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Biology

ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी माउस मॉडल में रेटिना वाहिकाओं के गतिशील विकास की निगरानी

Published: April 2, 2021 doi: 10.3791/62410
Automatic Translation
1, 1
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों रेटिना फ्लैट माउंट और विश्लेषण की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है। चूहों के पिल्ले और छवि प्रसंस्करण के लिए फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) के उपयोग का भी विस्तार से वर्णन किया गया है।

Abstract

ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) का व्यापक रूप से इस्कीमिक रेटिना रोगों में असामान्य पोत वृद्धि का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमैच्योरिटी (आरओपी), प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी (पीडीआर), और रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) शामिल हैं। अधिकांश ओआईआर अध्ययन विशिष्ट समय बिंदुओं पर रेटिना नवसंवहनीकरण का निरीक्षण करते हैं; हालांकि, एक समय पाठ्यक्रम के साथ जीवित चूहों में गतिशील पोत वृद्धि, जो ओआईआर से संबंधित पोत रोगों को समझने के लिए आवश्यक है, को कम करके आंका गया है। यहां, हम ओआईआर माउस मॉडल के प्रेरण के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, संभावित नुकसान को उजागर करते हैं, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करके वासो-विलोपन (वीओ) और नवसंवहनीकरण (एनवी) के क्षेत्रों को जल्दी से मापने के लिए एक बेहतर विधि प्रदान करते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने ओआईआर माउस मॉडल में फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) करके पी 15 से पी 25 तक जीवित चूहों में पोत पुनर्विकास की निगरानी की। ओआईआर माउस मॉडल के लिए एफएफए का आवेदन हमें पोत पुनर्विकास के दौरान रीमॉडेलिंग प्रक्रिया का निरीक्षण करने की अनुमति देता है।

Introduction

रेटिना नवसंवहनीकरण (आरएनवी), जिसे एक ऐसी स्थिति के रूप में परिभाषित किया गया है जहां नए पैथोलॉजिकल वाहिकाएं मौजूदा रेटिना नसों से उत्पन्न होती हैं, आमतौर पर रेटिना की आंतरिक सतह के साथ फैली होती हैं और कांच (या कुछ स्थितियों के तहत सबरेटिनल स्पेस) में बढ़ती हैं। यह कई इस्केमिक रेटिनोपैथी की एक पहचान और सामान्य विशेषता है, जिसमें रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमैच्योरिटी (आरओपी), रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ), और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी (पीडीआर) 2 शामिल हैं।

कई नैदानिक और प्रायोगिक टिप्पणियों ने संकेत दिया है कि इस्किमिया रेटिना नवसंवहनीकरण 3,4 का मुख्य कारण है। आरओपी में, नवजात शिशुओं को जीवित रहने की दर बढ़ाने के लिए बंद इनक्यूबेटरों में उच्च-स्तरीय ऑक्सीजन के संपर्क में लाया जाता है, जो संवहनी विकास की गिरफ्तारी के लिए एक महत्वपूर्ण चालक भी है। उपचार किए जाने के बाद, नवजात शिशुओं के रेटिना अपेक्षाकृत हाइपोक्सिक अवधि का अनुभव करते हैं5. अन्य स्थितियों को आरवीओ में केंद्रीय या शाखा रेटिना नसों के रोड़ा में देखा जाता है और रेटिना केशिकाओं की क्षति भी देखी जाती है जो पीडीआर2 में माइक्रोएंजियोपैथी के कारण होती है। हाइपोक्सिया आगे हाइपोक्सिया-प्रेरित कारक -1α (एचआईएफ -1α) सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) जैसे एंजियोजेनिक कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है जो बदले में संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को हाइपोक्सिक क्षेत्र में बढ़ने और नए जहाजों 6,7 बनानेके लिए मार्गदर्शन करता है।

आरओपी अपरिपक्व शिशुओं में संवहनी प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी का एक प्रकार है और बचपन के अंधापन 8,9 का एक प्रमुख कारण है, जो रेटिना हाइपोक्सिया, रेटिना नवसंवहनीकरण और रेशेदार हाइपरप्लासिया 10,11,12 की विशेषता है। 1950 के दशक में, शोधकर्ताओं ने पाया कि ऑक्सीजन की उच्च सांद्रता समय से पहले शिशुओं13,14 के श्वसन लक्षणों में काफी सुधार कर सकती है। नतीजतन, उस समय समय के समय के शिशुओं में ऑक्सीजन थेरेपी का तेजी से उपयोग किया गया था15. हालांकि, अपरिपक्व शिशुओं में ऑक्सीजन थेरेपी के व्यापक उपयोग के साथ समवर्ती, आरओपी की घटनाओं में साल-दर-साल वृद्धि हुई। तब से, शोधकर्ताओं ने आरओपी और आरएनवी16 के रोगजनन को समझने के लिए विभिन्न पशु मॉडल की खोज करते हुए ऑक्सीजन को आरओपी से जोड़ा है।

मानव में, अधिकांश रेटिना वास्कुलचर विकास जन्म से पहले पूरा हो जाता है जबकि कृन्तकों में रेटिना वास्कुलचर जन्म के बाद विकसित होता है, रेटिना वास्कुलचर2 में एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक सुलभ मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। अनुसंधान की निरंतर प्रगति के साथ, ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) मॉडल इस्किमिया के परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस की नकल करने के लिए प्रमुख मॉडल बन गए हैं। ओआईआर मॉडल के अध्ययन में कोई विशिष्ट पशु प्रजातियां नहीं हैं और मॉडल को विभिन्न जानवरों की प्रजातियों में विकसित किया गया है, जिसमें बिल्ली का बच्चा17, चूहा18, माउस19, बीगल पिल्ला20 और जेब्राफिश21 शामिल हैं। सभी मॉडल एक ही तंत्र साझा करते हैं जिसके द्वारा वे प्रारंभिक रेटिना विकास के दौरान हाइपरोक्सिया के संपर्क में आते हैं और फिर नॉर्मोक्सिक वातावरण में लौट आते हैं। स्मिथ एट अल ने देखा कि 5 दिनों के लिए पी 7 से हाइपरोक्सिया के लिए माउस पिल्ले को उजागर करने से केंद्रीय रेटिना में पोत प्रतिगमन का एक चरम रूप प्रेरित हुआ और उन्हें पी 12 में कमरे की हवा में वापस लाने से धीरे-धीरे नवसंवहनी टफ्ट्स को ट्रिगर किया गया, जो कांच के शरीर की ओर बढ़ गया19. यह एक मानकीकृत ओआईआर माउस मॉडल था जिसे स्मिथ मॉडल भी कहा जाता था। कॉनर एट अल ने प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया और 2009 में वीओ (वासो-विलोपन) और एनवी (नवसंवहनीकरण) के क्षेत्र को मापने के लिए एक सार्वभौमिक रूप से लागू विधि प्रदान की, जिसने मॉडल22 की स्वीकृति और उपयोग में वृद्धि की। ओआईआर माउस मॉडल अभी भी अपने छोटे आकार, तेजी से प्रजनन, स्पष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि, अच्छी पुनरावृत्ति और उच्च सफलता दर के कारण सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है।

चूहों में, रेटिना संवहनीकरण जन्म के बाद ऑप्टिक तंत्रिका सिर से ओरा सेरेटा की ओर आंतरिक रेटिना में वाहिकाओं की वृद्धि के साथ शुरू होता है। सामान्य रेटिना विकास के दौरान, पहले रेटिना वाहिकाएं जन्म के आसपास ऑप्टिक तंत्रिका सिर से अंकुरित होती हैं, जिससे एक विस्तारनेटवर्क (प्राथमिक जाल) बनता है जो प्रसवोत्तर दिन 7 (पी 7) 23 के आसपास परिधि तक पहुंचता है। फिर जहाजों को रेटिना में एक गहरी परत बनाने, रेटिना में प्रवेश करने और मानव 24 के रूप में आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) के चारों ओर एक लामिना नेटवर्क स्थापित करने के लिए बढ़ना शुरू होजाता है। तीसरे प्रसवोत्तर सप्ताह (पी 21) के अंत तक, गहरा जाल विकास लगभग पूरा हो गया है। ओआईआर माउस मॉडल के लिए, संवहनी रोड़ा हमेशा केंद्रीय रेटिना में दिखाई देता है क्योंकि हाइपरोक्सिया एक्सपोजर के दौरान मध्य क्षेत्र में बड़ी संख्या में अपरिपक्व संवहनी नेटवर्क का तेजी से अध: पतन होता है। तो, पैथोलॉजिकल नवसंवहनीकरण की वृद्धि मध्य-परिधीय रेटिना में भी होती है, जो गैर-छिड़काव क्षेत्र और संवहनी क्षेत्र की सीमा है। हालांकि, मानव रेटिना वाहिकाएं जन्म से पहले लगभग बन गई हैं। समय से पहले शिशुओं के लिए, हाइपरोक्सिया25,26 के संपर्क में आने पर परिधीय रेटिना पूरी तरह से संवहनी नहीं होती है। तो संवहनी रोड़ा और नवसंवहनीकरण मुख्य रूप से परिधीय रेटिना27,28 में दिखाई देते हैं। इन मतभेदों के बावजूद, माउस ओआईआर मॉडल इस्किमिया-प्रेरित नवसंवहनीकरण के दौरान होने वाली पैथोलॉजिकल घटनाओं को बारीकी से दोहराता है।

ओआईआर मॉडल के प्रेरण को दो चरणों में विभाजित किया जा सकता है29: चरण 1 (हाइपरोक्सिया चरण) में, रेटिना संवहनी विकास को वीईजीएफ में गिरावट और एंडोथेलियल कोशिकाओं के एपोप्टोसिस के परिणामस्वरूप रक्त वाहिकाओं के रोड़ा और प्रतिगमन के साथ गिरफ्तार या मंद किया जाता है24,30; चरण 2 (हाइपोक्सिया चरण) में, रेटिना ऑक्सीजन की आपूर्ति कमरे की हवा की स्थिति29 के तहत अपर्याप्त हो जाएगी, जो तंत्रिका विकास और होमियोस्टेसिस19,31 के लिए आवश्यक है। इस्केमिक स्थिति के परिणामस्वरूप आमतौर पर अनियमित, असामान्य नवसंवहनीकरण होता है।

वर्तमान में, आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली मॉडलिंग विधि उच्च / निम्न ऑक्सीजन एक्सपोजर को बारी-बारी से कर रही है: माताओं और उनके पिल्ले पी 7 पर 5 दिनों के लिए 75% ऑक्सीजन के संपर्क में हैं, इसके बाद कमरे की हवा में 5 दिनों तक पी 17 ने तुलनीय परिणाम22 का प्रदर्शन किया, जो ओआईआर माउस मॉडल प्रेरण का समापन बिंदु है। (चित्र 1)। आरओपी का अनुकरण करने के अलावा, इस इस्किमिया-मध्यस्थता वाले पैथोलॉजिकल नियोवास्कुलराइजेशन का उपयोग अन्य इस्केमिक रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इस मॉडल के मुख्य माप में वीओ और एनवी के क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करना शामिल है, जिसका विश्लेषण रेटिना फ्लैट माउंट से इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या एफआईटीसी-डेक्सट्रान छिड़काव द्वारा किया जाता है। घातक ऑपरेशन के कारण प्रत्येक माउस का केवल एक बार अध्ययन किया जा सकता है। वर्तमान में, संवहनी प्रतिगमन और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस32 की प्रक्रिया के दौरान लगातार रेटिना वास्कुलचर के गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करने के कुछ तरीके हैं। इस पत्र में, हम ओआईआर मॉडल प्रेरण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, रेटिना फ्लैट माउंट का विश्लेषण और साथ ही चूहों पर फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) का वर्कफ़्लो जो ओआईआर माउस मॉडल के दो चरणों के दौरान संवहनी गतिशील परिवर्तनों की अधिक व्यापक समझ हासिल करने में सहायक होगा।

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Protocol

चूहों के उपयोग से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को झोंगशान नेत्र केंद्र, सन यात-सेन विश्वविद्यालय, चीन (अधिकृत संख्या: 2020-082) की पशु प्रयोगात्मक नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और झोंगशान नेत्र केंद्र की पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदित दिशानिर्देशों और एसोसिएशन रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए बयान।

1. माउस ओआईआर मॉडल का प्रेरण

  1. आंखों की जन्मजात विकृति की कम दर के साथ चूहों का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, सी 57 बीएल / 6 जे चूहों, और उन्हें पुरुष / महिला = 1: 2 के अनुपात में संभोग करें। उसी दिन पैदा हुए पिल्ले प्राप्त करें और पी 7 पर ओआईआर मॉडल को प्रेरित करना शुरू करें। मॉडलिंग से पहले सख्ती से माउस पिल्ले के बॉडीवेट को रिकॉर्ड करें।
    नोट: पी 0 के रूप में जन्म के दिन पर ध्यान दें। नियमित रूप से प्रत्येक माउस के वजन को रिकॉर्ड करें। ओआईआर के प्रेरण के दौरान नवजात पिल्ले का शरीर का वजन बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑक्सीजन के लिए विभिन्न राज्यों में चूहों की संवेदनशीलता अलग-अलग है। तुलनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पी 7 पर 5 ग्राम से अधिक पिल्ले को बाहर करें।
  2. नर्सिंग माताओं और उनके पिल्लों के लिए एक उपयुक्त रहने का माहौल प्रदान करें, जैसे कि तापमान को 23 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस पर सेट करना, आर्द्रता को 40% -65% पर नियंत्रित करना, हर दिन 12 घंटे प्रकाश और 12 घंटे अंधेरे को बारी-बारी से, घोंसले के शिकार के लिए पिंजरे में कुछ कपास ऊन जोड़ना, पर्याप्त निष्फल भोजन और पानी सुनिश्चित करना, और उन्हें व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों (आईवीसी) में रखना।
  3. कक्ष के अंदर आर्द्रता और तापमान के स्तर की निगरानी करें। आर्द्रता को 40% से 65% के बीच नियंत्रित करें और तापमान को 23 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. ऑक्सीजन सेंसर के साथ ऑक्सीजन की आपूर्ति की जांच करें, 75% पर एक निरंतर ऑक्सीजन स्तर बनाए रखें और 0.5-0.75 एल / मिनट पर ऑक्सीजन प्रवाह दर को नियंत्रित करें। अत्यधिक सीओ 2 को अवशोषित करने और 3% 22 से नीचे सीओ 2 मूल्यों को बनाए रखने के लिए कक्ष के तल पर 50 ग्राम सोडा चूना रखें।
  5. नर्सिंग माताओं के व्यवहार की निगरानी करें जैसे घोंसला बनाने का व्यवहार, उनके पिल्ले काटना, और दिन में कम से कम एक बार स्तनपान से इनकार करना। गरीब मातृत्व के साथ स्तनपान कराने वाली माताओं को खत्म करें।
  6. पी 7 पिल्ले (पुरुष और महिला) और उनकी नर्सिंग माताओं को एक ऑक्सीजन कक्ष में रखें जिसमें पी 12 के लिए 5 दिनों के लिए ऑक्सीजन का स्तर 75% है। मॉडल प्रेरण की अवधि के दौरान कक्ष के अनावश्यक उद्घाटन से बचें। सुनिश्चित करें कि प्रतिस्थापन के लिए अतिरिक्त सरोगेट माताएं हैं, यदि नर्सिंग माताओं की हाइपरोक्सिया में फेफड़ों की चोट के कारण मृत्यु हो जाती है।
    नोट: प्रयोग की तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक मां के लिए संख्या को 6-8 पिल्ले तक सीमित करें। ऑक्सीजन विषाक्तता की संभावित समस्या पर ध्यान दें, जो कुछ नर्सिंग माताओं की मृत्यु का कारण बनता है। नर्सिंग माताओं में हाइपरॉक्सिक फेफड़ों की चोट के संकेतों में शामिल हैं, लेकिन श्वसन दर में उतार-चढ़ाव, गतिविधि में कमी और खिलाने में कमी तक सीमित नहीं हैं। जब उपरोक्त घटना होती है, तो जितनी जल्दी हो सके 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम (50 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ नर्सिंग मां को इच्छामृत्यु दें। कुछ सरोगेट माताओं को तैयार करें, उदाहरण के लिए, प्रतिस्थापन के लिए 129 एस 1 / एसवीआईएमजे और केवल यदि आवश्यक हो तो उनका उपयोग करें। एक दिनचर्या के रूप में नर्सिंग माताओं को बदलने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि इससे ऑक्सीजन कक्ष लगातार खुल जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप अस्थिर ऑक्सीजन का स्तर और मातृ आक्रामकता होगी।
  7. पिल्ले और उनकी नर्सिंग माताओं को पी 12 पर कमरे की हवा में वापस लाएं और पी 17 तक लगातार सभी पिल्लों के वजन की निगरानी करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में एक समान वजन वितरण है, वजन के आधार पर पिल्ले को समूहीकृत करें।

2. रेटिना पूरे माउंट और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की तैयारी

  1. पिल्ले के बॉडीवेट को रिकॉर्ड करें। संवेदनाहारी (1% पेंटोबार्बिटल सोडियम 50 मिलीग्राम / किग्रा) या सीओ2 साँस लेना के ओवरडोज द्वारा पिल्ले का त्याग करें। इच्छामृत्यु के अन्य तरीके, जैसे कि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और द्विपक्षीय थोरैकोटॉमी, यदि आवश्यक हो तो उपयोग किया जा सकता है।
  2. नेत्रगोलक और कक्षीय ऊतक के बीच संबंध जारी करने के लिए घुमावदार कैंची का उपयोग करें। फिर, नेत्रगोलक के पीछे के हिस्से में घुमावदार संदंश डालें, ऑप्टिक तंत्रिका को दबाएं, और जल्दी से कक्षा से आंख को उठाएं। नेत्रगोलक की सतह से बालों और रक्त को हटाने के लिए पूर्व-ठंडा 1 एक्स फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में नेत्रगोलक धो लें।
  3. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) से भरे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में साफ की गई आंखों को रखें और 12-15 क्रांतियों प्रति मिनट (आरपीएम) (प्रारंभिक निर्धारण) की गति से एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड को एलर्जीनिक, आमतौर पर विषाक्त और बेहद साइटोटॉक्सिक होने के लिए जाना जाता है। सुरक्षा निर्देशों का सख्ती से पालन करें और साँस लेना और त्वचा के संपर्क से बचें।
  4. एक संस्कृति पकवान का उपयोग करें और केंद्रीय भाग में 1x पीबीएस की एक बूंद डाल दिया और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत निम्नलिखित कदम प्रदर्शन और इस बूंद में एक नेत्रगोलक जगह है। संदंश की एक जोड़ी के साथ नेत्रगोलक पकड़ो और ध्यान से एक 1 एमएल सिरिंज सुई का उपयोग कर कॉर्नियल लिम्बस पर कॉर्निया पंचर। कैंची की नोक को इस छेद में डालें और कॉर्निया लिंबस के साथ कॉर्निया को ध्यान से काट लें। सावधान रहें कि रेटिना को न काटें।
  5. संदंश की एक जोड़ी के साथ परितारिका और लेंस निकालें। फिर शेष आईकप को 4% पीएफए में रखें और 12-15 आरपीएम (माध्यमिक निर्धारण) की गति से शेकर पर कमरे के तापमान पर एक और 45 मिनट के लिए फिर से ठीक करें।
  6. एक संस्कृति पकवान का उपयोग करें और मध्य भाग में 1x पीबीएस की एक बूंद डाल दिया। इस बूंद में निश्चित नेत्रगोलक रखें। संदंश की एक जोड़ी के साथ नेत्रगोलक पकड़ो। धीरे दो संदंश का उपयोग कर रेटिना और श्वेतपटल परतों को अलग करें। रेटिना और श्वेतपटल परतों के बीच कैंची की नोक रखें और श्वेतपटल को ऑप्टिक तंत्रिका की ओर काटें। रेटिना से श्वेतपटल को छीलें और रेटिना कप प्राप्त करें।
    नोट: संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका द्वारा पीछे के कप पकड़ो, तो ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर श्वेतपटल पर नीचे दबाने के लिए एक और संदंश के घुमावदार अंत का उपयोग करें और धीरे रेटिना जारी करने के लिए एक विकल्प के रूप में एक आगे व्यापक गति में रेटिना मालिश।
  7. रेडियल हाइलॉइड वाहिकाओं और परिधीय रेटिना के बीच संबंध जारी करने के लिए संदंश का उपयोग करें, हाइलॉइड वाहिकाओं की जड़ को दबाएं जो ऑप्टिक तंत्रिका सिर के करीब है, और हायलॉइड वाहिकाओं को सावधानीपूर्वक काट लें।
  8. रेटिना कप हस्तांतरण करने के लिए टिप कट ऑफ के साथ एक 2 एमएल विंदुक का प्रयोग करें। रेटिना कप को 48-अच्छी तरह से प्लेट में एक अच्छी तरह से रखें और इसे 12-15 आरपीएम की गति से शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 एक्स पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट के लिए धो लें।
  9. रेटिना कप को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएस में) और 5% सामान्य गधा सीरम (पीबीएस में) के मिश्रित समाधान में सेते हैं।
    1. वैकल्पिक रूप से, एक विकल्प के रूप में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रेटिना को ब्लॉक और पारगम्य करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के स्रोत के अनुसार अवरुद्ध सीरम बदलें।
  10. यदि आइसोलेक्टिन बी 4 का उपयोग करके रेटिना वास्कुलचर को लेबल करते हैं, तो रेटिना को 12-15 आरपीएम की गति से शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% सामान्य गधा सीरम (400 μL) और आइसोलेक्टिन बी 4-594 (1: 400) के साथ 48-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में सेते हैं।
    नोट: यदि अन्य मार्करों के साथ रक्त वाहिकाओं को लेबल करना, जैसे कि सीडी 31, या अन्य कोशिकाओं को लेबल करना, तो उन्हें लेबल करने के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  11. 1: 100-1: 500 विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी (400 μL 0.1% सामान्य गधा सीरम में) के साथ रेटिना सेते हैं 48 घंटे के लिए 12-15 आरपीएम की गति से एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  12. कमरे के तापमान पर लौटने के बाद, 12-15 आरपीएम की गति से एक प्रकार के बरतन पर 3 x 20 मिनट के लिए 0.1% पीबीएसटी (पीबीएस में 0.1% ट्राइटनएक्स -100) के साथ रेटिना धो लें।
  13. 12-15 आरपीएम की गति से एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1: 1,000 माध्यमिक एंटीबॉडी (400 μL 0.1% सामान्य गधा सीरम में) के साथ रेटिना सेते हैं। (वैकल्पिक)
    1. वैकल्पिक रूप से, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर उच्च आत्मीयता माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ रेटिना सेते हैं।
  14. नाभिक को लेबल करने के लिए 20-25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएपीआई (1: 1,000) के साथ रेटिना सेते हैं।
    नोट: पूर्व प्रयोग में चरण 10-11 और 13-14 में उपयोग किए जाने वाले सभी एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने अनुपात का परीक्षण करें।
  15. कमरे के तापमान पर 12- 15 आरपीएम की गति से एक प्रकार के बरतन पर 0.1% पीबीएसटी के साथ 3 x 30 मिनट के लिए रेटिना धो लें।
  16. रेटिना कप को ऊपर की ओर खोलने के साथ एक साफ स्लाइड में स्थानांतरित करें। ऑप्टिक तंत्रिका सिर से लगभग 1-1.5 मिमी दूर काटकर परिधीय से केंद्रीय तक 3, 6, 9 और 12 बजे की स्थिति में रेटिना को रेडियल रूप से काटें।
  17. रेटिना को तीन बार कुल्ला करने के लिए 1x पीबीएस की कुछ बूंदें जोड़ें। रेटिना को सुखाने और समतल करने के लिए हवा से रखे कागज का उपयोग करें। कवरस्लिप के केंद्र में बढ़ते माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) की एक बूंद जोड़ें और इसे तब तक जोड़ना बंद कर दें जब तक कि छोटी बूंद का व्यास कवरस्लिप के आधे तक न बढ़ जाए। जल्दी से कवरस्लिप को चालू करें और इसे आउटस्प्रेड रेटिना के ऊपर रखें। बुलबुले बनाने से बचें।
  18. रेटिना फ्लैट माउंट या स्टोर की छवियों को लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से स्लाइड की रक्षा करें।

3. रेटिना फ्लैट माउंट का विश्लेषण और मात्रा का ठहराव

नोट: ओआईआर माउस मॉडल के लिए, शोधकर्ता अक्सर पी 12-पी 25 के दौरान केंद्रीय रेटिना संवहनी रोड़ा और परिधीय रेटिना पैथोलॉजिकल नवसंवहनीकरण के क्षेत्र को रिकॉर्ड करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि रेटिना का केंद्रीय अवस्कुलर क्षेत्र पी 12 पर अधिकतम तक पहुंचता है और धीरे-धीरे पी 13 से पी 17 तक सिकुड़ जाता है; इसी समय, ओआईआर चूहों की रेटिना लगभग पी 1722,29 पर नवसंवहनीकरण क्षेत्र के चरम पर पहुंच जाती है। पी 17 से, नववाहिकाएं धीरे-धीरे पीछे हट जाती हैं और कार्यात्मक वाहिकाएं एवैस्कुलर क्षेत्र में वापस आ जाती हैं। रेटिना वास्कुलचर मूल रूप से पी 2533 पर सामान्य हो जाता है।

  1. 10x उद्देश्य लेंस के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) द्वारा रेटिना फ्लैट माउंट की छवियां लें। सबसे पहले, डीएपीआई चैनल चुनें और दृश्य क्षेत्र के केंद्र में ऑप्टिक तंत्रिका सिर सेट करें। फिर, अन्य चैनलों को समायोजित करें और रेटिना के सतही वास्कुलचर पर ध्यान केंद्रित करें। एक फोटो सॉफ़्टवेयर में टाइल्स की जाँच करें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन फ़ोटो की संख्या निर्धारित करें जिन्हें सिलाई करने की आवश्यकता है। पूरे रेटिना को कैप्चर करने के लिए स्टार्ट एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद वासो-विलोपन (वीओ) और नवसंवहनीकरण (एनवी) के क्षेत्र को मापने के लिए एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    1. सबसे पहले, मैजिक वैंड टूल पर क्लिक करें और चमक में अंतर के अनुसार एक उपयुक्त सहिष्णुता सेट करें और कर्सर को पृष्ठभूमि में ले जाएं और माउस पर क्लिक करें। उसके बाद, रेटिना की एक बुनियादी रूपरेखा प्राप्त करने के लिए व्युत्क्रम का चयन करें चुनें। रेटिना के विवरण को और अधिक रेखांकित करने के लिए लासो टूल का उपयोग करें। हिस्टोग्राम फ़ंक्शन का उपयोग करके, पूरे रेटिना के पिक्सेल मान को रिकॉर्ड करें और इसे लिखें या डेटाबेस प्रोग्राम में एक तालिका उत्पन्न करें।
    2. रेटिना छवि को चार चतुर्थांशों में विभाजित करें। प्रत्येक चतुर्थांश में, वीओ क्षेत्र (चित्रा 2 ए-सी) आकर्षित करने के लिए लासो टूल का उपयोग करें, और एनवी क्षेत्र (चित्रा 2 डी-एफ) का चयन करने के लिए मैजिक वैंड टूल का उपयोग करें। हिस्टोग्राम में पिक्सेल जानकारी के माध्यम से, पूरे रेटिना के लिए वीओ और एनवी के पिक्सेल अनुपात की गणना करें, अर्थात्, पूरे रेटिना के सापेक्ष वीओ या एनवी क्षेत्र का प्रतिशत।
      नोट: गहरी सीखने तंत्रिका नेटवर्क (http://oirseg.org/) का उपयोग करके ओआईआर छवियों में वीओ और एनवी क्षेत्रों की मात्रा का ठहराव के लिए एक ओपन-सोर्स और पूरी तरह से स्वचालित पाइपलाइन भी है, जो शोधकर्ताओं के लिए एक विश्वसनीय और समय बचाने वाला तरीका प्रदान करता है और साथ ही परिमाणीकरण34 के मानक को एकजुट करता है।
  3. स्प्रेडशीट तालिका में पिक्सेल जानकारी रिकॉर्ड करें, जो बाद के विश्लेषण के लिए सुविधाजनक है।

4. फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) के साथ विवो इमेजिंग में

नोट: ओआईआर चूहों के लिए, प्रयोगात्मक जानवरों की मृत्यु के कारण एफआईटीसी छिड़काव और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला दोनों का उपयोग केवल एक समय के लिए किया जा सकता है। इसकी तुलना में, एफएफए के फायदों में से एक विवो35,36 में विकास और रोग राज्य के दौरान माउस रेटिना वाहिकाओं के गतिशील परिवर्तनों का अवलोकन है।

  1. संज्ञाहरण से पहले पिल्ले का वजन करें।
  2. किग्रा की खुराक पर 0.3% पेंटोबार्बिटल सोडियम के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइज पिल्ले।
    नोट: 1 महीने के भीतर चूहों के लिए, संवेदनाहारी खुराक पर ध्यान दें। संज्ञाहरण के कारण चूहों की मृत्यु को कम करने के लिए संवेदनाहारी की कम सांद्रता और खुराक का उपयोग करें। पिल्ले को एनेस्थेटाइज करने के बाद, शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक छोटे हीटिंग पैड का उपयोग करें। हाइपोथर्मिया न केवल पिल्लों के शारीरिक कार्य को प्रभावित करता है, बल्कि क्रिस्टलीन में परिवर्तन की ओर जाता है और मोतियाबिंद के विकास को तेज करता है।
  3. प्रत्येक पिल्ला के लिए 20 μL माइड्रियाटिक आंखों की बूंदों (0.5% उष्णकटिबंधीय + 0.5% फेनिलफ्रिन हाइड्रोक्लोराइड) का उपयोग करें और लंबे समय तक चलने वाले पुतली फैलाव (चित्रा 3 ए, बी) को प्राप्त करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  4. इमेजिंग डिवाइस के सामने संवेदनाहारी पिल्ले लाओ ( सामग्री की तालिका देखें)। पिल्लों को एक छोटे हीटिंग पैड पर रखें, पिल्लों को स्थिर स्थिति में रखें, और कॉर्निया में नमी बनाए रखने के लिए नियमित रूप से कृत्रिम आँसू का उपयोग करें। स्क्रीन के केंद्र में ऑप्टिक तंत्रिका सिर को समायोजित करने के लिए इन्फ्रारेड फंडस इमेजिंग (आईआर) के मोड पर क्लिक करें।
    नोट: पिल्ले की एक आंख का अवलोकन करते समय, दूसरी आंख की रक्षा करना न भूलें। सूखापन के कारण कॉर्निया को सफेद होने से रोकने के लिए हाइप्रोमेलोज आई ड्रॉप का उपयोग करें।
  5. 0.15 एमएल 0.5% फ्लोरोसिन सोडियम नमक समाधान के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद, समय शुरू करने के लिए इमेजिंग डिवाइस के टच पैनल पर तुरंत एफए बटन और इंजेक्शन बटन पर क्लिक करें। रेटिना के रक्त परिसंचरण शिरापरक चरण में प्रवेश करता है और रेटिना कम से कम 6-8 मिनट का निरीक्षण जब 3 मिनट के बाद छवियों रिकॉर्ड।
    नोट: फ्लोरोसिन सोडियम नमक समाधान के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद, पिल्ले की त्वचा, श्लेष्म और मूत्र स्पष्ट पीले हरे रंग का दिखाते हैं। अधिकांश फ्लोरोसिन एक दिन के भीतर पिल्लों द्वारा उत्सर्जित किया जाता है। फ्लोरोसिन सोडियम इंट्रापेरिटोनियल रूप से हर दूसरे दिन छह बार इंजेक्शन लगाने से महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव नहींहोते हैं 37.
  6. ऑप्टिक तंत्रिका सिर को छवि अधिग्रहण क्षेत्र के केंद्र में ले जाएं और केंद्रीय रेटिना की पहली छवि लें। फिर, इमेजिंग डिवाइस के लेंस को क्षैतिज रूप से आंख के नाक की तरफ ले जाएं जब तक कि ऑप्टिक तंत्रिका सिर छवि अधिग्रहण क्षेत्र के एक तरफ के मध्य बिंदु पर स्थित न हो और दूसरी छवि लें। इस विधि (चित्रा 3 सी) का उपयोग करके क्रमशः अस्थायी, बेहतर और अवर रेटिना की छवियां लेना जारी रखें।
    नोट: प्रतिगमन चरण होता है के रूप में 12 मिनट के भीतर "पांच अभिविन्यास" छवियों ले लो। अवर छवि में ऑप्टिक तंत्रिका सिर की स्थिति को लेंस के सीमित कोण समायोजन के कारण साइडलाइन पर गिरने की अनुमति नहीं है।
  7. छवियों को सहेजें और सिलाई के लिए एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करें।

5. फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) की छवि प्रसंस्करण

  1. इमेजिंग प्रसंस्करण कार्यक्रम खोलें और एक काले रंग की पृष्ठभूमि (चित्रा 4 ए) के साथ एक नया कैनवास बनाने के लिए फ़ाइल में नया पर क्लिक करें।
  2. पृष्ठभूमि परत में पहले केंद्रीय रेटिना की एक छवि खोलें। फ़ाइल पर क्लिक करें और दूसरी छवि जोड़ें। दूसरी छवि की अपारदर्शिता को 60% तक समायोजित करें, दूसरी छवि को तब तक स्थानांतरित करें और आकार बदलें जब तक कि दो छवियों के समान हिस्से अत्यधिक ओवरलैप न हों। नि: शुल्क रूपांतरण और ताना मोड के बीच स्विच बटन पर क्लिक करें और यदि आवश्यक हो तो जहाजों के लिए सूक्ष्म समायोजन करें। फिर, दूसरी छवि की अस्पष्टता को 100% (चित्रा 4 ए, बी) में वापस चालू करें।
  3. एक ही समय में दो छवियों का चयन करें और ऑटो-ब्लेंड लेयर्स पर क्लिक करें। मिश्रण विधि के रूप में पैनोरमा की जांच करें और साथ ही निम्नलिखित दो वाक्यों का चयन करें। ठीक पर क्लिक करें और पहले दो छवियों (चित्रा 4 सी, डी) की छवि सिलाई खत्म करें।
  4. पहली दो सिली हुई छवियों को पूरी तरह से लें, तीसरी छवि जोड़ें, और मिश्रण करना जारी रखें। पांच छवियों (चित्रा 4 ई) की सिलाई को पूरा करने के लिए उपरोक्त तरीकों को दोहराएं।
  5. एक समान आकार के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर एफएफए की छवियों को काटने के लिए फसल उपकरण का उपयोग करें और सामान्य और ओआईआर पिल्ले दोनों में पी 15 से पी 25 तक रेटिना वास्कुलचर के गतिशील परिवर्तनों का निरीक्षण करें।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. मानक विचलन (एसडी) ± माध्य के रूप में वर्तमान मान।
  2. दो स्वतंत्र नमूनों की तुलना करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करें। डेटा के कई सेटों की तुलना करने और डनेट या टुकी के परीक्षण के साथ गठबंधन करने के लिए वन-वे एनोवा का उपयोग करें, जो आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एकाधिक तुलना परीक्षण है।
  3. गैर-सामान्य रूप से वितरित डेटा के लिए, मान-व्हिटनी यू परीक्षण या क्रुस्कल वालिस परीक्षण का उपयोग करें। महत्वपूर्ण सांख्यिकीय मतभेदों पर विचार करें जब पी 0.05 <।

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Representative Results

ओआईआर माउस मॉडल में, सबसे महत्वपूर्ण और बुनियादी परिणाम वीओ और एनवी क्षेत्र का परिमाणीकरण है। पी 7 से 5 दिनों के लिए हाइपरोक्सिया वातावरण में रहने के बाद, पिल्ले के केंद्रीय रेटिना ने सबसे बड़ा गैर-छिड़काव क्षेत्र दिखाया। एक और 5 दिनों में हाइपोक्सिया की उत्तेजना के तहत, रेटिना नवसंवहनीकरण धीरे-धीरे उत्पादित किया गया था जो आसपास के सामान्य जहाजों की तुलना में अधिक तीव्रता से फ्लोरोसिस करता था। पी 17 के बाद, पैथोलॉजिकल नवसंवहनीकरण का प्रतिदीप्ति संकेत रेटिना (चित्रा 5 ए) के रीमॉडेलिंग के रूप में तेजी से पीछे हट गया। कूड़े के आकार और पिल्ले के प्रसवोत्तर वजन को नियंत्रित करके, ओआईआर माउस मॉडल के वीओ और एनवी के क्षेत्र ने अच्छी पुनरावृत्ति और स्थिरता दिखाई और रेटिना नवसंवहनीकरण का शिखर पी 17 पर हुआ, जो पिछले अध्ययनों (चित्रा 5 बी, सी) के अनुरूप था।

एफएफए रेटिना वास्कुलचर का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है। विवो में एफएफए के आवेदन को देखते हुए, यह प्रयोगात्मक जानवरों के अपशिष्ट में बहुत कमी दिखाता है और साथ ही समय के साथ रेटिना वाहिकाओं के गतिशील परिवर्तनों को प्रदर्शित करता है। पिछले अध्ययनों में, एफएफए का उपयोग अक्सर चूहों के पिल्ले में नहीं किया जाता था और इसे एकल-दृश्य छवि में प्रस्तुत किया गया था, जो आगे के अध्ययन के लिए मुश्किल था। इस प्रोटोकॉल में, रेटिना वास्कुलचर की "पांच-अभिविन्यास" छवियों को एक समय में रेटिना के व्यापक क्षेत्र को प्रदर्शित करने के लिए एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक साथ सिलाई की गई थी, जो बाद के विश्लेषण के लिए सहायक थी, यदि आवश्यक हो (चित्रा 4)। इसके अलावा, ओआईआर माउस पिल्ले ने लंबे समय तक आंख खोलने को दिखाया, इसलिए पशु नैतिकता की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एफएफए छवियों को पी 15 से लिया गया था। ओआईआर माउस मॉडल के रेटिना में, रक्त वाहिकाओं का व्यास स्पष्ट रूप से बढ़ गया और सामान्य चूहों की तुलना में अत्यधिक यातनापूर्ण हो गया। इसके अलावा, एफएफए ने पिल्ले (चित्रा 6) की मृत्यु के बिना पी 15-पी 25 से आइसोलेक्टिन बी 4-594 के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के साथ रेटिना वास्कुलचर के गतिशील परिवर्तनों की एक समान प्रवृत्ति दिखाई।

Figure 1
चित्रा 1: ओआईआर माउस मॉडल के कार्टून योजनाबद्ध। ओआईआर माउस मॉडल पिल्ले और उनकी नर्सिंग माताओं को कुछ समय (पी 0-पी 7) के लिए एक कमरे में रखकर प्रेरित किया गया था। पी 7 में, दोनों को 5 दिनों के लिए 75% ऑक्सीजन के संपर्क में लाया गया था, जिसने रेटिना पोत के विकास को रोक दिया और केंद्रीय रेटिना में महत्वपूर्ण पोत हानि का कारण बना। चूहों को तब पी 12 में कमरे की हवा में वापस लाया गया था और एवैस्कुलर रेटिना अपेक्षाकृत हाइपोक्सिक होने लगा, जिससे सामान्य पोत पुनर्विकास और मध्य-परिधीय रेटिना के चारों ओर एक रोग प्रतिक्रिया दोनों को ट्रिगर किया गया। अधिकतम नवसंवहनीकरण (एनवी) पी 17 पर देखा गया था। फिर, पैथोलॉजिकल नवसंवहनीकरण सहज प्रतिगमन की प्रक्रिया से गुजरा। रेटिना संवहनी प्रणाली पी 25 के आसपास फिर से सामान्य हो गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माउस रेटिना में वासो-विलोपन (वीओ) और नवसंवहनीकरण (एनवी) का मापन( ए) आइसोलेक्टिन बी 4-594 के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए दाग 10x पी 12 ओआईआर रेटिना पूरे माउंट की छवि। (बी) चयनित एवैस्कुलर क्षेत्र के साथ रेटिना का स्क्रीनशॉट। इस माप को बनाने के लिए आवश्यक उपकरण सफेद तीर के साथ हाइलाइट किए गए हैं: जादू की छड़ी उपकरण और लासो टूल। (सी) रेटिना के एवैस्कुलर क्षेत्र को हाइलाइट करें और छवि को एक प्रति के रूप में सहेजें (डी) आइसोलेक्टिन बी 4-594 के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए दाग 10x पी 17 ओआईआर रेटिना पूरे माउंट की छवि। (ई) चयनित नवसंवहनी टफ्ट्स के साथ रेटिना का स्क्रीनशॉट। जादू की छड़ी उपकरण का प्रयोग करें और एनवी को उजागर करने के लिए एक इष्टतम सहिष्णुता सेट करें। सहिष्णुता को 3-5 पर सेट करें और एंटी-उपनाम और सन्निहित बक्से की जांच करें। (एफ) नवसंवहनीकरण क्षेत्र को केवल एक प्रति के रूप में सहेजें। स्केल पट्टियाँ 1,000 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माउस रेटिना में "पांच अभिविन्यास" छवियों का अधिग्रहण। (ए) सामान्य माउस पुतली। (बी) मायड्रियासिस में माउस पुतली। (सी) रेटिना के केंद्रीय, नाक, लौकिक, बेहतर और अवर क्षेत्र की "पांच-अभिविन्यास" छवियों को क्रमशः एकत्र किया गया था (कमरे की हवा में पी 17 पिल्ले)। स्केल पट्टियाँ 500 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) से "पांच-अभिविन्यास" छवियों को सिलाई करने का सामान्य वर्कफ़्लो( ए) एक काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ एक नया कैनवास बनाएं और केंद्रीय रेटिना की एफएफए छवि खोलें। (बी) अस्थायी रेटिना की एक एफएफए छवि खोलें और दूसरी छवि की अस्पष्टता को 60% तक समायोजित करें; दो छवियों के समान भागों को अत्यधिक ओवरलैप होने तक छवि को स्थानांतरित और आकार बदलें। यदि आवश्यक हो तो सूक्ष्म समायोजन करने के लिए नि: शुल्क रूपांतरण और ताना मोड के बीच स्विच पर क्लिक करें। दूसरी छवि की अपारदर्शिता को 100% पर वापस मोड़ें। (सी) एक ही समय में दो छवियों का चयन करें और ऑटो-ब्लेंड लेयर्स पर क्लिक करें। (डी) पहले दो छवियों की छवि सिलाई को खत्म करने के लिए मिश्रण विधि के रूप में पैनोरमा का उपयोग करें। (ई) सभी छवियों की सिलाई को पूरा करने के लिए उपरोक्त विधियों को दोहराकर छवियों को सिलाई करना जारी रखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ओआईआर माउस मॉडल के रेटिना में वासो-विलोपन (वीओ) और नवसंवहनीकरण (एनवी) की मात्रा का ठहराव। (ए) पी 12 से पी 25 तक आइसोलेक्टिन बी 4-594 के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए दाग वाले 10 एक्स ओआईआर रेटिना पूरे माउंट की छवि। 5 दिनों के लिए 75% ऑक्सीजन के संपर्क में आने के बाद, पिल्ले और उनकी नर्सिंग माताओं को पी 12 में कमरे की हवा में वापस लाया गया, जिस पर वासो-विलोपन का क्षेत्र अधिकतम तक पहुंच गया। केंद्रीय रेटिना में सापेक्ष हाइपोक्सिया ने इस क्षेत्र में पोत पुनर्विकास के साथ-साथ मध्य-परिधीय रेटिना में पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस का नेतृत्व किया। पी 17 में, प्री-रेटिना नियोवास्कुलर टफ्ट्स अधिकतम तक पहुंच गए और फिर जल्दी से सिकुड़ गए। एनवी पूरी तरह से पीछे हट गया और रेटिना लगभग पी 25 पर सामान्य लग रहा था। (बी) वीओ के क्षेत्र की मात्रा का ठहराव पी 12 पर एक चोटी और लगभग पी 25 पर गायब हो गया। (सी) एनवी के क्षेत्र की मात्रा का ठहराव पी 17 पर एक चोटी और पी 25 के आसपास प्रतिगमन दिखाया। स्केल बार ए में 1,000 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं (वन-वे एनोवा, * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: ओआईआर माउस मॉडल में फ्लोरोसिन फंडस एंजियोग्राफी (एफएफए) के विवो इमेजिंग में। ओआईआर माउस मॉडल के रेटिना में, रक्त वाहिकाओं का व्यास स्पष्ट रूप से बढ़ गया और सामान्य चूहों की तुलना में अत्यधिक यातनापूर्ण हो गया। इसके अलावा, एफएफए ने चूहों के पिल्ले की मृत्यु के बिना पी 15-पी 25 से आइसोलेक्टिन बी 4-594 के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के साथ रेटिना वास्कुलचर के गतिशील परिवर्तनों की एक समान प्रवृत्ति दिखाई। स्केल पट्टियाँ 500 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ओआईआर के लिए चूहों की संवेदनशीलता कई कारकों से प्रभावित होती है। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और उपभेदों के पिल्लों की तुलना नहीं की जा सकती है। सी अल्बिनो चूहों में, जहाजों को महत्वपूर्ण कम नवसंवहनी टफ्ट्स 38 के साथ वीओ क्षेत्र में तेजी से फिर सेबढ़ता है, जो अनुसंधान में कुछ कठिनाइयों को लाता है। सी 57 बीएल /6 चूहों में, बीएएलबी / सीजे माउस तनाव39,40 की तुलना में फोटोरिसेप्टर क्षति में वृद्धि हुई है। वही विभिन्न प्रकार के ट्रांसजेनिक चूहों 41,42,43 के लिए जाता है। इसके अलावा, सी 57 बीएल / 6 चूहों में 12 9 एस 3 / एसवीआईएम चूहों44 की तुलना में एंजियोजेनेसिस का निम्न स्तर प्रदर्शित होता है।

प्रसवोत्तर वजन बढ़ना (पीडब्ल्यूजी)45 पर विचार करने के लिए भी महत्वपूर्ण है और नवजात शिशुओं की पोषण संबंधी स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए संकेतकों में से एक है। यह आरओपी की भविष्यवाणी करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका भी बन गया है, जो कई पशुमॉडलरों 46 का ध्यान आकर्षित करता है। पीडब्ल्यूजी हाइपरोक्सिया और हाइपोक्सिया के लिए चूहों की प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। पी 7 में, शरीर के वजन में वृद्धि (>5 ग्राम) वाले पिल्ले अपर्याप्त वासो-विलोपन और रेटिना नवसंवहनीकरण दिखाते हैं, जबकि शरीर के वजन में कमी (<5 ग्राम) वाले पिल्ले हाइपरोक्सिया और हाइपोक्सिया के लिए स्पष्ट प्रतिक्रिया दिखाते हैं। इसके अलावा, पी 17 में, खराब (<5 ग्राम) और व्यापक (>7.5 ग्राम) वजन बढ़ाने वाले पिल्ले कम एनवी दिखाते हैं। हालांकि, खराब वजन बढ़ाने वाले पिल्ले (<5 ग्राम) एनवी पीक 45 की घटना में देरी के साथ वासो-विलोपन (वीओ) और नवसंवहनीकरण (एनवी) चरण को काफी लंबा करदेते हैं। इसलिए, पी 7 और पी 17 पर पिल्ले के पीडब्ल्यूजी को रिकॉर्ड और नियंत्रित करना और प्रयोग की पुनरावृत्ति और तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए कम पीडब्ल्यूजी (पी 17 में < 6 ग्राम) के साथ पिल्ले को खत्म करना आवश्यक है।

कूड़े के आकार का पीडब्ल्यूजी पर अधिक प्रभाव पड़ता है, और कुछ शोधकर्ताओं का सुझाव है कि पीडब्ल्यूजी22,31 की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए इसे 6-8 पिल्ले / बांध तक सीमित किया जाना चाहिए। नर्सिंग मां की स्थिति पर भी विचार करने की आवश्यकता है। नर्सिंग माताओं को हाइपरॉक्सिक वातावरण में फेफड़ों की क्षति से मरने की अधिक संभावना है47. यदि नर्सिंग माताओं की मृत्यु हो जाती है या ओआईआर के प्रेरण के दौरान और बाद में अपने पिल्ले की उपेक्षा करते हैं, तो पिल्ले आसानी से वजन कम कर लेंगे या पोषण की कमी के कारण भी मर जाएंगे। इसलिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि उन्हें बदलने के लिए पर्याप्त सरोगेट माताएं हैं। हालांकि, इन सरोगेट माताओं को केवल तभी उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है जब मां समाप्त हो जाती है, जो आमतौर पर हाइपरोक्सिया एक्सपोजर की अवधि के दौरान होती है या कमरे की हवामें वापस आ जाती है 22. नर्सिंग माताओं के लिए पर्याप्त भोजन प्रदान करना उनके पिल्लों की पोषण स्थिति में सुधार करने में भी सहायक है।

रेटिना फ्लैट माउंट तैयार करने के लिए एक उपयोगी नोट यह है कि निर्धारण का एक इष्टतम समय आमतौर पर आगे लंबे समय तक धुंधला होने के लिए आवश्यक है। पी 12-पी 25 के चूहों के रूप में, कमरे के तापमान पर 15 मिनट + 45 मिनट निर्धारण की सिफारिश की जाती है29. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रेटिना को ठीक करना एक विकल्प है यदि समय सीमित है। इसके अलावा, 1% ट्राइटन एक्स -100 और 5% सामान्य गधा सीरम की उच्च एकाग्रता के साथ पारगम्य और अवरुद्ध बफर प्रभावी रूप से हमारे अनुभव के अनुसार इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की पृष्ठभूमि को कम करता है।

आइसोलेक्टिन बी 4 धुंधला और एफआईटीसी-डेक्सट्रान छिड़काव आमतौर पर नवसंवहनी48,49 की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के तरीकों का उपयोग किया जाता है। इन दो तरीकों की एक बड़ी सीमा यह है कि चूहों की बलि दी जानी चाहिए। तो, विवो इमेजिंग और एनवी की मात्रा का ठहराव के तरीकों की आवश्यकता है29. पीक्स एट अल सामयिक एंडोस्कोपी फंडस इमेजिंग (टीईएफआई) नामक एक तकनीक विकसित की, जो जीवित चूहों50 में रेटिना की उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिजिटल तस्वीरें प्रदान करती है। टीईएफआई पी 15 के रूप में रेटिना संवहनी परिवर्तनों का पता लगा सकता है और प्राप्त छवियां मूल्यांकन के पारंपरिक तरीकों के अनुसार हैं। मेज़ू-एनडुबुइसी एट अल ने विवो रेटिना संवहनी ऑक्सीजन तनाव (पीओ2) माप और फ्लोरोसिन एंजियोग्राफी (एफए) के तरीकों को प्रदान किया, जिससे आरओपी और अन्य इस्केमिक रेटिना रोगों के कारण रेटिना संवहनी परिवर्तन और ऑक्सीजन परिवर्तन की समझ में सुधारहुआ। यद्यपि न तो टीईएफआई और न ही एफए पारंपरिक तरीकों के रूप में सटीक है, वे प्रयोगात्मक जानवरों की मृत्यु को कम करते हैं और बार-बार प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अलावा, वे प्रत्येक माउस को अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में सेवा करने की अनुमति देते हैं, इस प्रकार ओआईआर डेटा को अधिक तुलनीय बनाते हैं। इस पेपर में, एफएफए इमेजिंग और छवि सिलाई की एक बेहतर विधि प्रदान की जाती है। 1 महीने के भीतर पिल्ले पर एफएफए करना आसान नहीं है क्योंकि अत्यधिक संज्ञाहरण और हाइपोथर्मिया सीधे पिल्ले की मृत्यु का कारण बनते हैं। इस प्रकार, संज्ञाहरण की न्यूनतम खुराक का उपयोग करने का प्रयास करें और एक छोटे हीटिंग पैड का उपयोग करके प्रक्रिया के दौरान और बाद में पिल्ले के शरीर के तापमान को बनाए रखने पर विशेष ध्यान दें। निम्नलिखित अवलोकन की विफलता के मामले में हमेशा नमकीन और हाइप्रोमेलोज के साथ ओकुलर सतह को गीला करें।

संक्षेप में, ओआईआर माउस मॉडल रेटिना इस्किमिया और पैथोलॉजिकल नियोवास्कुलराइजेशन का एक बहुत ही आम और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल है। इस मॉडल की प्रमुख समस्याओं में से एक यह है कि नवजात चूहे पिल्ले अनिवार्य रूप से स्वस्थ होते हैं और समय से पहले पैदा हुए शिशुओं की तुलना में चयापचय अस्थिरता या श्वसन समस्याएं नहीं होती हैं। ओआईआर माउस मॉडल और मनुष्यों के बीच एक और अंतर यह है कि मानव रेटिना नवसंवहनीकरण में हमेशा फाइब्रोवास्कुलर प्रसार होता है जबकि रेटिना नवसंवहनी ओआईआर माउस मॉडल51 में फाइब्रोसिस से जुड़ा नहीं होता है। इस मॉडल का बेहतर उपयोग करने और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, ओआईआर रेटिना वास्कुलचर के गतिशील परिवर्तनों की निगरानी के लिए एफएफए का उपयोग करने का एक विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है, जिसमें "पांच-अभिविन्यास" छवियों और छवि प्रसंस्करण लेने के तरीके शामिल हैं। यह माना जाता है कि रेटिना वास्कुलचर49 की आकृति विज्ञान और कार्य का निरीक्षण और मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला को बदलने के लिए एफएफए आंशिक रूप से या पूरी तरह से एक प्रभावी तरीका बन जाएगा। यद्यपि ओआईआर माउस मॉडल पूरी तरह से मनुष्यों में विभिन्न इस्केमिक रेटिनोपैथी के माइक्रोएन्वायरमेंट और रोगजनन जैसा नहीं है, यह हमें दवा और ट्रांसजेनिक प्रयोगों का संचालन करने के साथ-साथ इस्केमिक रेटिना51 पर पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस के तंत्र का पता लगाने का अवसर प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम अपनी प्रयोगशाला और झोंगशान नेत्र केंद्र के नेत्र पशु प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम प्रायोगिक समर्थन के लिए प्रोफेसर चुनकियाओ लियू को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी: 81670872) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बीजिंग, चीन), गुआंग्डोंग प्रांत, चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019 ए 1515011347), और झोंगशान नेत्र केंद्र में नेत्र विज्ञान की राज्य कुंजी प्रयोगशाला से उच्च स्तरीय अस्पताल निर्माण परियोजना (अनुदान संख्या 303020103; गुआंगज़ौ, गुआंग्डोंग प्रांत, चीन)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sterile syringe Solarbio YA0550 For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech  FG701-01 For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube Corning MCT-200-C For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3548 For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides Various For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019 Adobe Inc. For image analysis
Carbon dioxide gas Various For sacrifice
Cover slide Various For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps World Precision Instruments 14127 For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution Abcam ab228549 For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope Olmpus SZ61 For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium Sigma-Aldrich F6377 For in vivo imaging
Fluorescent Microscope  Zeiss AxioImager.Z2 For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech  0100-01 For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose Maya 89161 For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody Invitrogen I21413 For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J GemPharmatech of Jiangsu Province For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242 For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps World Precision Instruments  501978-6 For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum Abcam ab7475 For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor Various For monitoring the level of O2
OxyCycler Biospherix A84XOV For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG For tissue fixation
Pentobarbital sodium Various For anesthesia
Soda lime Various For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT Heidelberg HC00500002 For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0 IBM For statistical analysis
Tansference decloring shaker Kylin-Bell ZD-2008 For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment) Corning 3261-20EA For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes Various For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100 Sigma-Aldrich  SLBW6818 For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide Various For in vivo imaging
ZEN Imaging Software ZEISS For image acquisition and export

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References

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जीव विज्ञान अंक 170
ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी माउस मॉडल में रेटिना वाहिकाओं के गतिशील विकास की निगरानी
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Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic… More

Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model. J. Vis. Exp. (170), e62410, doi:10.3791/62410 (2021).

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