माउस हेपेटोसाइट्स से एक दीर्घकालिक पूर्व विट्रो 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई थी। इन ऑर्गेनोइड्स को पारित किया जा सकता है और आनुवंशिक रूप से shRNA / एक्टोपिक निर्माण, siRNA अभिकर्मक और CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग के lentivirus संक्रमण द्वारा हेरफेर किया जा सकता है।
जिगर स्तनधारियों में सबसे बड़ा अंग है। यह ग्लूकोज भंडारण, प्रोटीन स्राव, चयापचय और विषहरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। जिगर के अधिकांश कार्यों के लिए निष्पादक के रूप में, प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में सीमित प्रसार क्षमता होती है। इसके लिए जिगर शारीरिक और रोग संबंधी अनुसंधान के लिए पूर्व विवो हेपेटोसाइट विस्तार मॉडल की स्थापना की आवश्यकता होती है। यहां, हमने कोलेजेनेस परफ्यूजन के दो चरणों से मुरीन हेपेटोसाइट्स को अलग किया और सेल-सेल इंटरैक्शन और भौतिक कार्यों को दोहराने के लिए ‘मिनी-लिवर’ के रूप में एक 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना की। ऑर्गेनोइड्स में पूर्वजों और परिपक्व हेपेटोसाइट्स सहित विषम कोशिका आबादी होती है। हम 2-3 सप्ताह के भीतर ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए मुरीन हेपेटोसाइट्स या भ्रूण हेपेटोसाइट को अलग करने और संस्कृति करने के लिए विस्तृत रूप से प्रक्रिया का परिचय देते हैं और दिखाते हैं कि यांत्रिक रूप से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके उन्हें कैसे पारित किया जाए। इसके अलावा, हम यह भी पेश करेंगे कि shRNA / एक्टोपिक निर्माण, siRNA अभिकर्मक और CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग के लेंटिवायरस संक्रमण के लिए एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड्स को कैसे पचाया जाए। ऑर्गेनोइड्स का उपयोग दवा स्क्रीन, रोग मॉडलिंग और जिगर जीव विज्ञान और पैथोबायोलॉजी के मॉडलिंग द्वारा बुनियादी जिगर अनुसंधान के लिए किया जा सकता है।
ऑर्गेनोइड्स इन विट्रो क्लस्टर में स्व-संगठित, तीन-आयामी (3 डी) हैं जिनमें स्व-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाएं और बहु-वंश विभेदित कोशिकाएं शामिल हैं1,2। कई अंगों के ऑर्गेनोइड्स को आंत, मस्तिष्क, बृहदान्त्र, गुर्दे, यकृत, अग्न्याशय, थायराइड, पेट, त्वचा और फेफड़ों सहित अच्छी तरह से परिभाषित आला कारकों द्वारा प्लुरिपोटेंट या वयस्क स्टेम कोशिकाओं से स्थापित किया गया है3,4,5,6,7 . ऑर्गेनोइड्स या तो विकास (भ्रूण या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं, पीएससी से उत्पन्न) या होमोस्टैसिस / पुनर्जनन प्रगति (वयस्क स्टेम कोशिकाओं, एएससी से उत्पन्न) की नकल करके भौतिक कोशिका कार्यों को दोहराते हैं, जो रोग अनुसंधान और चिकित्सा में नए रास्ते खोलता है8,9।
स्तनधारियों में सबसे बड़े अंग के रूप में, जिगर मुख्य रूप से भंडारण, चयापचय और detoxification के लिए जिम्मेदार है। दो प्रकार के उपकला सेल प्रकार, हेपेटोसाइट्स और चोलएंजियोसाइट्स, एक जिगर लोब्यूल की मूल इकाई का निर्माण करते हैं। हेपेटोसाइट्स 70-80% जिगर समारोह 10 के लिए जिम्मेदार हैं। यद्यपि जिगर में उल्लेखनीय पुनर्जनन क्षमता होती है, हेपेटोसाइट विशेषताओं का तेजी से नुकसान पारंपरिक मोनोलेयर के दौरान होता है जो डिस्रेगुलेटेड सेल ध्रुवीकरण और विभेदन द्वारा खेती करता है, जो शोधकर्ताओं और चिकित्सकों की आवश्यकता को बढ़ाता है ताकि एक डिश में ‘गैप-ब्रिजिंग’ यकृत मॉडल का निर्माण किया जा सके। हालांकि, हाल ही में प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से पूर्व विवो विस्तार मॉडल अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया था11,12,13,14,15। जिगर organoids भ्रूण / प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं, हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट रूपांतरण, और ऊतक व्युत्पन्न कोशिकाओं से स्थापित किया जा सकता है। जिगर organoids के विकास दवा स्क्रीन और जिगर विषाक्तता assays16,17 के लिए एक इन विट्रो मॉडल के आवेदन को बढ़ाता है.
यहां, हम मुरीन प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से यकृत ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने कोलेजेनेस के दो परफ्यूजन के साथ हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स की एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली स्थापित की। इन ऑर्गेनोइड्स को महीनों तक दीर्घकालिक विस्तार के लिए पारित किया जा सकता है। उनका शारीरिक कार्य हेपेटोसाइट्स के साथ अत्यधिक सुसंगत है। इसके अलावा, हम आनुवंशिक हेरफेर करने के तरीके का एक विस्तृत विवरण भी प्रदान करते हैं, जैसे कि लेंटिवायरस संक्रमण, siRNA ट्रांसडक्शन, और CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके। हेपेटोसाइट ऑर्गेनोइड्स का प्रसार यकृत जीव विज्ञान को समझने और व्यक्तिगत और ट्रांसलेशनल दवा दृष्टिकोण विकसित करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने की संभावना पर प्रकाश डालता है।
लंबे समय तक परिपक्व हेपेटोसाइट्स को संस्कृति करने की क्षमता यकृत के बुनियादी विज्ञान, दवा विष विज्ञान और हेपेटोट्रोपिक होस्ट-माइक्रोबायोलॉजी संक्रमण जैसे मलेरिया और हेपेटाइटिस वायरस का अध्ययन करन?…
The authors have nothing to disclose.
हम पुनः संयोजक आर-spondin1 का उत्पादन करने के लिए सेल लाइनों को प्रदान करने के लिए कृपया प्रदान करने के लिए प्रोफेसर हंस Clevers धन्यवाद. इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2019YFA0111400), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31970779) से एचएच को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और शेडोंग विश्वविद्यालय के युवा अंतःविषय और नवाचार अनुसंधान समूह (2020QNQT003) के लिए धन एच.एच.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |