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Biology

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/62410
Automatic Translation
1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

Summary

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Abstract

La retinopatia indotta da ossigeno (OIR) è ampiamente utilizzata per studiare la crescita anormale dei vasi nelle malattie ischemiche della retina, tra cui la retinopatia della prematurità (ROP), la retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e l'occlusione venosa retinica (RVO). La maggior parte degli studi OIR osserva la neovascolarizzazione retinica in punti temporali specifici; tuttavia, la crescita dinamica dei vasi nei topi vivi lungo un corso temporale, che è essenziale per comprendere le malattie dei vasi correlate all'OIR, è stata poco studiata. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per l'induzione del modello murino OIR, evidenziando le potenziali insidie e fornendo un metodo migliorato per quantificare rapidamente le aree di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) utilizzando la colorazione con immunofluorescenza. Ancora più importante, abbiamo monitorato la ricrescita dei vasi in topi vivi da P15 a P25 eseguendo l'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA) nel modello murino OIR. L'applicazione di FFA al modello murino OIR ci consente di osservare il processo di rimodellamento durante la ricrescita dei vasi.

Introduction

La neovascolarizzazione retinica (RNV), definita come uno stato in cui nuovi vasi patologici hanno origine da vene retiniche esistenti, di solito si estende lungo la superficie interna della retina e cresce nello spazio vitreo (o sottoretinico in alcune condizioni)1. È un segno distintivo e una caratteristica comune di molte retinopatie ischemiche, tra cui la retinopatia del prematuro (ROP), l'occlusione venosa retinica (RVO) e la retinopatia diabetica proliferativa (PDR)2.

Numerose osservazioni cliniche e sperimentali hanno indicato che l'ischemia è la causa principale della neovascolarizzazione retinica 3,4. Nella ROP, i neonati sono esposti ad ossigeno ad alto livello in incubatori chiusi per aumentare i tassi di sopravvivenza, che è anche un importante fattore per l'arresto della crescita vascolare. Dopo il trattamento, le retine dei neonati sperimentano un periodo relativamente ipossico5. Altre situazioni sono osservate nell'occlusione delle vene retiniche centrali o ramificate nella RVO e si osserva anche un danno dei capillari retinici causato dalla microangiopatia nella PDR2. L'ipossia aumenta ulteriormente l'espressione di fattori angiogenici come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) attraverso la via di segnalazione del fattore 1α indotto dall'ipossia (HIF-1α) che a sua volta guida le cellule endoteliali vascolari a crescere nell'area ipossica e formare nuovi vasi 6,7.

La ROP è una sorta di retinopatia proliferativa vascolare nei neonati pretermine e una delle principali cause di cecità infantile 8,9, che è caratterizzata da ipossia retinica, neovascolarizzazione retinica e iperplasia fibrosa10,11,12. Nel 1950, i ricercatori hanno scoperto che un'alta concentrazione di ossigeno può migliorare significativamente i sintomi respiratori dei neonati prematuri13,14. Di conseguenza, l'ossigenoterapia è stata sempre più utilizzata nei neonati prematuri in quel momento15. Tuttavia, in concomitanza con l'uso diffuso dell'ossigenoterapia nei neonati pretermine, l'incidenza della ROP è aumentata di anno in anno. Da allora, i ricercatori hanno collegato l'ossigeno alla ROP, esplorando vari modelli animali per comprendere la patogenesi di ROP e RNV16.

Nell'uomo, la maggior parte dello sviluppo vascolare retinico è completato prima della nascita, mentre nei roditori la vascolarizzazione retinica si sviluppa dopo la nascita, fornendo un sistema modello accessibile per studiare l'angiogenesi nella vascolarizzazione retinica2. Con il continuo progresso della ricerca, i modelli di retinopatia indotta da ossigeno (OIR) sono diventati modelli importanti per imitare l'angiogenesi patologica derivante dall'ischemia. Non ci sono specie animali specifiche nello studio del modello OIR e il modello è stato sviluppato in varie specie animali, tra cui gattino 17, ratto18, topo19, cucciolo di beagle 20 e zebrafish21. Tutti i modelli condividono lo stesso meccanismo con cui sono esposti all'iperossia durante lo sviluppo precoce della retina e poi restituiti all'ambiente normossico. Smith et al. hanno osservato che l'esposizione di cuccioli di topo all'iperossia da P7 per 5 giorni ha indotto una forma estrema di regressione dei vasi nella retina centrale e riportandoli all'aria della stanza a P12 ha gradualmente innescato ciuffi neovascolari, che sono cresciuti verso il corpo vitreo19. Questo era un modello di topo OIR standardizzato chiamato anche modello di Smith. Connor et al. hanno ulteriormente ottimizzato il protocollo e fornito un metodo universalmente applicabile per quantificare l'area di VO (vaso-obliterazione) e NV (neovascolarizzazione) nel 2009, che ha aumentato l'accettazione e l'utilizzo del modello22. Il modello murino OIR è ancora il modello più utilizzato ora a causa delle sue piccole dimensioni, della riproduzione veloce, del chiaro background genetico, della buona ripetibilità e dell'alto tasso di successo.

Nei topi, la vascolarizzazione retinica inizia dopo la nascita con la crescita dei vasi dalla testa del nervo ottico nella retina interna verso l'ora serrata. Durante il normale sviluppo retinico, i primi vasi retinici spuntano dalla testa del nervo ottico intorno alla nascita, formando una rete in espansione (il plesso primario) che raggiunge la periferia intorno al giorno postnatale 7 (P7) 23. Quindi i vasi iniziano a crescere nella retina per formare uno strato profondo, penetrare nella retina e stabilire una rete laminare attorno allo strato nucleare interno (INL) come nell'uomo24. Entro la fine della terza settimana postnatale (P21), lo sviluppo del plesso più profondo è quasi completato. Per il modello murino OIR, l'occlusione vascolare appare sempre nella retina centrale a causa della rapida degenerazione di un gran numero di reti vascolari immature nella regione centrale durante l'esposizione all'iperossia. Quindi, la crescita della neovascolarizzazione patologica si verifica anche nella retina medio-periferica, che è il confine dell'area di non perfusione e dell'area vascolare. Tuttavia, i vasi retinici umani si sono quasi formati prima della nascita. Per quanto riguarda i neonati prematuri, la retina periferica non è completamente vascolarizzata quando esposta all'iperossia25,26. Quindi l'occlusione vascolare e la neovascolarizzazione compaiono principalmente nella retina periferica27,28. Nonostante queste differenze, il modello OIR murino ricapitola da vicino gli eventi patologici che si verificano durante la neovascolarizzazione indotta da ischemia.

L'induzione del modello OIR può essere suddivisa in due fasi29: nella fase 1 (fase iperoxia), lo sviluppo vascolare retinico viene arrestato o ritardato con occlusione e regressione dei vasi sanguigni a seguito del declino del VEGF e dell'apoptosi delle cellule endoteliali 24,30; Nella fase 2 (fase ipossia), l'apporto di ossigeno retinico diventerà insufficiente in condizioni di aria ambiente29, che è essenziale per lo sviluppo neurale e l'omeostasi 19,31. Questa situazione ischemica di solito si traduce in neovascolarizzazione anomala non regolata.

Attualmente, il metodo di modellazione comunemente usato è l'alternanza di esposizione all'ossigeno alto/basso: le madri e i loro cuccioli sono esposti al 75% di ossigeno per 5 giorni a P7 seguiti da 5 giorni in aria ambiente fino a quando P17 ha dimostrato risultati comparabili22, che è il punto finale dell'induzione del modello murino OIR. (Figura 1). Oltre a simulare la ROP, questa neovascolarizzazione patologica mediata da ischemia può essere utilizzata anche per studiare altre malattie ischemiche della retina. Le principali misurazioni di questo modello includono la quantificazione dell'area di VO e NV, che vengono analizzate da supporti piatti retinici mediante colorazione con immunofluorescenza o perfusione FITC-destrano. Ogni topo può essere studiato solo una volta a causa dell'operazione letale. Allo stato attuale, ci sono pochi metodi per osservare continuamente i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica durante il processo di regressione vascolare e angiogenesi patologica32. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato di induzione del modello OIR, analisi di supporti piatti retinici e un flusso di lavoro di angiografia del fondo oculare (FFA) con fluoresceina sui topi che sarebbe utile per ottenere una comprensione più completa dei cambiamenti dinamici vascolari durante due fasi del modello murino OIR.

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Protocol

Tutte le procedure che prevedono l'uso di topi sono state approvate dal comitato etico sperimentale sugli animali del Centro oftalmico di Zhongshan, Sun Yat-sen University, Cina (numero autorizzato: 2020-082) e in conformità con le linee guida approvate del Comitato per la cura e l'uso degli animali del Centro oftalmico di Zhongshan e la dichiarazione dell'Associazione di ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Induzione del modello OIR del topo

  1. Utilizzare topi con un tasso inferiore di malformazione congenita degli occhi, ad esempio topi C57BL / 6J, e accoppiarli con un rapporto maschio / femmina = 1: 2. Fai nascere i cuccioli lo stesso giorno e inizia a indurre il modello OIR a P7. Registra il peso corporeo dei cuccioli di topo rigorosamente prima della modellazione.
    NOTA: Notare il giorno di nascita come P0. Registra regolarmente il peso di ciascun mouse. Il peso corporeo dei cuccioli appena nati è molto importante durante l'induzione dell'OIR poiché la sensibilità dei topi in diversi stati all'ossigeno è diversa. Escludere i cuccioli più di 5 g a P7 per garantire risultati comparabili.
  2. Fornire un ambiente di vita adatto per le madri che allattano e i loro cuccioli, come impostare la temperatura a 23 ° C ± 2 ° C, controllare l'umidità al 40% -65%, alternare 12 ore di luce e 12 ore di buio ogni giorno, aggiungere un po 'di cotone idrofilo alla gabbia per nidificare, garantire cibo e acqua sterilizzati adeguati e tenerli in gabbie ventilate individualmente (IVC).
  3. Monitorare il livello di umidità e temperatura all'interno della camera. Controllare l'umidità tra il 40% e il 65% e mantenere la temperatura a 23 °C ± 2 °C.
  4. Controllare l'apporto di ossigeno con sensori di ossigeno, mantenere un livello di ossigeno costante al 75% e controllare la portata di ossigeno a 0,5-0,75 L / min. Mettere 50 g di calce gassata sul fondo della camera per assorbire l'eccesso di CO2 e mantenere i valori di CO2 al di sotto del 3%22.
  5. Monitorare i comportamenti delle madri che allattano come il comportamento di costruzione del nido, mordere i loro cuccioli e rifiutare l'allattamento almeno una volta al giorno. Eliminare le madri che allattano con scarsa maternità.
  6. Mettere i cuccioli P7 (maschi e femmine) e le loro madri che allattano in una camera di ossigeno in cui il livello di ossigeno è del 75% per 5 giorni a P12. Evitare l'apertura non necessaria della camera durante il periodo di induzione del modello. Assicurarsi che ci siano madri surrogate extra per la sostituzione, nel caso in cui le madri che allattano muoiano a causa di lesioni polmonari durante l'iperossia.
    NOTA: Per garantire la comparabilità dell'esperimento, limitare il numero a 6-8 cuccioli per ogni madre. Prestare attenzione al potenziale problema della tossicità dell'ossigeno, che causa la morte di alcune madri che allattano. I segni di danno polmonare iperossico nelle madri che allattano includono, ma non sono limitati a, frequenza respiratoria fluttuante, diminuzione dell'attività e diminuzione dell'alimentazione. Quando si verifica il fenomeno di cui sopra, eutanasia la madre che allatta con 1% di pentobarbital sodico (50 mg / kg) il più presto possibile. Preparare alcune madri surrogate, ad esempio 129S1 / SvImJ per la sostituzione e usarle solo se necessario. Non è consigliabile sostituire le madri che allattano come routine, in quanto ciò porterà a frequenti aperture di una camera di ossigeno, con conseguenti livelli di ossigeno instabili e aggressività materna.
  7. Riportare i cuccioli e le loro madri che allattano all'aria della stanza a P12 e monitorare continuamente il peso di tutti i cuccioli fino a P17. Raggruppa i cuccioli in base al peso per assicurarti che ogni gruppo sperimentale abbia una distribuzione del peso simile.

2. Preparazione di supporti interi retinici e colorazione con immunofluorescenza

  1. Registra il peso corporeo dei cuccioli. Sacrificare i cuccioli con un sovradosaggio di anestetico (1% pentobarbital sodico 50 mg/kg) o per inalazione di CO2 . Altri metodi di eutanasia, come la lussazione cervicale e la toracotomia bilaterale, possono essere utilizzati se necessario.
  2. Utilizzare forbici curve per rilasciare la connessione tra bulbi oculari e tessuto orbitale. Quindi, inserire una pinza curva nella parte posteriore del bulbo oculare, bloccare il nervo ottico e sollevare rapidamente l'occhio dall'orbita. Lavare i bulbi oculari in una soluzione salina tampone fosfato 1x pre-raffreddata (PBS) per rimuovere i capelli e il sangue dalla superficie dei bulbi oculari.
  3. Posizionare i bulbi oculari puliti in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con paraformaldeide (PFA) al 4% e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker ad una velocità di 12-15 giri al minuto (rpm) (fissazione iniziale).
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è nota per essere allergenica, generalmente tossica ed estremamente citotossica. Seguire rigorosamente le istruzioni di sicurezza ed evitare l'inalazione e il contatto con la pelle.
  4. Utilizzare un piatto di coltura e mettere una goccia di 1x PBS nella parte centrale ed eseguire i seguenti passaggi al microscopio da dissezione e posizionare un bulbo oculare in questa goccia. Tenere il bulbo oculare con un paio di pinze e perforare accuratamente la cornea al limbus corneale usando un ago da siringa da 1 ml. Inserire la punta delle forbici in questo foro e tagliare con cura la cornea lungo il limbus corneale. Fare attenzione a non tagliare la retina.
  5. Rimuovere l'iride e la lente con un paio di pinze. Quindi posizionare la concia oculare rimanente nel PFA al 4% e fissare nuovamente per altri 45 minuti a temperatura ambiente su uno shaker ad una velocità di 12-15 giri / min (fissazione secondaria).
  6. Usa un piatto di coltura e metti una goccia di 1x PBS nella parte centrale. Posiziona il bulbo oculare fisso in questa goccia. Tenere il bulbo oculare con un paio di pinze. Separare delicatamente gli strati di retina e sclera usando due pinze. Posizionare la punta delle forbici tra gli strati di retina e sclera e tagliare la sclera verso il nervo ottico. Staccare la sclera dalla retina e ottenere la coppa retinica.
    NOTA: Tenere la coppa posteriore per il nervo ottico con una pinza, quindi utilizzare l'estremità curva di un'altra pinza per premere verso il basso sulla sclera alla testa del nervo ottico e massaggiare delicatamente la retina in un movimento ampio in avanti come alternativa per rilasciare la retina.
  7. Utilizzare una pinza per rilasciare la connessione tra i vasi ialoidi radiali e la retina periferica, bloccare la radice dei vasi ialoidi che è vicina alla testa del nervo ottico e tagliare accuratamente i vasi ialoidi.
  8. Utilizzare una pipetta da 2 mL con la punta tagliata per trasferire la coppa retinica. Posizionare la coppa retinica in un pozzetto in una piastra da 48 pozzetti e lavarla per 3 x 5 minuti con 1x PBS a temperatura ambiente su uno shaker ad una velocità di 12-15 giri / min.
  9. Incubare la coppa retinica in una soluzione mista di Triton X-100 all'1% (in PBS) e siero d'asino normale al 5% (in PBS) per una notte a 4 °C.
    1. In alternativa, bloccare e permeabilizzare le retine a temperatura ambiente per 1 ora in alternativa. Cambiare il siero bloccante in base alla fonte dell'anticorpo secondario.
  10. Se si marca la vascolarizzazione retinica utilizzando Isolectina B4, incubare la retina in un pozzetto di 48 pozzetti con 0,1% di siero normale d'asino (400 μL) e IsolectinB4-594 (1:400) per una notte a 4 °C su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm.
    NOTA: Se si marcano i vasi sanguigni con altri marcatori, come CD31, o si etichettano altre cellule, utilizzare anticorpi primari specifici per etichettarli.
  11. Incubare la retina con anticorpi primari specifici 1:100-1:500 (in 400 μL 0,1% siero normale dell'asino) a 4 °C su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm per 48 h. (opzionale)
  12. Dopo essere tornati alla temperatura ambiente, lavare la retina con 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 in PBS) per 3 x 20 minuti su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm.
  13. Incubare la retina con anticorpi secondari 1:1.000 (in 400 μL 0,1% siero normale dell'asina) per una notte a 4 °C su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm. (facoltativo)
    1. In alternativa, incubare la retina con anticorpi secondari ad alta affinità a temperatura ambiente per 1 ora.
  14. Incubare la retina con DAPI (1:1.000) a temperatura ambiente per 20-25 minuti per marcare il nucleo.
    NOTA: Testare i rapporti di diluizione ottimali per tutti gli anticorpi utilizzati nelle fasi 10-11 e 13-14 nel pre-esperimento.
  15. Lavare la retina per 3 x 30 minuti con PBST allo 0,1% su uno shaker ad una velocità di 12-15 rpm a temperatura ambiente.
  16. Trasferire la coppa retinica in un vetrino pulito con l'apertura rivolta verso l'alto. Tagliare la retina radialmente a ore 3, 6, 9 e 12 da periferica a centrale tagliando a circa 1-1,5 mm di distanza dalla testa del nervo ottico.
  17. Aggiungere alcune gocce di 1x PBS per risciacquare la retina tre volte. Utilizzare carta posata all'aria per asciugare e appiattire la retina. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali) al centro del vetrino e interrompere l'aggiunta fino a quando il diametro della goccia aumenta fino a metà del vetrino. Capovolgere rapidamente il coprislip e posizionarlo sopra la retina diffusa. Evitare di formare bolle.
  18. Scattare immagini dei supporti piatti retinici o conservare e proteggere i vetrini dalla luce a 4 °C.

3. Analisi e quantificazione di supporti piatti retinici

NOTA: Per il modello murino OIR, i ricercatori registrano spesso l'area di occlusione vascolare retinica centrale e neovascolarizzazione patologica retinica periferica durante P12-P25. Studi precedenti hanno dimostrato che l'area avascolare centrale della retina raggiunge il massimo a P12 e gradualmente si restringe da P13 a P17; allo stesso tempo, la retina dei topi OIR raggiunge il picco dell'area di neovascolarizzazione intorno a P1722,29. Da P17, i neovasi regrediscono gradualmente e i vasi funzionali ricrescono nell'area avascolare. La vascolarizzazione retinica ritorna fondamentalmente alla normalità a P2533.

  1. Scattare immagini di supporti piatti retinici con un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali) con obiettivo 10x. Innanzitutto, scegli il canale DAPI e imposta la testa del nervo ottico al centro del campo visivo. Quindi, regolare gli altri canali e concentrarsi sulla vascolarizzazione superficiale della retina. Seleziona i riquadri in un software fotografico (vedi Tabella dei materiali) e imposta il numero di foto che devono essere unite. Fare clic su Avvia esperimento per catturare l'intera retina.
  2. Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali) per quantificare l'area di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) dopo la colorazione con immunofluorescenza.
    1. Innanzitutto, fai clic sullo strumento bacchetta magica e imposta una tolleranza appropriata in base alla differenza di luminosità e sposta il cursore sullo sfondo e fai clic con il mouse. Quindi, scegliere Seleziona Inversa per ottenere un contorno di base della retina. Utilizzare lo strumento lazo per delineare ulteriormente i dettagli della retina. Utilizzando la funzione Istogramma , registrare il valore in pixel dell'intera retina e scriverlo o generare una tabella in un programma di database.
    2. Dividi l'immagine della retina in quattro quadranti. In ogni quadrante, usate lo strumento lazo per disegnare l'area VO (Figura 2A-C) e usate lo strumento bacchetta magica per selezionare l'area NV (Figura 2D-F). Attraverso le informazioni sui pixel nell'istogramma, calcolare il rapporto pixel di VO e NV per l'intera retina, ovvero la percentuale di VO o NV area relativa all'intera retina.
      NOTA: esiste anche una pipeline open source e completamente automatizzata per la quantificazione delle aree VO e NV nelle immagini OIR utilizzando reti neurali di deep learning (http://oirseg.org/), che fornisce un modo affidabile e che consente di risparmiare tempo per i ricercatori e unifica lo standard della quantificazione34.
  3. Registra le informazioni sui pixel in una tabella di fogli di calcolo, che è conveniente per l'analisi successiva.

4. Imaging in vivo con fluorangiografia del fondo oculare (FFA)

NOTA: Per i topi OIR, sia la perfusione FITC che la colorazione con immunofluorescenza possono essere utilizzate solo per una volta a causa della morte di animali da esperimento. Rispetto a questo, uno dei vantaggi di FFA è l'osservazione dei cambiamenti dinamici dei vasi retinici del topo durante lo sviluppo e lo stato patologico in vivo35,36.

  1. Pesare i cuccioli prima dell'anestesia.
  2. Anestetizzare i cuccioli mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico allo 0,3% alla dose di 30-50 mg/kg.
    NOTA: Per i topi entro 1 mese, prestare attenzione alle dosi di anestetico. Utilizzare concentrazioni e dosi più basse di anestetico per ridurre la morte dei topi causata dall'anestesia. Dopo che i cuccioli sono stati anestetizzati, utilizzare una piccola piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea. L'ipotermia non solo influisce sulla funzione fisiologica dei cuccioli, ma porta anche a cambiamenti nella cristallina e accelera lo sviluppo della cataratta.
  3. Utilizzare 20 μL di collirio midriatico (0,5% tropicamide + 0,5% fenilefrina cloridrato) per ogni cucciolo e attendere 5 minuti per ottenere una dilatazione della pupilla di lunga durata (Figura 3A,B).
  4. Portare i cuccioli anestetizzati davanti al dispositivo di imaging (vedi Tabella dei materiali). Tieni i cuccioli su una piccola piastra elettrica, posizionali in una posizione stabile e usa regolarmente lacrime artificiali per mantenere l'umidità nella cornea. Fare clic sulla modalità di Infrared Fundus Imaging (IR) per regolare la testa del nervo ottico al centro dello schermo.
    NOTA: Quando si osserva un occhio dei cuccioli, non dimenticare di proteggere l'altro occhio. Utilizzare collirio ipromellosico per evitare che la cornea si sbianca a causa della secchezza.
  5. Dopo l'iniezione intraperitoneale di 0,15 mL di soluzione di sale sodico di fluoresceina allo 0,5%, fare clic sul pulsante FA e sul pulsante Iniezione immediatamente sul pannello a sfioramento del dispositivo di imaging per avviare la temporizzazione. Registrare le immagini dopo 3 minuti quando la circolazione sanguigna della retina entra nella fase venosa e osservare la retina non meno di 6-8 minuti.
    NOTA: Dopo l'iniezione intraperitoneale di soluzione di sale sodico di fluoresceina, la pelle, la mucosa e l'urina dei cuccioli mostrano un evidente verde giallastro. La maggior parte della fluoresceina viene escreta dai cuccioli entro un giorno. L'iniezione della fluoresceina sodica per via intraperitoneale a giorni alterni per sei volte non causa effetti collaterali significativi37.
  6. Spostare la testa del nervo ottico al centro dell'area di acquisizione dell'immagine e scattare la prima immagine della retina centrale. Quindi, spostare la lente del dispositivo di imaging orizzontalmente sul lato nasale dell'occhio fino a quando la testa del nervo ottico si trova nel punto medio di un lato dell'area di acquisizione dell'immagine e prendere la seconda immagine. Continuare a scattare immagini della retina temporale, superiore e inferiore, rispettivamente utilizzando questo metodo (Figura 3C).
    NOTA: Scatta immagini con "cinque orientamenti" entro 12 minuti quando si verifica la fase di regressione. La posizione della testa del nervo ottico nell'immagine inferiore è consentita per non cadere sulla linea laterale a causa della limitata regolazione dell'angolo dell'obiettivo.
  7. Salvare le immagini e utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per la cucitura.

5. Elaborazione dell'immagine dell'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA)

  1. Aprire il programma di elaborazione delle immagini e fare clic su Nuovo nel file per creare una nuova tela con uno sfondo nero (Figura 4A).
  2. Apri prima un'immagine della retina centrale nel livello di sfondo. Clicca su File e aggiungi la seconda immagine. Regola l'opacità della seconda immagine al 60%, sposta e ridimensiona la seconda immagine fino a quando le stesse parti delle due immagini si sovrappongono notevolmente. Fare clic sul pulsante Passa tra le modalità trasformazione libera e alterazione e apportare lievi regolazioni ai vasi, se necessario. Quindi, riportare l'opacità della seconda immagine al 100% (Figura 4A,B).
  3. Selezionare due immagini contemporaneamente e fare clic su Livelli di fusione automatica. Selezionate Panorama come metodo di blend e selezionate le due frasi seguenti. Fare clic su OK e completare la cucitura dell'immagine delle prime due immagini (Figura 4C, D).
  4. Prendi le prime due immagini cucite nel loro insieme, aggiungi la terza immagine e continua a fondere. Ripetere i metodi precedenti per completare la cucitura di cinque immagini (Figura 4E).
  5. Usa lo strumento Ritaglia per tagliare immagini di FFA in diversi punti temporali con dimensioni uniformi e osserva i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica da P15 a P25 sia nei cuccioli normali che OIR.

6. Analisi statistica

  1. Valori attuali come media ± deviazione standard (d.s.).
  2. Usa il test t di Student per confrontare due campioni indipendenti. Utilizzare One-Way ANOVA per confrontare più set di dati e combinarli con il test di Dunnett o Tukey, che è un test di confronto multiplo comunemente usato.
  3. Per i dati non normalmente distribuiti, utilizzare il test U di Mann-Whitney o il test di Kruskal Wallis. Considerare differenze statistiche significative quando P < 0,05.

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Representative Results

Nel modello murino OIR, il risultato più importante e basilare è la quantificazione dell'area VO e NV. Dopo aver vissuto nell'ambiente iperossia per 5 giorni da P7, la retina centrale dei cuccioli ha mostrato la più grande area di non perfusione. Sotto la stimolazione dell'ipossia in altri 5 giorni, è stata gradualmente prodotta la neovascolarizzazione retinica che ha fluorescenza più intensamente rispetto ai vasi normali circostanti. Dopo P17, il segnale di fluorescenza della neovascolarizzazione patologica è regredito rapidamente come rimodellamento della retina (Figura 5A). Controllando le dimensioni della cucciolata e l'aumento di peso postnatale dei cuccioli, l'area del VO e della NV del modello murino OIR ha mostrato una buona ripetibilità e stabilità e il picco di neovascolarizzazione retinica si è verificato a P17, che era in linea con gli studi precedenti (Figura 5B, C).

FFA è uno strumento ideale per lo studio della vascolarizzazione retinica. Data l'applicazione di FFA in vivo, mostra una grande riduzione dello spreco di animali da esperimento e mostra i cambiamenti dinamici dei vasi retinici nel tempo. In studi precedenti, FFA non è stato spesso utilizzato nei cuccioli di topi ed è stato presentato in un'immagine a vista singola, che era difficile per ulteriori studi. In questo protocollo, le immagini "a cinque orientamenti" della vascolarizzazione della retina sono state cucite insieme utilizzando un software di elaborazione delle immagini per visualizzare un campo più ampio della retina contemporaneamente, il che è stato utile per l'analisi successiva, se necessario (Figura 4). Inoltre, i cuccioli di topo OIR hanno mostrato un'apertura prolungata degli occhi, quindi le immagini FFA sono state prese da P15 per soddisfare i requisiti dell'etica animale. Nella retina del modello murino OIR, il diametro dei vasi sanguigni è aumentato evidentemente ed è diventato altamente tortuoso rispetto ai topi normali. Inoltre, l'FFA ha mostrato una tendenza simile di cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica con colorazione a immunofluorescenza con isolectina B4-594 da P15-P25 senza la morte dei cuccioli (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Schema del fumetto del modello di topo OIR. Il modello murino OIR è stato indotto tenendo i cuccioli e le loro madri che allattano in una stanza per qualche tempo (P0-P7). A P7, entrambi sono stati esposti al 75% di ossigeno per 5 giorni, che ha inibito la crescita dei vasi retinici e causato una significativa perdita di vasi nella retina centrale. I topi sono stati quindi riportati all'aria ambiente a P12 e la retina avascolare ha iniziato a diventare relativamente ipossica, innescando sia la normale ricrescita dei vasi che una risposta patologica intorno alla retina medio-periferica. La massima neovascolarizzazione (NV) è stata osservata a P17. Quindi, la neovascolarizzazione patologica ha subito un processo di regressione spontanea. Il sistema vascolare retinico era tornato di nuovo alla normalità intorno a P25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Misurazione della vaso-obliterazione (VO) e della neovascolarizzazione (NV) nella retina del topo. (A) Immagine di 10x P12 OIR retina a montaggio intero colorato per cellule endoteliali con isolectina B4-594. (B) Screenshot di una retina con l'area avascolare selezionata. Gli strumenti necessari per effettuare questa misurazione sono evidenziati con frecce bianche: Magic Wand Tool e Lazo Tool. (C) Evidenziare l'area avascolare della retina e salvare l'immagine come copia. (D) Immagine di 10x P17 OIR retina a montaggio intero colorata per cellule endoteliali con isolectina B4-594. (E) Screenshot di una retina con ciuffi neovascolari selezionati. Utilizzare Magic Wand Tool e impostare una tolleranza ottimale per evidenziare NV. Impostate la tolleranza su 3-5 e selezionate le caselle anti-alias e contigue. (F) Salvare l'area di neovascolarizzazione solo come copia. Le barre della scala rappresentano 1.000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Acquisizione delle immagini "Five-orientation" nella retina del mouse. (A) La pupilla normale del topo. (B) pupilla di topo nella midriasi. (C) Sono state raccolte rispettivamente le immagini "Five-orientation" dell'area centrale, nasale, temporale, superiore e inferiore della retina (cuccioli P17 nell'aria ambiente). Le barre della scala rappresentano 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Flusso di lavoro generale di cucitura delle immagini "Five-orientation" dall'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA). (A) Creare una nuova tela con uno sfondo nero e aprire l'immagine FFA della retina centrale. (B) Aprire un'immagine FFA della retina temporale e regolare l'opacità della seconda immagine al 60%; Sposta e ridimensiona l'immagine fino a quando le stesse parti delle due immagini si sovrappongono notevolmente. Fate clic su Passa tra le modalità trasformazione libera e alterazione per apportare lievi regolazioni, se necessario. Riportare l'opacità della seconda immagine al 100%. (C) Selezionare due immagini contemporaneamente e fare clic su Livelli di fusione automatica. (D) Utilizzare Panorama come metodo di fusione per completare la cucitura delle immagini delle prime due immagini. (E) Continuare a cucire le immagini ripetendo i metodi precedenti per completare la cucitura di tutte le immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Quantificazione della vaso-obliterazione (VO) e della neovascolarizzazione (NV) nella retina del modello murino OIR. (A) Immagine di 10 volte OIR retinali a montaggio intero colorati per cellule endoteliali con isolectina B4-594 da P12 a P25. Dopo essere stati esposti al 75% di ossigeno per 5 giorni, i cuccioli e le loro madri che allattano sono stati riportati all'aria della stanza a P12 in cui l'area di vaso-obliterazione ha raggiunto il massimo. La relativa ipossia nella retina centrale ha portato alla ricrescita dei vasi in quest'area e all'angiogenesi patologica nella retina medio-periferica. A P17, i ciuffi neovascolari pre-retinici hanno raggiunto il massimo e poi si sono ridotti rapidamente. La NV regredì completamente e la retina sembrava essere normale intorno a P25. (B) La quantificazione dell'area di VO ha mostrato un picco a P12 e una scomparsa intorno a P25. (C) La quantificazione dell'area di NV ha mostrato un picco a P17 e una regressione intorno a P25. Le barre di scala rappresentano 1.000 μm in A. (Anova unidirezionale, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, **** P < 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Imaging in vivo della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) nel modello murino OIR. Nella retina del modello murino OIR, il diametro dei vasi sanguigni è aumentato evidentemente ed è diventato altamente tortuoso rispetto ai topi normali. Inoltre, l'FFA ha mostrato una tendenza simile di cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica con colorazione a immunofluorescenza con isolectina B4-594 da P15-P25 senza la morte di cuccioli di topo. Le barre della scala rappresentano 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

La suscettibilità dei topi all'OIR è influenzata da molti fattori. I cuccioli di diverso background genetico e ceppi non possono essere confrontati. Nei topi albini BALB/c, i vasi ricrescono rapidamente nell'area VO con ciuffi neovascolari significativamente ridotti38, che portano alcune difficoltà alla ricerca. Nei topi C57BL/6, c'è un aumento del danno ai fotorecettori rispetto al ceppo murino BALB/cJ39,40. Lo stesso vale per diversi tipi di topi transgenici41,42,43. Inoltre, i topi C57BL / 6 mostrano un livello inferiore di angiogenesi rispetto ai topi 129S3 / SvIM44.

Anche l'aumento di peso postnatale (PWG) è importante da considerare45 ed è uno degli indicatori per valutare lo stato nutrizionale dei neonati. È anche diventato un metodo affidabile per prevedere la ROP, che attira l'attenzione di molti modellisti animali46. PWG influenza la risposta dei topi all'iperossia e all'ipossia. A P7, i cuccioli con aumento del peso corporeo (>5 g) mostrano un'insufficiente vaso-obliterazione e neovascolarizzazione retinica, mentre i cuccioli con peso corporeo ridotto (<5 g) mostrano una risposta evidente all'iperossia e all'ipossia. Inoltre, a P17, i cuccioli con scarso (<5 g) ed esteso (>7,5 g) aumento di peso mostrano una diminuzione della NV. Tuttavia, i cuccioli con scarso aumento di peso (<5 g) hanno significativamente prolungato la fase di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) con un ritardo nel verificarsi del picco NV45. Pertanto, è necessario registrare e controllare il PWG dei cuccioli a P7 e P17 ed eliminare i cuccioli con PWG basso (< 6 g a P17) per garantire la ripetibilità e la comparabilità dell'esperimento.

La dimensione della cucciolata ha un impatto maggiore sul PWG e alcuni ricercatori suggeriscono che dovrebbe essere limitata a 6-8 cuccioli / madre per soddisfare i requisiti per PWG22,31. Anche lo stato della madre che allatta ha bisogno di una considerazione. Le madri che allattano hanno maggiori probabilità di morire per danni polmonari in un ambiente iperossico47. Se le madri che allattano muoiono o trascurano i loro cuccioli durante e dopo l'induzione di OIR, i cuccioli perderanno facilmente peso o addirittura moriranno a causa della mancanza di nutrizione32. Pertanto, è necessario assicurarsi che ci siano abbastanza madri surrogate per sostituirle. Tuttavia, queste madri surrogate sono suggerite per essere utilizzate solo quando la madre scade, che di solito accade durante il periodo di esposizione iperossia o ritorno all'aria della stanza22. Fornire cibo adeguato per le madri che allattano è anche utile per migliorare lo stato nutrizionale dei loro cuccioli.

Una nota utile per preparare i supporti piatti retinici è che un tempo ottimale di fissazione è solitamente necessario per un'ulteriore colorazione a lungo termine. Come topi di P12-P25, si consiglia una fissazione di 15 min + 45 min a temperatura ambiente29. Fissare la retina a 4 °C durante la notte è un'alternativa se il tempo è limitato. Inoltre, il tampone permeabile e bloccante con una concentrazione superiore dell'1% di Triton X-100 e il 5% di siero normale d'asina riducono efficacemente lo sfondo della colorazione immunofluorescenza secondo la nostra esperienza.

La colorazione dell'isolectina B4 e la perfusione FITC-destrano sono metodi comunemente usati per visualizzare e quantificare il48,49 neovascolare. Una delle principali limitazioni di questi due metodi è che i topi devono essere sacrificati. Quindi, i metodi per l'imaging in vivo e la quantificazione della NV sono necessari29. Paques et al. hanno sviluppato una tecnica chiamata topical endoscopy fundus imaging (TEFI), che fornisce fotografie digitali ad alta risoluzione della retina in topi vivi50. Il TEFI è in grado di rilevare alterazioni vascolari retiniche già a partire da P15 e le immagini ottenute sono conformi ai metodi convenzionali di valutazione. Mezu-Ndubuisi et al. hanno poi fornito i metodi per le misurazioni in vivo della tensione vascolare dell'ossigeno (PO2) della retina e della fluorangiografia (FA), migliorando la comprensione dei cambiamenti vascolari retinici e delle alterazioni dell'ossigenazione dovute alla ROP e ad altre malattie ischemiche della retina37. Sebbene né TEFI né FA siano accurati come i metodi convenzionali, riducono la morte di animali da esperimento e possono essere eseguiti ripetutamente. Inoltre, consentono a ciascun mouse di fungere da controllo a sé stante, rendendo così i dati OIR più comparabili. In questo documento, viene fornito un metodo migliorato di imaging FFA e cucitura delle immagini. Eseguire FFA sui cuccioli entro 1 mese non è facile perché l'anestesia eccessiva e l'ipotermia causano direttamente la morte dei cuccioli. Pertanto, cercare di utilizzare la dose minima di anestesia e prestare particolare attenzione al mantenimento della temperatura corporea dei cuccioli durante e dopo il processo utilizzando una piccola piastra riscaldante. Inumidire sempre la superficie oculare con soluzione salina e ipromellosa in caso di fallimento della seguente osservazione.

In sintesi, il modello murino OIR è un modello molto comune e ampiamente utilizzato di ischemia retinica e neovascolarizzazione patologica. Uno dei maggiori problemi di questo modello è che i cuccioli di topi neonatali sono essenzialmente sani e non hanno instabilità metabolica o problemi respiratori rispetto ai bambini nati prematuri. Un'altra differenza tra il modello murino OIR e gli esseri umani è che c'è sempre proliferazione fibrovascolare nella neovascolarizzazione retinica umana mentre la neovascolarizzazione retinica non è associata a fibrosi nel modello murino OIR51. Per utilizzare meglio questo modello e acquisire maggiori informazioni, viene fornita una descrizione dettagliata dell'utilizzo di FFA per monitorare i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica OIR, compresi i metodi di acquisizione di immagini "a cinque orientamenti" e l'elaborazione delle immagini. Si ritiene che l'FFA diventerà un metodo efficace parzialmente o completamente per sostituire la colorazione a immunofluorescenza per osservare e valutare la morfologia e la funzione della vascolarizzazione retinica49. Sebbene il modello murino OIR non assomigli completamente al microambiente e alla patogenesi di varie retinopatie ischemiche negli esseri umani, ci offre l'opportunità di condurre esperimenti farmacologici e transgenici, nonché di esplorare il meccanismo dell'angiogenesi patologica sulla retina ischemica51.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio e del laboratorio oftalmico per animali del Centro oftalmico di Zhongshan per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Prof. Chunqiao Liu per il supporto sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Pechino, Cina), la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (Grant No.2019A1515011347) e il progetto di costruzione di ospedali di alto livello dello State Key Laboratory of Ophthalmology presso il Centro oftalmico di Zhongshan (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincia del Guangdong, Cina).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sterile syringe Solarbio YA0550 For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech  FG701-01 For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube Corning MCT-200-C For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3548 For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides Various For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019 Adobe Inc. For image analysis
Carbon dioxide gas Various For sacrifice
Cover slide Various For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps World Precision Instruments 14127 For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution Abcam ab228549 For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope Olmpus SZ61 For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium Sigma-Aldrich F6377 For in vivo imaging
Fluorescent Microscope  Zeiss AxioImager.Z2 For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech  0100-01 For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose Maya 89161 For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody Invitrogen I21413 For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J GemPharmatech of Jiangsu Province For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242 For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps World Precision Instruments  501978-6 For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum Abcam ab7475 For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor Various For monitoring the level of O2
OxyCycler Biospherix A84XOV For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG For tissue fixation
Pentobarbital sodium Various For anesthesia
Soda lime Various For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT Heidelberg HC00500002 For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0 IBM For statistical analysis
Tansference decloring shaker Kylin-Bell ZD-2008 For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment) Corning 3261-20EA For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes Various For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100 Sigma-Aldrich  SLBW6818 For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide Various For in vivo imaging
ZEN Imaging Software ZEISS For image acquisition and export

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Biologia Numero 170
Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno
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Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model. J. Vis. Exp. (170), e62410, doi:10.3791/62410 (2021).

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