normoxiska miljön. observerade att exponering av musungar för hyperoxi från P7 i 5 dagar inducerade en extrem form av kärlregression i den centrala näthinnan och förde dem tillbaka till rumsluften vid P12 utlöste gradvis neovaskulära tufts, som växte mot glaskroppen19. Detta var en standardiserad OIR-musmodell som också heter Smith-modellen. optimerade ytterligare protokollet och tillhandahöll en universellt tillämplig metod för att kvantifiera området VO (vaso-utplåning) och NV (neovaskularisering) 2009, vilket ökade acceptansen och användningen av modellen22. OIR-musmodellen är fortfarande den mest använda modellen nu på grund av dess lilla storlek, snabba reproduktion, tydliga genetiska bakgrund, goda repeterbarhet och höga framgångsgrad.

Hos möss börjar retinal vaskularisering efter födseln med inväxt av kärl från synnervhuvudet till den inre näthinnan mot ora serrata. Under normal retinal utveckling spirar de första retinala kärlen från synnervhuvudet runt födseln och bildar ett expanderande nätverk (den primära plexusen) som når periferin runt postnatal dag 7 (P7) 23. Sedan börjar kärlen växa in i näthinnan för att bilda ett djupt lager, tränga in i näthinnan och etablera ett laminärt nätverk runt det inre kärnskiktet (INL) som i människa24. I slutet av den tredje postnatala veckan (P21) är djupare plexusutveckling nästan klar. För OIR-musmodellen uppträder vaskulär ocklusion alltid i den centrala näthinnan på grund av den snabba degenerationen av ett stort antal omogna vaskulära nätverk i den centrala regionen under hyperoxiexponering. Så tillväxten av patologisk neovaskularisering sker också i mitten av perifer näthinna, vilket är gränsen för icke-perfusionsområdet och kärlområdet. Emellertid har mänskliga retinala kärl nästan bildats före födseln. När det gäller för tidigt födda barn är den perifera näthinnan inte helt vaskulariserad när den utsätts för hyperoxi25,26. Så vaskulär ocklusion och neovaskularisering förekommer huvudsakligen i den perifera näthinnan27,28. Trots dessa skillnader rekapitulerar musens OIR-modell noggrant de patologiska händelserna som inträffar under ischemiinducerad neovaskularisering.

Induktionen av OIR-modellen kan delas in i två faser29: i fas 1 (hyperoxifas) arresteras eller fördröjs retinal vaskulär utveckling med ocklusion och regression av blodkärl som ett resultat av nedgången i VEGF och apoptosen av endotelceller 24,30; I fas 2 (hypoxifas) kommer retinal syretillförsel att bli otillräcklig under rumsluftförhållanden29, vilket är viktigt för neural utveckling och homeostas 19,31. Denna ischemiska situation resulterar vanligtvis i oreglerad, onormal neovaskularisering.

För närvarande är den vanliga modelleringsmetoden alternerande hög / låg syreexponering: Mödrar och deras valpar utsätts för 75% syre i 5 dagar vid P7 följt av 5 dagar i rumsluft tills P17 visade jämförbara resultat22, vilket är slutpunkten för OIR-musmodellinduktion. (Figur 1). Förutom att simulera ROP kan denna ischemimedierade patologiska neovaskularisering också användas för att studera andra ischemiska retinala sjukdomar. Huvudmätningarna av denna modell inkluderar kvantifiering av området för VO och NV, som analyseras från retinala platta fästen genom immunofluorescensfärgning eller FITC-dextranperfusion. Varje mus kan studeras endast en gång på grund av den dödliga operationen. För närvarande finns det få metoder för att observera dynamiska förändringar av retinal vaskulatur kontinuerligt under processen med vaskulär regression och patologisk angiogenes32. I detta dokument tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för OIR-modellinduktion, analys av retinala platta fästen samt ett arbetsflöde för fluorescein fundus angiografi (FFA) på möss som skulle vara till hjälp för att få en mer omfattande förståelse för vaskulära dynamiska förändringar under två faser av OIR-musmodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som involverar användning av möss godkändes av djurförsökets etiska kommitté vid Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Kina (auktoriserat nummer: 2020-082), och i enlighet med de godkända riktlinjerna för djurvård och användningskommitté för Zhongshan Ophthalmic Center och Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning.

1. Induktion av musens OIR-modell

  1. Använd möss med en lägre grad av medfödd missbildning av ögonen, t.ex. C57BL/6J-möss, och para dem i förhållandet mellan hane och hona = 1:2. Få valparna födda samma dag och börja inducera OIR-modellen på P7. Spela in kroppsvikt hos musvalpar strikt före modellering.
    OBS: Notera födelsedagen som P0. Registrera vikten på varje mus regelbundet. Kroppsvikten hos nyfödda valpar är mycket viktig under induktionen av OIR eftersom mössens känslighet i olika tillstånd för syre är annorlunda. Uteslut valparna mer än 5 g vid P7 för att säkerställa jämförbara resultat.
  2. Ge en lämplig livsmiljö för ammande mödrar och deras valpar, till exempel att ställa in temperaturen vid 23 ° C ± 2 ° C, kontrollera luftfuktigheten vid 40% -65%, alternerande 12 h ljus och 12 h mörker varje dag, lägga till lite bomullsull i buren för häckning, säkerställa tillräcklig steriliserad mat och vatten och hålla dem i individuellt ventilerade burar (IVC).
  3. Övervaka luftfuktigheten och temperaturen inuti kammaren. Kontrollera luftfuktigheten mellan 40% och 65% och håll temperaturen vid 23 °C ± 2 °C.
  4. Kontrollera syretillförseln med syresensorer, håll en konstant syrenivå på 75% och kontrollera syreflödet vid 0,5-0,75 L / min. Sätt 50 g sodakalk i botten av kammaren för att absorbera överdriven CO2 och bibehålla CO2-värden under 3% 22.
  5. Övervaka beteendet hos ammande mödrar som bobyggande beteende, bita sina valpar och vägra laktation minst en gång om dagen. Eliminera ammande mödrar med dåligt moderskap.
  6. Placera P7-valparna (man och kvinna) och deras ammande mödrar i en syrekammare där syrenivån är 75% i 5 dagar till P12. Undvik onödig öppning av kammaren under modellinduktionsperioden. Se till att det finns extra surrogatmödrar för ersättning, om de ammande mödrarna dör på grund av lungskada medan de är i hyperoxi.
    OBS: För att säkerställa experimentets jämförbarhet, begränsa antalet till 6-8 valpar för varje mamma. Var uppmärksam på det potentiella problemet med syretoxicitet, vilket orsakar vissa ammande mödrars död. Tecknen på hyperoxisk lungskada hos ammande mödrar inkluderar, men är inte begränsade till, fluktuerande andningsfrekvens, minskad aktivitet och minskad utfodring. När ovanstående fenomen uppstår, avliva den ammande mamman med 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg) så snart som möjligt. Förbered några surrogatmödrar, t.ex. 129S1/SvImJ för ersättning och använd dem endast om det behövs. Det rekommenderas inte att ersätta ammande mödrar som rutin, eftersom detta kommer att leda till frekvent öppning av en syrekammare, vilket resulterar i instabila syrenivåer och moderns aggression.
  7. Ta med valparna och deras ammande mödrar tillbaka till rumsluften vid P12 och övervaka vikten på alla valpar kontinuerligt fram till P17. Gruppera valparna baserat på vikten för att säkerställa att varje experimentgrupp har en liknande viktfördelning.

2. Beredning av retinala helfästen och immunofluorescensfärgning

  1. Spela in valparnas kroppsvikt. Offra ungarna genom en överdos av bedövningsmedel (1 % pentobarbitalnatrium 50 mg/kg) eller inandning avCO2 . Andra metoder för eutanasi, såsom cervikal dislokation och bilateral torakotomi, kan användas vid behov.
  2. Använd böjd sax för att frigöra sambandet mellan ögonbollar och orbitalvävnad. Lägg sedan böjda pincett i den bakre delen av ögongloben, kläm fast synnerven och lyft snabbt ögat ut från banan. Tvätta ögonbollarna i en förkyld 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS) för att ta bort hår och blod från ögonglobernas yta.
  3. Placera de rengjorda ögongloberna i ett 2 ml mikrocentrifugrör fyllt med 4% paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur på en skakapparat med en hastighet av 12-15 varv per minut (rpm) (initial fixering).
    VARNING: Paraformaldehyd är känt för att vara allergiframkallande, allmänt giftigt och extremt cytotoxiskt. Följ säkerhetsanvisningarna strikt och undvik inandning och hudkontakt.
  4. Använd en odlingsskål och lägg en droppe 1x PBS i den centrala delen och utför följande steg under ett dissekerande mikroskop och placera en ögonglob i denna droppe. Håll ögongloben med ett par pincett och punktera försiktigt hornhinnan vid hornhinnans limbus med en 1 ml sprutnål. Sätt in saxens spets i detta hål och skär av hornhinnan försiktigt längs hornhinnans limbus. Var försiktig så att du inte skär näthinnan.
  5. Ta bort iris och lins med ett par pincett. Placera sedan den återstående ögonmusslan i 4% PFA och fixera igen i ytterligare 45 minuter vid rumstemperatur på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm (sekundär fixering).
  6. Använd en odlingsskål och lägg en droppe 1x PBS i den centrala delen. Placera den fasta ögongloben i denna droppe. Håll ögongloben med ett par pincett. Separera försiktigt näthinnan och sclera-skikten med två pincett. Placera saxens spets mellan näthinnan och sclera-skikten och skär sclera mot synnerven. Skala bort sclera från näthinnan och få retinalkoppen.
    OBS: Håll den bakre koppen vid synnerven med pincett, använd sedan den böjda änden av en annan tång för att trycka ner sclera vid synnervhuvudet och massera försiktigt ut näthinnan i en framåtriktad svepande rörelse som ett alternativ för att frigöra näthinnan.
  7. Använd pincett för att frigöra anslutningen mellan radiella hyaloidkärl och perifer näthinna, kläm fast roten på hyaloidkärlen som ligger nära synnervhuvudet och skär av hyaloidkärlen försiktigt.
  8. Använd en 2 ml pipett med spetsen avskuren för att överföra näthinnekoppen. Placera näthinnekoppen i en brunn i en 48-brunnsplatta och tvätta den i 3 x 5 minuter med 1x PBS vid rumstemperatur på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm.
  9. Inkubera näthinnekoppen i en blandad lösning av 1% Triton X-100 (i PBS) och 5% normalt åsneserum (i PBS) över natten vid 4 °C.
    1. Alternativt kan du blockera och permeabilisera näthinnor vid rumstemperatur i 1 h som ett alternativ. Byt blockerande serum enligt källan till den sekundära antikroppen.
  10. Om du märker retinal vaskulatur med Isolectin B4, inkubera näthinnan i en brunn med 48-brunnsplatta med 0,1% normalt åsneserum (400 μL) och IsolectinB4-594 (1:400) över natten vid 4 ° C på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm.
    OBS: Om du märker blodkärlen med andra markörer, till exempel CD31, eller märker andra celler, använd specifika primära antikroppar för att märka dem.
  11. Inkubera näthinnan med 1:100-1:500 specifika primära antikroppar (i 400 μL 0,1% normalt åsneserum) vid 4 °C på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm i 48 h. (valfritt)
  12. Efter att ha återgått till rumstemperatur, tvätta näthinnan med 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 i PBS) i 3 x 20 min på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm.
  13. Inkubera näthinnan med 1:1 000 sekundära antikroppar (i 400 μL 0,1% normalt åsneserum) över natten vid 4 °C på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm. (valfritt)
    1. Alternativt inkubera näthinnan med sekundära antikroppar med hög affinitet vid rumstemperatur i 1 h.
  14. Inkubera näthinnan med DAPI (1: 1,000) vid rumstemperatur i 20-25 minuter för att märka kärnan.
    OBS: Testa de optimala utspädningsförhållandena för alla antikroppar som används i steg 10-11 och 13-14 i förexperimentet.
  15. Tvätta näthinnan i 3 x 30 min med 0,1% PBST på en shaker med en hastighet av 12-15 rpm vid rumstemperatur.
  16. Överför näthinnekoppen till en ren bild med öppningen uppåt. Skär näthinnan radiellt vid klockan 3, 6, 9 och 12 från perifer till central genom att skära cirka 1-1,5 mm från synnervhuvudet.
  17. Tillsätt några droppar 1x PBS för att skölja näthinnan tre gånger. Använd luftlagt papper för att torka och platta ut näthinnan. Lägg till en droppe monteringsmedium (se Materialförteckning) i mitten av täckglaset och sluta lägga till det tills droppens diameter ökar till hälften av täckglaset. Vänd snabbt på täckglaset och placera det ovanpå den utspridda näthinnan. Undvik att bilda bubblor.
  18. Ta bilder av näthinnans platta fästen eller förvara och skydda rutschkanorna från ljus vid 4 °C.

3. Analys och kvantifiering av retinala platta fästen

OBS: För OIR-musmodellen registrerar forskarna ofta området för central retinal vaskulär ocklusion och perifer retinal patologisk neovaskularisering under P12-P25. Tidigare studier har visat att det centrala avaskulära området i näthinnan når maximalt vid P12 och gradvis krymper från P13 till P17; samtidigt når näthinnan hos OIR-möss toppen av neovaskulariseringsområdet vid cirka P1722,29. Från P17 går neovessels gradvis tillbaka och funktionella kärl växer tillbaka till det avaskulära området. Retinal vaskulatur återgår i princip till det normala vid P2533.

  1. Ta bilder av retinala platta fästen med ett fluorescensmikroskop (se materialtabell) med 10x objektivlins. Välj först DAPI-kanalen och ställ in det optiska nervhuvudet i mitten av det visuella fältet. Justera sedan andra kanaler och fokusera på näthinnans ytliga kärl. Kontrollera Tiles i ett fotoprogram (se Materialförteckning) och ställ in antalet foton som behöver sys. Klicka på Starta experiment för att fånga hela näthinnan.
  2. Använd ett bildbehandlingsprogram (se Materialförteckning) för att kvantifiera området för vaso-utplåning (VO) och neovaskularisering (NV) efter immunofluorescensfärgning.
    1. Klicka först på Magic Wand Tool och ställ in en lämplig tolerans enligt skillnaden i ljusstyrka och flytta markören till bakgrunden och klicka på musen. Välj sedan Välj invers för att få en grundläggande kontur av näthinnan. Använd lassoverktyget för att ytterligare beskriva detaljerna i näthinnan. Använd histogramfunktionen för att registrera pixelvärdet för hela näthinnan och skriv ner det eller generera en tabell i ett databasprogram.
    2. Dela näthinnebilden i fyra kvadranter. I varje kvadrant använder du lassoverktyget för att rita VO-området (bild 2A-C) och använder trollstavsverktyget för att välja NV-området (bild 2D-F). Genom pixelinformationen i histogrammet beräknar du pixelförhållandet mellan VO och NV till hela näthinnan, det vill säga procentandelen VO- eller NV-område i förhållande till hela näthinnan.
      OBS: Det finns också en öppen källkod och helautomatisk pipeline för kvantifiering av VO- och NV-områden i OIR-bilder med hjälp av djupinlärningsneurala nätverk (http://oirseg.org/), vilket ger ett pålitligt och tidsbesparande sätt för forskare samt förenar standarden för kvantifieringen34.
  3. Spela in pixelinformation i en kalkylbladstabell, vilket är bekvämt för efterföljande analys.

4. In vivo-avbildning med fluorescein fundus angiografi (FFA)

OBS: För OIR-möss kan både FITC-perfusion och immunofluorescensfärgning endast användas under en gång på grund av försöksdjurens död. Jämfört med detta är en av fördelarna med FFA observationen av de dynamiska förändringarna hos musretinala kärl under utveckling och patologiskt tillstånd in vivo35,36.

  1. Väg valparna före anestesi.
  2. Bedöva valpar genom intraperitoneal injektion av 0,3% pentobarbitalnatrium i en dos av 30-50 mg/kg.
    OBS: För möss inom 1 månad, var uppmärksam på bedövningsdoserna. Använd lägre koncentrationer och doser av bedövningsmedel för att minska dödsfallet hos möss som orsakas av anestesi. När valparna har bedövats, använd en liten värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen. Hypotermi påverkar inte bara valparnas fysiologiska funktion utan leder också till förändringar i kristallin och påskyndar utvecklingen av grå starr.
  3. Använd 20 μL mydriatiska ögondroppar (0,5% tropicamid + 0,5% fenylefrinhydroklorid) för varje valp och vänta i 5 minuter för att uppnå långvarig pupillutvidgning (figur 3A,B).
  4. Ta med de sövda valparna framför bildbehandlingsapparaten (se Materialförteckning). Håll valparna på en liten värmedyna, placera valparna i ett stabilt läge och använd konstgjorda tårar regelbundet för att bibehålla fukt i hornhinnan. Klicka på läget för Infrared Fundus Imaging (IR) för att justera synnervhuvudet till mitten av skärmen.
    OBS: När du observerar ett öga på valparna, glöm inte att skydda det andra ögat. Använd Hypromellose ögondroppar för att förhindra att hornhinnan vitnar på grund av torrhet.
  5. Efter intraperitoneal injektion av 0,15 ml 0,5% fluoresceinnatriumsaltlösning, klicka på FA-knappen och injektionsknappen omedelbart på bildapparatens pekskärm för att starta timing. Spela in bilderna efter 3 min när blodcirkulationen i näthinnan går in i venös fas och observera näthinnan inte mindre än 6-8 min.
    OBS: Efter intraperitoneal injektion av fluoresceinnatriumsaltlösning visar valparnas hud, slemhinna och urin uppenbart gulgrön. Det mesta av fluorescein utsöndras av valparna inom en dag. Att injicera fluoresceinnatrium intraperitonealt varannan dag i sex gånger orsakar inte signifikanta biverkningar37.
  6. Flytta det optiska nervhuvudet till mitten av bildförvärvsområdet och ta den första bilden av den centrala näthinnan. Flytta sedan bildapparatens lins horisontellt till nässidan av ögat tills det optiska nervhuvudet är beläget vid mittpunkten på ena sidan av bildförvärvsområdet och ta den andra bilden. Fortsätt att ta bilder av den tidsmässiga, överlägsna respektive underlägsna näthinnan med den här metoden (figur 3C).
    OBS: Ta "Femorienteringsbilder" inom 12 minuter när regressionsfasen inträffar. Positionen för det optiska nervhuvudet i den underlägsna bilden får inte falla på sidlinjen på grund av linsens begränsade vinkeljustering.
  7. Spara bilderna och använd ett bildbehandlingsprogram för sömnad.

5. Bildbehandling av fluorescein fundus angiografi (FFA)

  1. Öppna bildbehandlingsprogrammet och klicka på Ny i fil för att skapa en ny duk med svart bakgrund (figur 4A).
  2. Öppna en bild av den centrala näthinnan först i bakgrundsskiktet. Klicka på Arkiv och lägg till den andra bilden. Justera opaciteten för den andra bilden till 60 %, flytta och ändra storlek på den andra bilden tills samma delar av de två bilderna överlappar varandra mycket. Klicka på knappen Växla mellan Free Transform och Warp Modes och gör subtila justeringar av fartygen om det behövs. Vrid sedan tillbaka opaciteten för den andra bilden till 100 % (figur 4A,B).
  3. Välj två bilder samtidigt och klicka på Auto-Blend Layers. Kontrollera Panorama som blandningsmetod samt välj följande två meningar. Klicka på OK och avsluta bildsömmarna för de två första bilderna (figur 4C,D).
  4. Ta de två första sydda bilderna som helhet, lägg till den tredje bilden och fortsätt att blanda. Upprepa metoderna ovan för att slutföra sömnaden av fem bilder (figur 4E).
  5. Använd beskärningsverktyget för att klippa bilder av FFA vid olika tidpunkter till en enhetlig storlek och observera dynamiska förändringar av retinal vaskulatur från P15 till P25 hos både normala och OIR-valpar.

6. Statistisk analys

  1. Nuvärden som medelvärde ± standardavvikelse (s.d.).
  2. Använd Students t-test för att jämföra två oberoende prover. Använd One-Way ANOVA för att jämföra flera uppsättningar data och kombinera med Dunnett eller Tukeys test, som är ett vanligt multipelt jämförelsetest.
  3. För icke-normalt distribuerade data, använd Mann-Whitney U-test eller Kruskal Wallis-test. Tänk på signifikanta statistiska skillnader när P < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I OIR-musmodellen är det viktigaste och grundläggande resultatet kvantifieringen av VO- och NV-området. Efter att ha levt i hyperoximiljön i 5 dagar från P7 visade valparnas centrala näthinna det största icke-perfusionsområdet. Under stimulering av hypoxi i ytterligare 5 dagar producerades retinal neovaskularisering gradvis som fluorescerade mer intensivt än omgivande normala kärl. Efter P17 gick fluorescenssignalen för patologisk neovaskularisering snabbt tillbaka som ombyggnaden av näthinnan (figur 5A). Genom att kontrollera kullstorleken och valparnas postnatala viktökning visade området för VO och NV i OIR-musmodellen god repeterbarhet och stabilitet och toppen av retinal neovaskularisering inträffade vid P17, vilket var i linje med tidigare studier (Figur 5B,C).

FFA är ett idealiskt verktyg för att studera retinal vaskulatur. Med tanke på tillämpningen av FFA in vivo visar den en stor minskning av slöseriet från försöksdjur samt visar de dynamiska förändringarna i näthinnekärlen med tiden. I tidigare studier användes FFA inte ofta hos mössungar och presenterades i en bild med en enda vy, vilket var svårt för vidare studier. I detta protokoll sys "femorienteringsbilderna" av näthinnans kärlkropp ihop med hjälp av en bildbehandlingsprogramvara för att visa ett bredare fält av näthinnan samtidigt, vilket var till hjälp för efterföljande analys, om det behövs (figur 4). Dessutom visade OIR-musungarna en långvarig ögonöppning så FFA-bilderna togs från P15 för att uppfylla kraven på djuretik. I näthinnan i OIR-musmodellen ökade blodkärlens diameter tydligt och blev mycket krånglig jämfört med normala möss. Dessutom visade FFA en liknande trend av dynamiska förändringar av retinal vaskulatur med immunofluorescensfärgning med isolektin B4-594 från P15-P25 utan valparnas död (Figur 6).

Figure 1
Figur 1: Tecknad schematisk bild av OIR-musmodell. OIR-musmodellen inducerades genom att hålla valpar och deras ammande mödrar i ett rum under en tid (P0-P7). Vid P7 utsattes båda för 75% syre i 5 dagar, vilket hämmade retinal kärltillväxt och orsakade betydande kärlförlust i centrala näthinnan. Möss fördes sedan tillbaka till rumsluften vid P12 och den avaskulära näthinnan började bli relativt hypoxisk, vilket utlöste både normal kärlåterväxt och ett patologiskt svar runt den mellersta perifera näthinnan. Den maximala neovaskulariseringen (NV) sågs vid P17. Därefter genomgick patologisk neovaskularisering en process av spontan regression. Retinala kärlsystemet var tillbaka till det normala igen vid cirka P25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mätning av vaso-utplåning (VO) och neovaskularisering (NV) i musens näthinna . (A) Bild av 10x P12 OIR retinal helmonterad färgad för endotelceller med isolektin B4-594. (B) Skärmdump av en näthinna med det avaskulära området valt. Verktyg som behövs för att göra denna mätning markeras med vita pilar: Magic Wand Tool och Lasso Tool. (C) Markera det avaskulära området på näthinnan och spara bilden som en kopia. (D) Bild av 10x P17 OIR retinal helmonterad färgad för endotelceller med isolektin B4-594. (E) Skärmdump av en näthinna med neovaskulära tufts valda. Använd Magic Wand Tool och ställ in en optimal tolerans för att markera NV. Ställ in toleransen på 3-5 och markera rutorna kantutjämning och angränsande rutor. (F) Spara neovaskulariseringsområdet endast som en kopia. Skalstreck representerar 1 000 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Förvärv av "Femorientering" -bilderna i musens näthinna. (A) Den normala muspupillen. (B) Muspupill i mydriasis. (C) "Femorienteringsbilderna" av näthinnans centrala, nasala, tidsmässiga, överlägsna och underlägsna område samlades in (P17-valpar i rumsluft). Skalstreck representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Allmänt arbetsflöde för att sy "Femorienteringsbilder" från fluorescein fundus angiografi (FFA). (A) Skapa en ny duk med svart bakgrund och öppna FFA-bilden av den centrala näthinnan. (B) Öppna en FFA-bild av den temporala näthinnan och justera opaciteten för den andra bilden till 60%; flytta och ändra storlek på bilden tills samma delar av de två bilderna överlappar varandra mycket. Klicka på Växla mellan Free Transform- och Warp Modes för att göra subtila justeringar om det behövs. Vrid opaciteten för den andra bilden tillbaka till 100%. (C) Välj två bilder samtidigt och klicka på Auto-Blend Layers. (D) Använd Panorama som blandningsmetod för att avsluta bildsömnaden av de två första bilderna. (E) Fortsätt att sy bilder genom att upprepa metoderna ovan för att slutföra sömnaden av alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kvantifiering av vaso-utplåning (VO) och neovaskularisering (NV) i näthinnan i OIR-musmodellen. (A) Bild av 10x OIR retinala helfästen färgade för endotelceller med isolektin B4-594 från P12 till P25. Efter att ha utsatts för 75% syre i 5 dagar fördes valpar och deras ammande mödrar tillbaka till rumsluften vid P12 där området för vaso-utplåning nådde maximalt. Den relativa hypoxin i den centrala näthinnan ledde till kärlåterväxt i detta område samt patologisk angiogenes i mitten av perifer näthinna. Vid P17 nådde pre-retinala neovaskulära tufts maximalt och krympte sedan snabbt. NV gick tillbaka helt och näthinnan verkade vara normal vid cirka P25. (B) Kvantifiering av arean av VO visade en topp vid P12 och försvinnande vid cirka P25. (C) Kvantifiering av området NV visade en topp vid P17 och regression vid omkring P25. Skalstänger representerar 1 000 μm i A. (Envägs ANOVA, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: In vivo-avbildning av fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musmodellen. I näthinnan i OIR-musmodellen ökade blodkärlens diameter tydligt och blev mycket krånglig jämfört med normala möss. Dessutom visade FFA en liknande trend av dynamiska förändringar av retinal vaskulatur med immunofluorescensfärgning med isolektin B4-594 från P15-P25 utan död hos mössvalpar. Skalstreck representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mössens mottaglighet för OIR påverkas av många faktorer. Valparna med olika genetisk bakgrund och stammar kan inte jämföras. Hos BALB/c albinomöss växer kärlen snabbt in i VO-området med signifikant reducerade neovaskulära tufts38, vilket medför vissa svårigheter för forskningen. Hos C57BL/6-möss finns det ökad fotoreceptorskada jämfört med BALB/cJ-musstam39,40. Detsamma gäller för olika typer av transgena möss41,42,43. Dessutom visar C57BL / 6-möss en lägre nivå av angiogenes jämfört med 129S3 / SvIM-möss44.

Postnatal viktökning (PWG) är också viktigt att överväga45 och är en av indikatorerna för att utvärdera näringsstatusen hos nyfödda. Det har också blivit en pålitlig metod för att förutsäga ROP, vilket lockar uppmärksamheten hos många djurmodellerare46. PWG påverkar mössens svar på hyperoxi och hypoxi. Vid P7 visar valpar med ökad kroppsvikt (>5 g) en otillräcklig vaso-utplåning och retinal neovaskularisering, medan valpar med minskad kroppsvikt (<5 g) visar uppenbart svar på hyperoxi och hypoxi. Dessutom, vid P17, visar valpar med dålig (<5 g) och omfattande (>7,5 g) viktökning en minskad NV. Valpar med dålig viktökning (<5 g) har emellertid signifikant förlängt vaso-utplåning (VO) och neovaskulariseringsstadium (NV) med en fördröjning i förekomsten av NV-topp45. Därför är det nödvändigt att registrera och kontrollera PWG för valpar vid P7 och P17 och eliminera valpar med låg PWG (< 6 g vid P17) för att säkerställa experimentets repeterbarhet och jämförbarhet.

Kullstorleken har en större inverkan på PWG, och vissa forskare föreslår att den bör begränsas till 6-8 valpar / damm för att uppfylla kraven för PWG22,31. Den ammande moderns tillstånd behöver också övervägas. Ammande mödrar är mer benägna att dö av lungskador i en hyperoxisk miljö47. Om ammande mödrar dör eller försummar sina valpar under och efter induktionen av OIR, kommer valpar lätt att gå ner i vikt eller till och med dö på grund av bristen på näring32. Därför är det nödvändigt att se till att det finns tillräckligt med surrogatmödrar för att ersätta dem. Dessa surrogatmödrar föreslås dock endast användas när modern löper ut, vilket vanligtvis händer under perioden med hyperoxiexponering eller återgår till rumsluften22. Att tillhandahålla tillräcklig mat för ammande mödrar är också till hjälp för att förbättra näringsstatusen hos sina valpar.

En användbar anteckning för att förbereda retinala platta fästen är att en optimal fixeringstid vanligtvis är nödvändig för ytterligare långvarig färgning. Som möss av P12-P25 rekommenderas en 15 min + 45 min fixering vid rumstemperatur29. Att fixera näthinnan vid 4 °C över natten är ett alternativ om tiden är begränsad. Dessutom minskar den permeabla och blockerande bufferten med en högre koncentration av 1% Triton X-100 och 5% normalt åsneserum effektivt bakgrunden till immunofluorescensfärgning enligt vår erfarenhet.

Isolectin B4-färgning och FITC-dextran-perfusion är vanliga metoder för att visualisera och kvantifiera den neovaskulära48,49. En stor begränsning med dessa två metoder är att mössen måste offras. Så metoderna för in vivo-avbildning och kvantifiering av NV behövs29. utvecklade en teknik som heter aktuell endoskopi fundus imaging (TEFI), som ger högupplösta digitala fotografier av näthinnan i levande möss50. TEFI kan upptäcka retinala vaskulära förändringar redan i P15 och de bilder som erhålls överensstämmer med de konventionella bedömningsmetoderna. tillhandahöll sedan metoderna för in vivo retinal vaskulär syrespänning (PO2) mätningar och fluoresceinangiografi (FA), vilket förbättrade förståelsen för retinala vaskulära förändringar och syresättningsförändringar på grund av ROP och andra ischemiska retinala sjukdomar37. Även om varken TEFI eller FA är lika exakta som konventionella metoder, minskar de försöksdjurens död och kan utföras upprepade gånger. Dessutom tillåter de varje mus att fungera som sin egen kontroll, vilket gör OIR-data mer jämförbara. I detta dokument tillhandahålls en förbättrad metod för FFA-avbildning och bildsömnad. Att utföra FFA på valpar inom 1 månad är inte lätt eftersom överdriven anestesi och hypotermi direkt orsakar valpens död. Försök därför att använda minsta dos av anestesi och var särskilt uppmärksam på att bibehålla kroppstemperaturen hos valpar under hela och efter processen genom att använda en liten värmepanna. Fukta alltid ögonytan med saltlösning och hypromellos vid fel på följande observation.

Sammanfattningsvis är OIR-musmodellen en mycket vanlig och allmänt använd modell av retinal ischemi och patologisk neovaskularisering. Ett av de största problemen med denna modell är att nyfödda mössungar i huvudsak är friska och inte har metabolisk instabilitet eller andningsproblem jämfört med för tidigt födda spädbarn. En annan skillnad mellan OIR-musmodellen och människor är att det alltid finns fibrovaskulär proliferation i human retinal neovaskularisering medan retinal neovaskulär inte är associerad med fibros i OIR-musmodellen51. För att bättre utnyttja denna modell och få mer information tillhandahålls en detaljerad beskrivning av hur man använder FFA för att övervaka de dynamiska förändringarna i OIR-retinal vaskulatur, inklusive metoderna för att ta "Femorientering" -bilder och bildbehandling. Man tror att FFA kommer att bli en effektiv metod helt eller delvis för att ersätta immunofluorescensfärgningen för att observera och utvärdera morfologin och funktionen hos retinal vaskulatur49. Även om OIR-musmodellen inte helt liknar mikromiljön och patogenesen hos olika ischemisk retinopati hos människor, ger den oss en möjlighet att genomföra läkemedels- och transgena experiment samt att utforska mekanismen för patologisk angiogenes på den ischemiska näthinnan51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar alla medlemmar från vårt laboratorium och oftalmiska djurlaboratorium i Zhongshan Ophthalmic Center för deras tekniska hjälp. Vi tackar också prof. Chunqiao Liu för experimentellt stöd. Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Peking, Kina), Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (bidrag nr 2019A1515011347) och sjukhusbyggnadsprojekt på hög nivå från State Key Laboratory of Ophthalmology vid Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sterile syringe Solarbio YA0550 For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech  FG701-01 For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube Corning MCT-200-C For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3548 For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides Various For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019 Adobe Inc. For image analysis
Carbon dioxide gas Various For sacrifice
Cover slide Various For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps World Precision Instruments 14127 For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution Abcam ab228549 For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope Olmpus SZ61 For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium Sigma-Aldrich F6377 For in vivo imaging
Fluorescent Microscope  Zeiss AxioImager.Z2 For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech  0100-01 For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose Maya 89161 For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody Invitrogen I21413 For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J GemPharmatech of Jiangsu Province For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242 For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps World Precision Instruments  501978-6 For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum Abcam ab7475 For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor Various For monitoring the level of O2
OxyCycler Biospherix A84XOV For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG For tissue fixation
Pentobarbital sodium Various For anesthesia
Soda lime Various For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT Heidelberg HC00500002 For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0 IBM For statistical analysis
Tansference decloring shaker Kylin-Bell ZD-2008 For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment) Corning 3261-20EA For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes Various For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100 Sigma-Aldrich  SLBW6818 For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide Various For in vivo imaging
ZEN Imaging Software ZEISS For image acquisition and export

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
  4. Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), Pt 2 7-17 (1957).
  5. Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
  6. Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473 (2018).
  7. Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
  8. Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O'Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
  9. Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
  10. Fielder, A., Blencowe, H., O'Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
  11. Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 7 Suppl 69-73 (2006).
  12. Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
  13. Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
  14. Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
  15. Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
  16. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  17. Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
  18. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  19. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  20. McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
  21. Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748 (2008).
  22. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  23. Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
  24. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  25. Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241 (2017).
  26. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  27. Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
  28. Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
  29. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  30. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
  31. Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  32. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  33. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  34. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
  35. McLeod, D. S., D'Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
  36. Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
  37. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  38. Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546 (2014).
  39. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  40. Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
  41. Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
  42. Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
  43. Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
  44. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  45. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  46. Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
  47. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  48. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
  49. Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
  50. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  51. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).

Tags

Biologi utgåva 170
Övervakning av dynamisk tillväxt av retinala kärl i syreinducerad retinopati musmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic… More

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model. J. Vis. Exp. (170), e62410, doi:10.3791/62410 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter