Un système de culture organoïde 3D ex vitro à long terme a été établi à partir d’hépatocytes de souris. Ces organoïdes peuvent être passés et génétiquement manipulés par l’infection à lentivirus de la construction shRNA/ectopique, la transfection de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9.
Le foie est le plus grand organe chez les mammifères. Il joue un rôle important dans le stockage du glucose, la sécrétion de protéines, le métabolisme et la désintoxication. En tant qu’exécuteur testamentaire de la plupart des fonctions hépatiques, les hépatocytes primaires ont une capacité de prolifération limitée. Cela nécessite l’établissement de modèles d’expansion des hépatocytes ex vivo pour la recherche physiologique et pathologique du foie. Ici, nous avons isolé les hépatocytes murins par deux étapes de perfusion de collagénase et établi une culture organoïde 3D en tant que « mini-foie » pour récapituler les interactions cellule-cellule et les fonctions physiques. Les organoïdes sont constitués de populations cellulaires hétérogènes comprenant des progéniteurs et des hépatocytes matures. Nous présentons le processus en détail pour isoler et cultiver les hépatocytes murins ou les hépatocytes fœtaux pour former des organoïdes dans les 2-3 semaines et montrer comment les passer en les piquant mécaniquement de haut en bas. En outre, nous présenterons également comment digérer les organoïdes en cellules individuelles pour l’infection lentivirus de la construction shRNA / ectopique, la transfection de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9. Les organoïdes peuvent être utilisés pour les dépistages de médicaments, la modélisation des maladies et la recherche fondamentale sur le foie en modélisant la biologie et la pathobiologie du foie.
Les organoïdes sont des grappes in vitro tridimensionnelles (3D) auto-organisées qui comprennent des cellules souches auto-renouvelées et des cellules différenciées multi-lignées1,2. Les organoïdes de nombreux organes ont été établis à partir de cellules souches pluripotentes ou adultes par des facteurs de niche bien définis, notamment l’intestin, le cerveau, le côlon, les reins, le foie, le pancréas, la thyroïde, l’estomac, la peau et les poumons3,4,5,6,7 . Les organoïdes récapitulent les fonctions cellulaires physiques en imitant soit le développement (provenant de cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites, PSC), soit la progression de l’homéostasie/régénération (provenant de cellules souches adultes, ASC), ce qui ouvre de nouvelles voies dans la recherche et le traitement des maladies8,9.
En tant que plus grand organe chez les mammifères, le foie est principalement responsable du stockage, du métabolisme et de la désintoxication. Deux types de cellules épithéliales, les hépatocytes et les cholangiocytes, construisent l’unité de base d’un lobule hépatique. Les hépatocytes sont responsables de 70 à 80 % de la fonction hépatique10. Bien que le foie ait une capacité de régénération remarquable, la perte rapide des caractéristiques hépatocytaires se produit lors de la culture traditionnelle de monocouches par polarisation et dédifférenciation cellulaires dérégulées, ce qui augmente le besoin des chercheurs et des cliniciens de construire des modèles hépatiques « pontant les lacunes » dans un plat. Cependant, jusqu’à récemment, les modèles d’expansion ex vivo des hépatocytes primaires n’avaient pas été bien établis11,12,13,14,15. Les organoïdes hépatiques peuvent être établis à partir de cellules souches pluripotentes embryonnaires / induites, de la conversion des fibroblastes en cellules de type hépatocytaire et de cellules dérivées de tissus. Le développement d’organoïdes hépatiques stimule l’application d’un modèle in vitro pour les dépistages de médicaments et les tests de toxicité hépatique16,17.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour établir des organoïdes hépatiques à partir d’hépatocytes primaires murins. En utilisant ce protocole, nous avons mis en place un système de culture in vitro d’organoïdes hépatocytaires avec deux perfusions de collagénase. Ces organoïdes peuvent être passés pour une expansion à long terme pendant des mois. Leur fonction physiologique est très cohérente avec les hépatocytes. En outre, nous fournissons également une description détaillée de la façon d’effectuer des manipulations génétiques, telles que l’infection à lentivirus, la transduction de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9 à l’aide d’organoïdes. La propagation des organoïdes hépatocytaires a mis en lumière la possibilité d’utiliser des organoïdes pour comprendre la biologie du foie et développer des approches de médecine personnalisée et translationnelle.
La capacité de cultiver des hépatocytes matures sur de longues périodes est fondamentale dans l’étude de la science fondamentale du foie, de la toxicologie des médicaments et des infections hépatotropes en microbiologie de l’hôte telles que le paludisme et les virus de l’hépatite. Avec une niche bien définie, le protocole met ici en place un système de culture pour les hépatocytes. Ce protocole pousse les hépatocytes matures à se développer en culture 3D avec une hétérogénéité qui récapitule l?…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le professeur Hans Clevers d’avoir aimablement fourni les lignées cellulaires pour produire de la R-spondine recombinante1. Ce travail a été soutenu par les subventions du National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), de la National Natural Science Foundation of China (31970779) à H.H., et du Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group de l’Université du Shandong (2020QNQT003) à H.H.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |