Из мышиных гепатоцитов была создана долгосрочная система 3D органоидных культур ex vitro . Эти органоиды могут быть пройдены и генетически обработаны лентивирусной инфекцией шРНК/эктопической конструкции, трансфекцией siRNA и инженерией CRISPR-Cas9.
Печень является самым крупным органом у млекопитающих. Он играет важную роль в хранении глюкозы, секреции белка, метаболизме и детоксикации. Как исполнитель для большинства функций печени, первичные гепатоциты имеют ограниченную пролиферирующую способность. Это требует установления моделей расширения гепатоцитов ex vivo для физиологических и патологических исследований печени. Здесь мы выделили мышиные гепатоциты двумя этапами перфузии коллагеназы и создали 3D-органоидную культуру как «мини-печень» для рекапитуляции клеточно-клеточных взаимодействий и физических функций. Органоиды состоят из гетерогенных клеточных популяций, включая предшественников и зрелые гепатоциты. Мы подробно вводим процесс выделения и культивирования мышиных гепатоцитов или фетальных гепатоцитов с образованием органоидов в течение 2-3 недель и показываем, как проходить их путем механического пипетирования вверх и вниз. Кроме того, мы также представим, как переваривать органоиды в отдельные клетки для лентивирусной инфекции шРНК/ эктопической конструкции, трансфекции siRNA и инженерии CRISPR-Cas9. Органоиды могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и фундаментальных исследований печени путем моделирования биологии печени и патобиологии.
Органоиды представляют собой самоорганизованные, трехмерные (3D) кластеры in vitro, которые включают самообновляющиеся стволовые клетки и многолинейные дифференцированные клетки1,2. Органоиды многих органов были установлены либо из плюрипотентных, либо из взрослых стволовых клеток с помощью четко определенных нишевых факторов, включая кишечник, мозг, толстую кишку, почки, печень, поджелудочную железу, щитовидную железу, желудок, кожу и легкие3,4,5,6,7 . Органоиды рекапитулируют функции физических клеток, имитируя либо развитие (происходящее из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, PSC), либо прогрессирование гомеостаза / регенерации (происходящее из взрослых стволовых клеток, ASC), что открывает новые возможности в исследованиях и терапии заболеваний8,9.
Как самый большой орган у млекопитающих, печень в основном отвечает за хранение, метаболизм и детоксикацию. Два типа эпителиальных клеток, гепатоциты и холангиоциты, конструируют основную единицу дольки печени. Гепатоциты отвечают за 70-80% функции печени10. Хотя печень обладает замечательной способностью к регенерации, быстрая потеря особенностей гепатоцитов происходит во время традиционного монослойного культивирования путем дисрегулируемой поляризации клеток и дедифференциации, что увеличивает потребность исследователей и клиницистов в построении моделей печени в чашке. Однако до недавнего времени модели расширения ex vivo из первичных гепатоцитов не были хорошо установлены11,12,13,14,15. Органоиды печени могут быть установлены из эмбриональных / индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, превращения фибробластов в гепатоцитоподобные клетки и клеток тканевого происхождения. Развитие органоидов печени стимулирует применение модели in vitro для скрининга лекарств и анализов токсичности печени16,17.
Здесь мы опишем подробный протокол установления органоидов печени из первичных гепатоцитов мышей. Используя этот протокол, мы создали культуральную систему in vitro из органоидов гепатоцитов с двумя перфузиями коллагеназы. Эти органоиды могут быть пройдены для долгосрочного расширения в течение нескольких месяцев. Их физиологическая функция в значительной степени согласуется с гепатоцитами. Кроме того, мы также предоставляем подробное описание того, как выполнять генетические манипуляции, такие как лентивирусная инфекция, трансдукция siRNA и инженерия CRISPR-Cas9 с использованием органоидов. Распространение органоидов гепатоцитов пролило свет на возможность использования органоидов для понимания биологии печени и разработки персонализированных и трансляционных подходов к медицине.
Способность культивировать зрелые гепатоциты в течение длительных периодов времени имеет основополагающее значение для изучения фундаментальной науки о печени, токсикологии лекарств и гепатотропных микробиологических инфекций, таких как малярия и вирусы гепатита. Имея четко опред?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Ханса Клеверса за любезное предоставление клеточных линий для получения рекомбинантного R-спондина1. Эта работа была поддержана грантами Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA0111400), Национального фонда естественных наук Китая (31970779) для H.H. и Группы междисциплинарных и инновационных исследований Фондов для молодежи Шаньдунского университета (2020QNQT003) до H.H.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |