Et langsiktig ex vitro 3D organoid kultursystem ble etablert fra musen hepatocytter. Disse organoidene kan passeres og genetisk manipuleres ved lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid.
Leveren er det største organet i pattedyr. Det spiller en viktig rolle i glukoselagring, proteinsekresjon, metabolisme og avgiftning. Som eksekutor for de fleste leverfunksjonene har primære hepatocytter begrenset spredningskapasitet. Dette krever etablering av ex vivo hepatocyte ekspansjonsmodeller for leverfysiologisk og patologisk forskning. Her isolerte vi murine hepatocytter med to trinn collagenase perfusjon og etablerte en 3D organoid kultur som “mini-leveren” for å rekapitulere cellecelleinteraksjoner og fysiske funksjoner. Organoidene består av heterogene cellepopulasjoner, inkludert forfedre og modne hepatocytter. Vi introduserer prosessen i detalj for å isolere og kultur murine hepatocytter eller føtal hepatocytt for å danne organoider innen 2-3 uker og vise hvordan du passerer dem ved mekanisk pipettering opp og ned. I tillegg vil vi også introdusere hvordan du fordøyer organoidene i enkeltceller for lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid. Organoidene kan brukes til legemiddelskjermer, sykdomsmodellering og grunnleggende leverforskning ved modellering av leverbiologi og patobiologi.
Organoider er selvorganiserte, tredimensjonale (3D) in vitro-klynger som inkluderer selvfornyende stamceller og flerlinjede differensierte celler1,2. Organoidene i mange organer har blitt etablert enten fra pluripotente eller voksne stamceller av veldefinerte nisjefaktorer, inkludert tarmen, hjernen, tykktarmen, nyrene, leveren, bukspyttkjertelen, skjoldbruskkjertelen, magen, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoidene rekapitulerer fysiske cellefunksjoner ved å etterligne enten utvikling (stammer fra embryonale eller induserte pluripotente stamceller, PSCer) eller homeostase/regenereringsprogresjon (stammer fra voksne stamceller, ASC), som åpner nye veier i sykdomsforskning og terapi8,9.
Som det største organet i pattedyr er leveren hovedsakelig ansvarlig for lagring, metabolisme og avgiftning. To typer epitelceller, hepatocytter og cholangiocytter, konstruerer den grunnleggende enheten av en leverlobul. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% leverfunksjon10. Selv om leveren har bemerkelsesverdig regenereringskapasitet, skjer raskt tap av hepatocyttfunksjoner under tradisjonell monolayerkultur ved dysregulert cellepolarisering og dedifferentiasjon, noe som øker behovet for forskere og klinikere for å bygge “gap-brobygging” levermodeller i en tallerken. Inntil nylig hadde imidlertid ex vivo-utvidelsesmodellene fra primære hepatocytter ikke blitt godt etablert11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale/induserte pluripotente stamceller, fibroblastkonvertering til hepatocyttlignende celler og vevsavledede celler. Utviklingen av leverorganoider øker anvendelsen av en in vitro-modell for legemiddelskjermer og levertoksisitetsanalyser16,17.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for etablering av leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved å bruke denne protokollen setter vi opp et in vitro kultursystem av hepatocytt organoider med to perfusjoner av kollagenalus. Disse organoidene kan passeres for langsiktig ekspansjon i flere måneder. Deres fysiologiske funksjon er svært konsistent med hepatocytter. Videre gir vi også en detaljert beskrivelse av hvordan man utfører genetisk manipulasjon, for eksempel lentivirusinfeksjon, siRNA-transduksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid ved hjelp av organoider. Forplantningen av hepatocyttorganoider kaster lys over muligheten for å bruke organoider for å forstå leverbiologi og utvikle personlige og translasjonelle medisintilnærminger.
Evnen til å dyrke modne hepatocytter over lange perioder er grunnleggende for å studere leverens grunnleggende vitenskap, narkotikatoksikologi og hepatotrope vertsmikrobiologiske infeksjoner som malaria og hepatittvirus. Med en veldefinert nisje setter protokollen her opp et kultursystem for hepatocytter. Denne protokollen driver modne hepatocytter til å ekspandere i 3D-kultur med en heterogenitet som rekapitulerer cellecelleinteraksjon, de fleste hepatocyttfunksjon og genetiske modifikasjoner, slik at utformingen av …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Hans Clevers for vennlig å gi cellelinjene for å produsere rekombinant R-spondin1. Dette arbeidet ble støttet av bevilgningene fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) til H.H., og Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) til H.H.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |