Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Overvåking av dynamisk vekst av retinale kar i oksygenindusert retinopati musemodell

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/62410
Automatic Translation
1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

Summary

Denne protokollen beskriver en detaljert metode for fremstilling og immunfluorescensfarging av mus retinal flat mounts og analyse. Bruk av fluorescein fundus angiografi (FFA) for musunger og bildebehandling er også beskrevet i detalj.

Abstract

Oksygenindusert retinopati (OIR) er mye brukt til å studere unormal karvekst i iskemiske retinale sykdommer, inkludert retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal vene okklusjon (RVO). De fleste OIR-studier observerer retinal neovaskularisering på bestemte tidspunkter; Imidlertid har den dynamiske fartøyveksten i levende mus langs et tidskurs, som er avgjørende for å forstå OIR-relaterte fartøyssykdommer, blitt understudert. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for induksjon av OIR-musemodellen, fremhever potensielle fallgruver og gir en forbedret metode for raskt å kvantifisere områder med vaso-utslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) ved hjelp av immunfluorescensfarging. Enda viktigere, vi overvåket gjenvekst av fartøy i levende mus fra P15 til P25 ved å utføre fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musemodellen. Anvendelsen av FFA til OIR-musemodellen lar oss observere ombyggingsprosessen under gjenvekst av fartøy.

Introduction

Retinal neovaskularisering (RNV), som er definert som en tilstand der nye patologiske kar stammer fra eksisterende retinale vener, strekker seg vanligvis langs den indre overflaten av netthinnen og vokser inn i glasslegemet (eller subretinalt rom under noen forhold)1. Det er et kjennetegn og vanlig trekk ved mange iskemiske retinopatier, inkludert retinopati av prematuritet (ROP), retinal vene okklusjon (RVO) og proliferativ diabetisk retinopati (PDR)2.

Tallrike kliniske og eksperimentelle observasjoner har indikert at iskemi er hovedårsaken til retinal neovaskularisering 3,4. I ROP blir nyfødte utsatt for oksygen på høyt nivå i lukkede inkubatorer for å øke overlevelsesraten, noe som også er en viktig driver for arrestasjon av vaskulær vekst. Etter at behandlingen er ferdig, opplever netthinnen til nyfødte en relativt hypoksisk periode5. Andre situasjoner ses ved okklusjon av sentrale eller grenede retinale vener i RVO, og skade på retinale kapillærer observeres også som skyldes mikroangiopati i PDR2. Hypoksi øker ytterligere uttrykket av angiogene faktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) gjennom den hypoksi-induserte faktor-1α (HIF-1α) signalveien som igjen styrer vaskulære endotelceller til å vokse inn i det hypoksiske området og danne nye kar 6,7.

ROP er en slags vaskulær proliferativ retinopati hos premature spedbarn og en ledende årsak til barndomsblindhet 8,9, som er preget av retinal hypoksi, retinal neovaskularisering og fibrøs hyperplasi10,11,12. På 1950-tallet fant forskerne at høy konsentrasjon av oksygen kan forbedre respiratoriske symptomer hos premature spedbarnbetydelig 13,14. Som et resultat ble oksygenbehandling i økende grad brukt hos premature spedbarn på den tiden15. Samtidig med den utbredte bruken av oksygenbehandling hos premature barn, økte imidlertid forekomsten av ROP år for år. Siden da har forskere koblet oksygen til ROP, og utforsket ulike dyremodeller for å forstå patogenesen til ROP og RNV16.

Hos mennesker er de fleste retinal vaskulaturutvikling fullført før fødselen, mens hos gnagere utvikler retinal vaskulatur etter fødselen, og gir et tilgjengelig modellsystem for å studere angiogenese i retinal vaskulatur2. Med den kontinuerlige utviklingen av forskningen har oksygenindusert retinopati (OIR) -modeller blitt viktige modeller for å etterligne patologisk angiogenese som følge av iskemi. Det er ingen spesifikke dyrearter i studien av OIR-modellen, og modellen er utviklet i ulike dyrearter, inkludert kattunge 17, rotte18, mus19, beagle valp 20 og sebrafisk21. Alle modellene deler den samme mekanismen som de blir utsatt for hyperoksi under tidlig retinal utvikling og deretter returnert til det normoksiske miljøet. Smith og medarbeidere observerte at eksponering av musevalper for hyperoksi fra P7 i 5 dager induserte en ekstrem form for karregresjon i den sentrale netthinnen og bringe dem tilbake til romluften ved P12 gradvis utløste neovaskulære tufter, som vokste mot glasslegemet19. Dette var en standardisert OIR-musemodell også kalt Smith-modell. Connor og medarbeidere optimaliserte protokollen ytterligere og ga en universelt anvendelig metode for å kvantifisere området VO (vaso-utslettelse) og NV (neovaskularisering) i 2009, noe som økte aksepten og utnyttelsen av modellen22. OIR-musemodellen er fortsatt den mest brukte modellen nå på grunn av sin lille størrelse, raske reproduksjon, klare genetiske bakgrunn, god repeterbarhet og høy suksessrate.

Hos mus starter retinal vaskularisering etter fødselen med innvekst av kar fra optisk nervehode inn i den indre netthinnen mot ora serrata. Under normal retinal utvikling spirer de første retinale karene fra optisk nervehode rundt fødselen, og danner et ekspanderende nettverk (den primære plexus) som når periferien rundt postnatal dag 7 (P7) 23. Deretter begynner karene å vokse inn i netthinnen for å danne et dypt lag, trenge inn i netthinnen og etablere et laminært nettverk rundt det indre kjernefysiske laget (INL) som i menneske24. Ved slutten av den tredje barseluken (P21) er dypere plexusutvikling nesten fullført. For OIR-musemodellen vises vaskulær okklusjon alltid i den sentrale netthinnen på grunn av den raske degenerasjonen av et stort antall umodne vaskulære nettverk i det sentrale området under hyperoxia-eksponering. Så forekommer veksten av patologisk neovaskularisering også i den midterste perifere netthinnen, som er grensen til ikke-perfusjonsområdet og det vaskulære området. Imidlertid har menneskelige retinale kar nesten dannet seg før fødselen. Når det gjelder premature spedbarn, blir den perifere netthinnen ikke fullstendig vaskularisert når den blir utsatt for hyperoksi25,26. Så vaskulær okklusjon og neovaskularisering forekommer hovedsakelig i perifer retina27,28. Til tross for disse forskjellene rekapitulerer muse-OIR-modellen nøye de patologiske hendelsene som oppstår under iskemi-indusert neovaskularisering.

Induksjonen av OIR-modellen kan deles inn i to faser29: i fase 1 (hyperoxia-fase) blir retinal vaskulær utvikling arrestert eller forsinket med okklusjon og regresjon av blodkar som følge av nedgangen i VEGF og apoptose av endotelceller 24,30; I fase 2 (hypoksifase) vil oksygentilførselen i netthinnen bli utilstrekkelig under romluftforhold29, noe som er avgjørende for nevral utvikling og homeostase 19,31. Denne iskemiske situasjonen resulterer vanligvis i uregulert, unormal neovaskularisering.

For tiden er den ofte brukte modelleringsmetoden vekslende høy / lav oksygeneksponering: Mødre og deres valper blir utsatt for 75% oksygen i 5 dager ved P7 etterfulgt av 5 dager i romluft til P17 viste sammenlignbare resultater22, som er endepunktet for OIR-musemodellinduksjon. (Figur 1). I tillegg til å simulere ROP, kan denne iskemimedierte patologiske neovaskulariseringen også brukes til å studere andre iskemiske retinale sykdommer. Hovedmålingene av denne modellen inkluderer kvantifisering av området VO og NV, som analyseres fra retinale flate fester ved immunfluorescensfarging eller FITC-dekstran perfusjon. Hver mus kan bare studeres en gang på grunn av den dødelige operasjonen. For tiden er det få metoder for å observere dynamiske endringer av retinal vaskulatur kontinuerlig under prosessen med vaskulær regresjon og patologisk angiogenese32. I dette papiret gir vi en detaljert protokoll for OIR-modellinduksjon, analyse av retinale flatfester, samt en arbeidsflyt av fluorescein fundus angiografi (FFA) på mus som vil være nyttig for å få en mer omfattende forståelse av vaskulære dynamiske endringer i to faser av OIR-musemodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer bruk av mus ble godkjent av dyreforsøkets etiske komité ved Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Kina (autorisert nummer: 2020-082), og i samsvar med de godkjente retningslinjene for dyrepleie og brukskomité for Zhongshan Ophthalmic Center og Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.

1. Induksjon av mus OIR-modell

  1. Bruk mus med lavere frekvens av medfødt misdannelse i øynene, for eksempel C57BL / 6J mus, og mate dem i forholdet mellom mann / kvinne = 1: 2. Få valpene født samme dag og begynn å indusere OIR-modellen på P7. Ta opp kroppsvekten til musevalper strengt før du modellerer.
    MERK: Noter fødselsdagen som P0. Ta opp vekten på hver mus regelmessig. Kroppsvekten til nyfødte valper er svært viktig under induksjonen av OIR, da følsomheten til mus i forskjellige tilstander for oksygen er forskjellig. Ekskluder valpene mer enn 5 g ved P7 for å sikre sammenlignbare resultater.
  2. Gi et passende bomiljø for ammende mødre og deres valper, for eksempel å sette temperaturen på 23 ° C ± 2 ° C, kontrollere fuktigheten ved 40% -65%, vekslende 12 timers lys og 12 timers mørke hver dag, legge til litt bomullsull i buret for hekking, sikre tilstrekkelig sterilisert mat og vann, og holde dem i individuelt ventilerte bur (IVC).
  3. Overvåk fuktighetsnivået og temperaturen inne i kammeret. Kontroller fuktigheten mellom 40 % og 65 % og hold temperaturen på 23 °C ± 2 °C.
  4. Kontroller oksygentilførselen med oksygensensorer, hold et konstant oksygennivå på 75 % og kontroller oksygenstrømningshastigheten ved 0,5–0,75 l/min. Sett 50 g sodakalk i bunnen av kammeret for å absorbere for mye CO2 og opprettholde CO2-verdier under 3%22.
  5. Overvåk atferden til ammende mødre som nestbyggingsadferd, bite valpene sine og nekte amming minst en gang om dagen. Eliminer ammende mødre med dårlig morskap.
  6. Plasser P7-valpene (hann og hunn) og deres ammende mødre i et oksygenkammer der oksygennivået er 75% i 5 dager til P12. Unngå unødvendig åpning av kammeret i perioden med modellinduksjon. Sørg for at det er ekstra surrogatmødre for erstatning, i tilfelle ammende mødre dør på grunn av lungeskade mens de er i hyperoksi.
    MERK: For å sikre sammenlignbarheten av eksperimentet, begrens antallet til 6-8 valper for hver mor. Vær oppmerksom på det potensielle problemet med oksygentoksisitet, noe som forårsaker død av noen ammende mødre. Tegn på hyperoksisk lungeskade hos ammende mødre inkluderer, men er ikke begrenset til, svingende respirasjonsfrekvens, redusert aktivitet og redusert fôring. Når fenomenet ovenfor oppstår, avliv den ammende moren med 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg) så snart som mulig. Forbered noen surrogatmødre, for eksempel 129S1 / SvImJ for erstatning og bruk dem bare om nødvendig. Det anbefales ikke å erstatte ammende mødre som en rutine, da dette vil føre til hyppig åpning av et oksygenkammer, noe som resulterer i ustabile oksygennivåer og mors aggresjon.
  7. Ta med valpene og deres ammende mødre tilbake til romluften på P12 og overvåk vekten av alle valpene kontinuerlig til P17. Grupper valpene basert på vekten for å sikre at hver forsøksgruppe har en lik vektfordeling.

2. Fremstilling av retinal hele fester og immunofluorescensfarging

  1. Ta opp kroppsvekten til valpene. Ofring av valpene ved overdosering av bedøvelse (1 % pentobarbitalnatrium 50 mg/kg) eller CO 2-inhalasjon. Andre metoder for eutanasi, som cervikal dislokasjon og bilateral torakotomi, kan brukes om nødvendig.
  2. Bruk buet saks for å frigjøre forbindelsen mellom øyeboller og orbitalvev. Deretter legger du buede tang i den bakre delen av øyebollet, klemmer optisk nerve og løfter øyet raskt ut fra bane. Vask øyebollene i en forkjølt 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) for å fjerne hår og blod fra overflaten av øyebollene.
  3. Plasser de rensede øyebollene i et 2 ml mikrosentrifugerør fylt med 4% paraformaldehyd (PFA) og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur på en shaker med en hastighet på 12-15 omdreininger per minutt (rpm) (første fiksering).
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd er kjent for å være allergifremkallende, generelt giftig og ekstremt cytotoksisk. Følg sikkerhetsinstruksjonene nøye og unngå innånding og hudkontakt.
  4. Bruk en kulturrett og legg en dråpe 1x PBS i den sentrale delen og utfør følgende trinn under et dissekeringsmikroskop og plasser ett øyeeple i denne dråpen. Hold øyeeplet med et par tang og punkter forsiktig hornhinnen på hornhinnen limbus ved hjelp av en 1 ml sprøytekanyle. Sett saksens spiss inn i dette hullet og klipp av hornhinnen forsiktig langs hornhinnen. Vær forsiktig så du ikke kutter netthinnen.
  5. Fjern iris og linse med et par tang. Plasser deretter den gjenværende øyekoppen i 4% PFA og fest igjen i ytterligere 45 minutter ved romtemperatur på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min (sekundær fiksering).
  6. Bruk en kulturrett og legg en dråpe 1x PBS i den sentrale delen. Plasser det faste øyebollet i denne dråpen. Hold øyebollet med et par tang. Skill forsiktig retina- og sclera-lagene ved hjelp av to tang. Plasser tuppen av saksen mellom netthinnen og sclera lagene og kutt sclera mot optisk nerve. Skrell sclera av netthinnen og få retinalkoppen.
    MERK: Hold den bakre koppen ved optisk nerve med tang, bruk deretter den buede enden av en annen tang for å trykke ned på sclera ved optisk nervehode og masser forsiktig ut netthinnen i en fremover feiende bevegelse som et alternativ til å frigjøre netthinnen.
  7. Bruk tang for å frigjøre forbindelsen mellom radiale hyaloidkar og perifer retina, klem roten av hyaloidkarene som er nær optisk nervehode, og kutt hyaloidkarene forsiktig av.
  8. Bruk en 2 ml pipette med spissen avskåret for å overføre netthinnekoppen. Plasser retinalkoppen i en brønn i en 48-brønns plate og vask den i 3 x 5 minutter med 1x PBS ved romtemperatur på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min.
  9. Inkuber netthinnekoppen i en blandet oppløsning på 1 % Triton X-100 (i PBS) og 5 % normalt eselserum (i PBS) over natten ved 4 °C.
    1. Alternativt blokkere og permeabilisere netthinner ved romtemperatur i 1 time som et alternativ. Bytt blokkerende serum i henhold til kilden til det sekundære antistoffet.
  10. Hvis du merker retinal vaskulaturen ved hjelp av Isolectin B4, inkuberer netthinnen i en brønn med 48-brønnsplate med 0,1% normalt eselserum (400 μL) og IsolectinB4-594 (1:400) over natten ved 4 ° C på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min.
    MERK: Hvis du merker blodårene med andre markører, for eksempel CD31, eller merker andre celler, bruk spesifikke primære antistoffer for å merke dem.
  11. Inkuber netthinnen med 1:100-1:500 spesifikke primære antistoffer (i 400 μL 0,1% normalt eselserum) ved 4 °C på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min i 48 timer (valgfritt)
  12. Etter å ha kommet tilbake til romtemperaturen, vask netthinnen med 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 i PBS) i 3 x 20 minutter på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min.
  13. Inkuber netthinnen med 1: 1000 sekundære antistoffer (i 400 μL 0,1% normalt eselserum) over natten ved 4 ° C på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min. (valgfritt)
    1. Alternativt kan du inkubere netthinnen med sekundære antistoffer med høy affinitet ved romtemperatur i 1 time.
  14. Inkuber netthinnen med DAPI (1: 1000) ved romtemperatur i 20-25 minutter for å merke kjernen.
    MERK: Test de optimale fortynningsforholdene for alle antistoffene som brukes i trinn 10-11 og 13-14 i pre-eksperimentet.
  15. Vask netthinnen i 3 x 30 min med 0,1% PBST på en shaker med en hastighet på 12-15 o / min ved romtemperatur.
  16. Overfør netthinnekoppen til et rent lysbilde med åpningen vendt oppover. Klipp netthinnen radialt ved 3, 6, 9 og 12 o'clock posisjoner fra perifert til sentralt ved å kutte ca 1-1,5 mm vekk fra optisk nerve hodet.
  17. Tilsett noen dråper 1x PBS for å skylle netthinnen tre ganger. Bruk luftlagt papir til å tørke og flate netthinnen. Legg til en dråpe monteringsmedium (se Materialfortegnelse) i midten av dekselet og slutt å legge det til diameteren på dråpen øker til halvparten av dekselet. Snu dekselet raskt og legg det på toppen av den utspredte netthinnen. Unngå å danne bobler.
  18. Ta bilder av netthinnen eller oppbevar og beskytt lysbildene mot lys ved 4 °C.

3. Analyse og kvantifisering av retinal flate fester

MERK: For OIR-musemodellen registrerer forskerne ofte området med sentral retinal vaskulær okklusjon og perifer retinal patologisk neovaskularisering under P12-P25. Tidligere studier har vist at det sentrale avaskulære området av netthinnen når maksimum ved P12 og gradvis krymper fra P13 til P17; samtidig når netthinnen til OIR-mus toppen av neovaskulariseringsområdet på rundt P1722,29. Fra P17 går neovessels gradvis tilbake og funksjonelle kar vokser tilbake til det avaskulære området. Retinal vaskulaturen går i utgangspunktet tilbake til normal ved P2533.

  1. Ta bilder av retinal flate fester med et fluorescensmikroskop (se Materialfortegnelse) med 10x objektivlinse. Velg først DAPI-kanalen og sett det optiske nervehodet i midten av synsfeltet. Juster deretter andre kanaler og fokuser på overfladisk vaskulatur i netthinnen. Sjekk fliser i et bildeprogram (se Materialfortegnelse) og angi antall bilder som må sys. Klikk på Start eksperiment for å fange hele netthinnen.
  2. Bruk et bildebehandlingsprogram (se Materialtabell) for å kvantifisere området for vaso-utslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) etter immunfluorescensfarging.
    1. Klikk først på tryllestavverktøyet og angi en passende toleranse i henhold til forskjellen i lysstyrke og flytt markøren til bakgrunnen og klikk på musen. Velg deretter Select Inverse for å få en grunnleggende oversikt over netthinnen. Bruk lassoverktøyet til å skissere detaljene i netthinnen ytterligere. Bruk Histogram-funksjonen til å registrere pikselverdien til hele netthinnen og skrive den ned eller generere en tabell i et databaseprogram.
    2. Del netthinnebildet i fire kvadranter. I hver kvadrant bruker du lassoverktøyet til å tegne VO-området (figur 2A-C), og bruker tryllestavverktøyet til å velge NV-området (figur 2D-F). Gjennom pikselinformasjonen i histogrammet beregner du pikselforholdet mellom VO og NV til hele netthinnen, det vil si prosentandelen av VO- eller NV-området i forhold til hele netthinnen.
      MERK: Det er også en åpen kildekode og helautomatisk rørledning for kvantifisering av VO- og NV-områder i OIR-bilder ved hjelp av dype læringsnevrale nettverk (http://oirseg.org/), som gir en pålitelig og tidsbesparende måte for forskere, samt forener standarden på kvantifiseringen34.
  3. Registrer pikselinformasjon i en regnearktabell, som er praktisk for senere analyse.

4. In vivo avbildning med fluorescein fundus angiografi (FFA)

MERK: For OIR-mus kan både FITC-perfusjon og immunfluorescensfarging bare brukes i en gang på grunn av eksperimentelle dyrs død. Sammenlignet med dette er en av fordelene med FFA observasjonen av de dynamiske endringene av mus retinale kar under utvikling og patologisk tilstand in vivo35,36.

  1. Vei valpene før anestesi.
  2. Bedøv avkom ved intraperitoneal injeksjon av 0,3% pentobarbitalnatrium i en dose på 30-50 mg/kg.
    MERK: For mus innen 1 måned, vær oppmerksom på bedøvelsesdosene. Bruk lavere konsentrasjoner og doser av bedøvelse for å redusere død av mus forårsaket av anestesi. Etter at valpene er bedøvet, bruk en liten varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen. Hypotermi påvirker ikke bare valpens fysiologiske funksjon, men fører også til endringer i krystallin og akselererer utviklingen av grå stær.
  3. Bruk 20 μL mydriatiske øyedråper (0,5 % tropicamid + 0,5 % fenylefrinhydroklorid) for hver avkom og vent i 5 minutter for å oppnå langvarig pupilutvidelse (figur 3A,B).
  4. Ta med de bedøvede valpene foran bildebehandlingsapparatet (se Materialfortegnelse). Hold valpene på en liten varmepute, plasser valpene i en stabil stilling, og bruk kunstige tårer regelmessig for å opprettholde fuktighet i hornhinnen. Klikk på modusen for infrarød Fundus Imaging (IR) for å justere optisk nervehode til midten av skjermen.
    MERK: Når du observerer det ene øyet til valpene, ikke glem å beskytte det andre øyet. Bruk Hypromellose øyedråper for å forhindre at hornhinnen bleker på grunn av tørrhet.
  5. Etter intraperitoneal injeksjon av 0,15 ml 0,5 % fluoresceinnatriumsaltoppløsning, klikk på FA-knappen og injeksjonsknappen umiddelbart på berøringspanelet på bildebehandlingsenheten for å starte timingen. Ta opp bildene etter 3 minutter når blodsirkulasjonen av netthinnen kommer inn i venøs fase og observer netthinnen ikke mindre enn 6-8 min.
    MERK: Etter intraperitoneal injeksjon av fluorescein natriumsaltløsning, viser huden, slimhinnen og urinen til valpene tydelig gulgrønn. Det meste av fluorescein utskilles av valpene innen en dag. Injisering av fluoresceinnatrium intraperitonealt annenhver dag i seks ganger forårsaker ikke signifikante bivirkninger37.
  6. Flytt det optiske nervehodet til midten av bildeopptaksområdet og ta det første bildet av den sentrale netthinnen. Flytt deretter linsen til bildebehandlingsenheten horisontalt til nesesiden av øyet til det optiske nervehodet er plassert midt på den ene siden av bildeopptaksområdet og ta det andre bildet. Fortsett å ta bilder av henholdsvis temporal, superior og inferior retina ved hjelp av denne metoden (figur 3C).
    MERK: Ta bilder med fem retninger innen 12 minutter når regresjonsfasen oppstår. Posisjonen til det optiske nervehodet i det nedre bildet får ikke falle på sidelinjen på grunn av objektivets begrensede vinkeljustering.
  7. Lagre bildene og bruk et bildebehandlingsprogram for søm.

5. Bildebehandling av fluorescein fundus angiografi (FFA)

  1. Åpne bildebehandlingsprogrammet og klikk på Ny i fil for å lage et nytt lerret med svart bakgrunn (figur 4A).
  2. Åpne et bilde av den sentrale netthinnen først i bakgrunnslaget. Klikk på Fil og legg til det andre bildet. Juster opasiteten til det andre bildet til 60 %, flytt og endre størrelsen på det andre bildet til de samme delene av de to bildene overlapper hverandre. Klikk på knappen Bytt mellom fri transformasjon og fordreiningsmodus og gjør subtile justeringer av fartøyene om nødvendig. Deretter skrur du opasiteten til det andre bildet tilbake til 100 % (figur 4A, B).
  3. Velg to bilder samtidig og klikk på Auto-Blend Layers. Kontroller Panorama som blandingsmetode, og velg deretter følgende to setninger. Klikk på OK og fullfør bildesømmen av de to første bildene (figur 4C, D).
  4. Ta de to første sydde bildene som en helhet, legg til det tredje bildet, og fortsett å blande. Gjenta metodene ovenfor for å fullføre sømmen av fem bilder (figur 4E).
  5. Bruk beskjæringsverktøyet til å klippe bilder av FFA på forskjellige tidspunkter til en jevn størrelse og observere dynamiske endringer av retinal vaskulatur fra P15 til P25 hos både normale og OIR-valper.

6. Statistisk analyse

  1. Nåværende verdier som gjennomsnitt ± standardavvik (s.d.).
  2. Bruk Student t-testen til å sammenligne to uavhengige utvalg. Bruk One-Way ANOVA til å sammenligne flere datasett og kombinere med Dunnett eller Tukeys test, som er en ofte brukt multippel sammenligningstest.
  3. For ikke-normalfordelte data benyttes Mann-Whitney U test eller Kruskal Wallis test. Vurder signifikante statistiske forskjeller når P < 0, 05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I OIR-musemodellen er det viktigste og grunnleggende resultatet kvantifiseringen av VO- og NV-området. Etter å ha levd i hyperoksimiljøet i 5 dager fra P7, viste den sentrale netthinnen til valpene det største ikke-perfusjonsområdet. Under stimulering av hypoksi i ytterligere 5 dager ble retinal neovaskularisering gradvis produsert som fluorescerte mer intenst enn omkringliggende normale kar. Etter P17 gikk fluorescenssignalet til patologisk neovaskularisering raskt tilbake som ombygging av netthinnen (figur 5A). Ved å kontrollere kullstørrelsen og postnatal vektøkning av valpene, viste området av VO og NV av OIR-musemodellen god repeterbarhet og stabilitet, og toppen av retinal neovaskularisering skjedde ved P17, som var i tråd med tidligere studier (figur 5B, C).

FFA er et ideelt verktøy for å studere retinal vaskulatur. Gitt anvendelsen av FFA in vivo, viser den en stor reduksjon i avfallet av eksperimentelle dyr, samt viser de dynamiske endringene i retinalkarene med tiden. I tidligere studier ble FFA ikke ofte brukt hos musunger og ble presentert i et enkeltbilde, noe som var vanskelig for videre studier. I denne protokollen ble "Fem-orientering" -bildene av retina-vaskulaturen sydd sammen ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare for å vise et bredere felt av netthinnen på en gang, noe som var nyttig for senere analyse, om nødvendig (figur 4). Dessuten viste OIR-musevalpene en langvarig øyeåpning, slik at FFA-bildene ble tatt fra P15 for å oppfylle kravene til dyreetikk. I netthinnen til OIR-musemodellen økte diameteren av blodkar tydelig og ble svært tortuøs når man sammenlignet med normale mus. FFA viste dessuten en tilsvarende trend med dynamiske forandringer av retinal vaskulatur med immunfluorescensfarging med isolektin B4-594 fra P15-P25 uten avkommets død (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Tegneserieskjematisk av OIR-musemodell. OIR-musemodellen ble indusert ved å holde valper og deres ammende mødre i et rom i noen tid (P0-P7). Ved P7 ble begge utsatt for 75% oksygen i 5 dager, noe som hemmet retinal fartøyvekst og forårsaket betydelig tap av fartøy i den sentrale netthinnen. Mus ble deretter brakt tilbake til romluften ved P12, og den avaskulære netthinnen begynte å bli relativt hypoksisk, noe som utløste både normal gjenvekst av karet og en patologisk respons rundt den midtre perifere netthinnen. Maksimal neovaskularisering (NV) ble sett ved P17. Deretter gjennomgikk patologisk neovaskularisering en prosess med spontan regresjon. Det retinale vaskulære systemet var tilbake til normalt igjen rundt P25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Måling av vaso-utslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) i musehinnen. (A) Bilde av 10x P12 OIR retinal helmontert farget for endotelceller med isolektin B4-594. (B) Skjermbilde av en netthinne med det avaskulære området valgt. Verktøy som er nødvendige for å gjøre denne målingen, er uthevet med hvite piler: Magic Wand Tool og Lasso Tool. (C) det avaskulære området av netthinnen og lagre bildet som en kopi. (D) Bilde av 10x P17 OIR retinal helmontert farget for endotelceller med isolektin B4-594. (E) Skjermbilde av en netthinne med neovaskulære tufter valgt. Bruk Magic Wand Tool og angi en optimal toleranse for å markere NV. Sett toleransen til 3-5 og merk av for anti-alias og sammenhengende bokser. (F) Lagre neovaskulariseringsområdet bare som en kopi. Skalastenger representerer 1,000 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oppkjøp av "Fem-orientering" -bildene i musehinnen. (A) Den normale museeleven. (B) Muselev i mydriasis. (C) Bildene med "fem orienteringer" av henholdsvis det sentrale, nasale, tidsmessige, overordnede og nedre området av netthinnen ble samlet inn (P17 valper i romluft). Skalastenger representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Generell arbeidsflyt for søm av "Fem-orientering" bilder fra fluorescein fundus angiografi (FFA). (A) Lag et nytt lerret med svart bakgrunn og åpne FFA-bildet av den sentrale netthinnen. (B) Åpne et FFA-bilde av den temporale netthinnen og juster opasiteten til det andre bildet til 60%; Flytt og endre størrelsen på bildet til de samme delene av de to bildene overlapper hverandre. Klikk på Bytt mellom Free Transform og Warp Modes for å gjøre subtile justeringer om nødvendig. Vri opasiteten til det andre bildet tilbake til 100 %. (C) Velg to bilder samtidig og klikk på Auto-Blend Layers. (D) Bruk panorama som blandingsmetode for å fullføre bildesømmen av de to første bildene. (E) Fortsett å sy sammen bilder ved å gjenta metodene ovenfor for å fullføre sømmen av alle bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kvantifisering av vaso-utslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) i netthinnen til OIR-musemodellen. (A) Bilde av 10x OIR retinal helmonteringer farget for endotelceller med isolektin B4-594 fra P12 til P25. Etter å ha blitt utsatt for 75% oksygen i 5 dager, ble valper og deres ammende mødre brakt tilbake til romluften på P12 hvor området med vaso-utslettelse nådde maksimum. Den relative hypoksien i den sentrale netthinnen førte til gjenvekst av blodkar i dette området, samt patologisk angiogenese i den midtre perifere netthinnen. Ved P17 nådde pre-retinal neovaskulære tufter maksimalt og krympet deretter raskt. NV gikk helt tilbake og netthinnen så ut til å være normal på rundt P25. (B) Kvantifisering av området til VO viste en topp på P12 og forsvinning på rundt P25. (C) Kvantifisering av NV-området viste en topp på P17 og regresjon på rundt P25. Skalastenger representerer 1 000 μm i A. (enveis ANOVA, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: In vivo avbildning av fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musemodellen. I netthinnen til OIR-musemodellen økte diameteren av blodkar tydelig og ble svært tortuøs når man sammenlignet med normale mus. Dessuten viste FFA en lignende trend med dynamiske endringer av retinal vaskulatur med immunfluorescensfarging med isolectin B4-594 fra P15-P25 uten død av muspupper. Skalastenger representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Musens følsomhet for OIR påvirkes av mange faktorer. Valpene med ulik genetisk bakgrunn og stammer kan ikke sammenlignes. I BALB / c albino mus, fartøy regrow inn i VO området raskt med betydelig redusert neovaskulær tufts38, noe som bringer noen vanskeligheter for forskningen. I C57BL/6 mus er det økt fotoreseptorskade sammenlignet med BALB/cJ musestamme39,40. Det samme gjelder for forskjellige typer transgene mus41,42,43. Dessuten viser C57BL / 6 mus et lavere nivå av angiogenese sammenlignet med 129S3 / SvIM mus44.

Postnatal vektøkning (PWG) er også viktig å vurdere45 og er en av indikatorene for å evaluere ernæringsstatus hos nyfødte. Det har også blitt en pålitelig metode for å forutsi ROP, som tiltrekker seg oppmerksomheten til mange dyremodellere46. PWG påvirker responsen til mus til hyperoksi og hypoksi. Ved P7 viser avkom med økt kroppsvekt (>5 g) utilstrekkelig vaso-utslettelse og retinal neovaskularisering, mens avkom med redusert kroppsvekt (<5 g) viser åpenbar respons på hyperoksi og hypoksi. Dessuten, ved P17, viser valper med dårlig (<5 g) og omfattende (>7,5 g) vektøkning en redusert NV. Imidlertid har valper med dårlig vektøkning (<5 g) signifikant forlenget vaso-utslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) stadium med en forsinkelse i forekomsten av NV topp45. Derfor er det nødvendig å registrere og kontrollere PWG av valper ved P7 og P17 og eliminere valper med lav PWG (< 6 g ved P17) for å sikre repeterbarhet og sammenlignbarhet av eksperimentet.

Kullstørrelsen har større innvirkning på PWG, og noen forskere foreslår at den bør begrenses til 6-8 valper / dam for å oppfylle kravene til PWG22,31. Tilstanden til den ammende moren trenger også en vurdering. Ammende mødre er mer sannsynlig å dø av lungeskade i et hyperoksisk miljø47. Hvis ammende mødre dør eller forsømmer valpene sine under og etter induksjonen av OIR, vil valpene lett gå ned i vekt eller til og med dø på grunn av mangel på ernæring32. Derfor er det nødvendig å sikre at det er nok surrogatmødre til å erstatte dem. Imidlertid foreslås disse surrogatmødrene å bare brukes når moren utløper, noe som vanligvis skjer i perioden med hyperoksieksponering eller tilbake til romluften22. Å gi tilstrekkelig mat til ammende mødre er også nyttig for å forbedre ernæringsstatusen til valpene sine.

Et nyttig notat for å forberede retinal flate fester er at en optimal fikseringstid vanligvis er nødvendig for ytterligere langvarig farging. Som mus av P12-P25 anbefales en 15 min + 45 min fiksering ved romtemperatur29. Å feste netthinnen ved 4 °C over natten er et alternativ hvis tiden er begrenset. Dessuten reduserer den permeable og blokkerende bufferen med en høyere konsentrasjon på 1% Triton X-100 og 5% normalt eselserum effektivt bakgrunnen for immunfluorescensfarging i henhold til vår erfaring.

Isolectin B4-farging og FITC-dekstranperfusjon er ofte brukte metoder for å visualisere og kvantifisere neovaskulær48,49. En stor begrensning ved disse to metodene er at musene må ofres. Så metodene for in vivo avbildning og kvantifisering av NV er nødvendig29. Paques og medarbeidere utviklet en teknikk kalt aktuell endoskopi fundus imaging (TEFI), som gir høyoppløselige digitale fotografier av netthinnen i levende mus50. TEFI kan påvise retinale vaskulære forandringer så tidlig som P15, og bildene som er oppnådd er i samsvar med konvensjonelle vurderingsmetoder. Mezu-Ndubuisi og medarbeidere ga deretter metodene for in vivo retinal vaskulær oksygenspenning (PO2) målinger og fluoresceinangiografi (FA), og forbedret forståelsen av retinale vaskulære forandringer og oksygeneringsendringer på grunn av ROP og andre iskemiske retinale sykdommer37. Selv om verken TEFI eller FA er like nøyaktige som konvensjonelle metoder, reduserer de forsøksdyrs død og kan utføres gjentatte ganger. Dessuten lar de hver mus tjene som sin egen kontroll, og dermed gjøre OIR-dataene mer sammenlignbare. I denne artikkelen er det gitt en forbedret metode for FFA-bildebehandling og bildesøm. Å utføre FFA på valper innen 1 måned er ikke lett fordi overdreven anestesi og hypotermi direkte forårsaker valpens død. Prøv derfor å bruke minimumsdosen av anestesi og vær spesielt oppmerksom på å opprettholde kroppstemperaturen til valper gjennom og etter prosessen ved å bruke en liten varmepute. Fukt alltid den okulære overflaten med saltvann og hypromellose i tilfelle feil i følgende observasjon.

Oppsummert er OIR-musemodellen en svært vanlig og mye brukt modell av retinal iskemi og patologisk neovaskularisering. Et av de største problemene med denne modellen er at de nyfødte musene i hovedsak er sunne og ikke har metabolsk ustabilitet eller luftveisproblemer sammenlignet med for tidlig fødte spedbarn. En annen forskjell mellom OIR-musemodellen og mennesker er at det alltid er fibrovaskulær proliferasjon i human retinal neovaskularisering, mens retinal neovaskulær ikke er assosiert med fibrose i OIR-musemodellen51. For å utnytte denne modellen bedre og skaffe seg mer informasjon, er det gitt en detaljert beskrivelse av bruk av FFA for å overvåke de dynamiske endringene i OIR retinal vaskulatur, inkludert metodene for å ta "Femorientering" -bilder og bildebehandling. Det antas at FFA vil bli en effektiv metode helt eller delvis for å erstatte immunfluorescensfargingen for å observere og evaluere morfologien og funksjonen til retinal vaskulatur49. Selv om OIR-musemodellen ikke fullt ut ligner mikromiljøet og patogenesen av ulike iskemisk retinopati hos mennesker, gir den oss en mulighet til å utføre narkotika- og transgene eksperimenter, samt å utforske mekanismen for patologisk angiogenese på iskemisk retina51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmene fra vårt laboratorium og oftalmiske dyrelaboratorium i Zhongshan Ophthalmic Center for deres tekniske assistanse. Vi takker også professor Chunqiao Liu for eksperimentell støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Beijing, Kina), Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (Grant No.2019A1515011347), og høyt nivå sykehusbyggingsprosjekt fra State Key Laboratory of Ophthalmology ved Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sterile syringe Solarbio YA0550 For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech  FG701-01 For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube Corning MCT-200-C For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3548 For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides Various For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019 Adobe Inc. For image analysis
Carbon dioxide gas Various For sacrifice
Cover slide Various For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps World Precision Instruments 14127 For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution Abcam ab228549 For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope Olmpus SZ61 For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium Sigma-Aldrich F6377 For in vivo imaging
Fluorescent Microscope  Zeiss AxioImager.Z2 For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech  0100-01 For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose Maya 89161 For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody Invitrogen I21413 For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J GemPharmatech of Jiangsu Province For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242 For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps World Precision Instruments  501978-6 For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum Abcam ab7475 For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor Various For monitoring the level of O2
OxyCycler Biospherix A84XOV For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG For tissue fixation
Pentobarbital sodium Various For anesthesia
Soda lime Various For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT Heidelberg HC00500002 For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0 IBM For statistical analysis
Tansference decloring shaker Kylin-Bell ZD-2008 For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment) Corning 3261-20EA For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes Various For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100 Sigma-Aldrich  SLBW6818 For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide Various For in vivo imaging
ZEN Imaging Software ZEISS For image acquisition and export

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
  4. Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), Pt 2 7-17 (1957).
  5. Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
  6. Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473 (2018).
  7. Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
  8. Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O'Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
  9. Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
  10. Fielder, A., Blencowe, H., O'Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
  11. Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 7 Suppl 69-73 (2006).
  12. Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
  13. Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
  14. Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
  15. Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
  16. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  17. Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
  18. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  19. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  20. McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
  21. Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748 (2008).
  22. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  23. Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
  24. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  25. Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241 (2017).
  26. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  27. Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
  28. Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
  29. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  30. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
  31. Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  32. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  33. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  34. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
  35. McLeod, D. S., D'Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
  36. Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
  37. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  38. Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546 (2014).
  39. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  40. Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
  41. Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
  42. Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
  43. Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
  44. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  45. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  46. Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
  47. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  48. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
  49. Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
  50. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  51. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).

Tags

Biologi utgave 170
Overvåking av dynamisk vekst av retinale kar i oksygenindusert retinopati musemodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic… More

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model. J. Vis. Exp. (170), e62410, doi:10.3791/62410 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter