Summary
Из мышиных гепатоцитов была создана долгосрочная система 3D органоидных культур ex vitro . Эти органоиды могут быть пройдены и генетически обработаны лентивирусной инфекцией шРНК/эктопической конструкции, трансфекцией siRNA и инженерией CRISPR-Cas9.
Abstract
Печень является самым крупным органом у млекопитающих. Он играет важную роль в хранении глюкозы, секреции белка, метаболизме и детоксикации. Как исполнитель для большинства функций печени, первичные гепатоциты имеют ограниченную пролиферирующую способность. Это требует установления моделей расширения гепатоцитов ex vivo для физиологических и патологических исследований печени. Здесь мы выделили мышиные гепатоциты двумя этапами перфузии коллагеназы и создали 3D-органоидную культуру как «мини-печень» для рекапитуляции клеточно-клеточных взаимодействий и физических функций. Органоиды состоят из гетерогенных клеточных популяций, включая предшественников и зрелые гепатоциты. Мы подробно вводим процесс выделения и культивирования мышиных гепатоцитов или фетальных гепатоцитов с образованием органоидов в течение 2-3 недель и показываем, как проходить их путем механического пипетирования вверх и вниз. Кроме того, мы также представим, как переваривать органоиды в отдельные клетки для лентивирусной инфекции шРНК/ эктопической конструкции, трансфекции siRNA и инженерии CRISPR-Cas9. Органоиды могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и фундаментальных исследований печени путем моделирования биологии печени и патобиологии.
Introduction
Органоиды представляют собой самоорганизованные, трехмерные (3D) кластеры in vitro, которые включают самообновляющиеся стволовые клетки и многолинейные дифференцированные клетки1,2. Органоиды многих органов были установлены либо из плюрипотентных, либо из взрослых стволовых клеток с помощью четко определенных нишевых факторов, включая кишечник, мозг, толстую кишку, почки, печень, поджелудочную железу, щитовидную железу, желудок, кожу и легкие3,4,5,6,7 . Органоиды рекапитулируют функции физических клеток, имитируя либо развитие (происходящее из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, PSC), либо прогрессирование гомеостаза / регенерации (происходящее из взрослых стволовых клеток, ASC), что открывает новые возможности в исследованиях и терапии заболеваний8,9.
Как самый большой орган у млекопитающих, печень в основном отвечает за хранение, метаболизм и детоксикацию. Два типа эпителиальных клеток, гепатоциты и холангиоциты, конструируют основную единицу дольки печени. Гепатоциты отвечают за 70-80% функции печени10. Хотя печень обладает замечательной способностью к регенерации, быстрая потеря особенностей гепатоцитов происходит во время традиционного монослойного культивирования путем дисрегулируемой поляризации клеток и дедифференциации, что увеличивает потребность исследователей и клиницистов в построении моделей печени в чашке. Однако до недавнего времени модели расширения ex vivo из первичных гепатоцитов не были хорошо установлены11,12,13,14,15. Органоиды печени могут быть установлены из эмбриональных / индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, превращения фибробластов в гепатоцитоподобные клетки и клеток тканевого происхождения. Развитие органоидов печени стимулирует применение модели in vitro для скрининга лекарств и анализов токсичности печени16,17.
Здесь мы опишем подробный протокол установления органоидов печени из первичных гепатоцитов мышей. Используя этот протокол, мы создали культуральную систему in vitro из органоидов гепатоцитов с двумя перфузиями коллагеназы. Эти органоиды могут быть пройдены для долгосрочного расширения в течение нескольких месяцев. Их физиологическая функция в значительной степени согласуется с гепатоцитами. Кроме того, мы также предоставляем подробное описание того, как выполнять генетические манипуляции, такие как лентивирусная инфекция, трансдукция siRNA и инженерия CRISPR-Cas9 с использованием органоидов. Распространение органоидов гепатоцитов пролило свет на возможность использования органоидов для понимания биологии печени и разработки персонализированных и трансляционных подходов к медицине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на мышах были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Школы фундаментальных медицинских наук в Шаньдунском университете и проводились в соответствии с лицензией в соответствии с руководящими принципами и правилами Министерства внутренних дел (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол в основном используется для культивирования 3D-органоидов из изолированных первичных гепатоцитов.
1. Создание органоидной культуры мышиных гепатоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Внеклеточный матрикс, такой как Matrigel или BME, используется в качестве базовой матрицы для культивирования органоидов. Храните внеклеточный матрикс при -20 °C и предварительно размораживайте его при 4 °C или на льду. Держите внеклеточный матрикс на льду во время экспериментов. Моющая среда - Advanced DMEM / F12, дополненная GlutaMAX, HEPES и пенициллином / стрептомицином. Стандартный инкубатор (37 °C, увлажненная атмосфера, 5% CO2) используется для органоидной культуры.
- Подготовка материалов
- Подготовьте инструменты, необходимые для эксперимента: мышиную подушку, стерильные хирургические инструменты, такие как пинцет, ножницы, трубки и насос со скоростью потока 2-10 мл/мин.
- Подготовьте реагенты, включая буфер перфузии, буфер пищеварения и сделайте их стерильными для выделения гепатоцитов. Добавьте свежую коллагеназу IV типа (0,10 мг/мл) и CaCl2 (0,50 М) и предварительно разогрейте буфер при 37 °C на водяной бане.
- Подготовьте условную среду для производства R-спондина 1 и всех химических веществ и факторов роста в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте частого замораживания и размораживания условной среды и запасов. Приготовьте культуральную среду свежей и используйте ее в течение одного месяца. Это имеет решающее значение для эффективности органообразующего образования.
- Выделение мышиных гепатоцитов путем перфузии и пищеварения печени
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы или самки мышей в возрасте от 12 недель до 6 месяцев использовались для культуры органоидов. Не было обнаружено никаких очевидных различий в эффективности органоидного образования от возраста донорской мыши в этом диапазоне.- Усыплите мышь этически одобренным методом.
- Зафиксируйте мышь на подушке мыши и очистите брюшной мех и кожу 70% спиртом. Обнажите живот и поднимите печень над остальной частью тела. Сделайте разрез средней линии, чтобы обнажить печень.
- Заполните трубку, прикрепленную к насосу, перфузионным буфером. Сделайте разрез воротной вены (около 1/3 диаметра вены) и аккуратно поместите в нее катетер. Поднимите органы пищеварения, чтобы помочь вставить канюлю. Стяжка с хирургической линией является необязательной, чтобы избежать скольжения и разрыва.
- Запустите насос и выполните перфузию со скоростью потока 5-7 мл/мин с перфузионным буфером. Если печень сразу становится бледной, отрежьте нижнюю полую вену, чтобы буфер перфузии протекал через всю печень и вытеснял кровь.
- Когда вытекание станет чистым, удалите канюлю. Это займет около 5-10 минут.
- Замените перфузионный буфер предварительно нагретым буфером пищеварения со скоростью 5 мл/мин. Не останавливайте насос до тех пор, пока печень не станет мягкой и не набухнет. Удалите катетер, когда печень перестанет отекать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно поддерживать правильное время пищеварения, чтобы избежать чрезмерного пищеварения и получить отдельные клетки печени. - Отрежьте печень и поместите ее в пластину толщиной 100 мм, заполненную 15 мл холодной промывочной среды. Отрежьте связки небольшими ножницами. Разорвите печень на куски кончиками пипеток или щипцами.
- Пипетку вверх и вниз осторожно освободить клетки до тех пор, пока буфер не насытится клетками (12-15 раз). Вылейте клеточную суспензию в трубку объемом 50 мл через фильтры 70 мкм.
- Центрифуга в течение 1-3 минут при 50 х г и 4 °C. Декант супернатанта. Необязательно повторно суспендировать клетки промывочной средой или повторно суспендировать клетки с культуральной средой напрямую. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра.
- Различайте живые или мертвые клетки с помощью машины счетчика клеток после окрашивания красителем живых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего очищать гепатоциты с помощью холодных 40% Percoll. После этого шага жизнеспособные гепатоциты будут находиться в нижней части труб.
- Органоидная культура и пассаж
- Удаляют супернатант и повторно суспендируют гепатоциты смесью внеклеточного матрикса и культуральной среды в соотношении 3:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется 10 000-20 000 клеток в смеси 50-60 мкл на скважину для 24-луночной пластины. Важно работать быстро и держать смесь на льду на протяжении всего процесса. При этой концентрации может образоваться 200-500 органоидов. - Добавьте каплю клетки/смеси на пластину с небольшими каплями, чтобы предотвратить соединение капли вместе. Инкубируют пластину в клеточном инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение 5-10 мин, а затем вынимают пластину на 20-25 мин, пока внеклеточный матрикс не станет твердым.
- Добавьте в колодцы питательную среду (500 мкл на скважину для 24-луночной пластины) и верните пластину в инкубатор для органоидной культуры. Меняйте среду каждые 3-4 дня. Наблюдайте за органоидами, пока они не станут достаточно большими, чтобы их можно было пройти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр около 400-500 мкм подходит для прохождения органоидов гепатоцитов. - Выделите органоиды из внеклеточного матрикса с помощью подробно описанного ниже процесса. Держите стеклянную пипетку Пастера в пламени, чтобы сузить ее отверстие (на ~1/2). Механически пипеткой вверх и вниз 5-10 раз, чтобы диссоциировать органоиды на более мелкие органоиды во время пассирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пассажа подготовьте предварительно вымытые наконечники микропипеток и трубки с буфером промывки наконечников, чтобы избежать потери органоидов, прилипших к трубкам или наконечникам.
- Удаляют супернатант и повторно суспендируют гепатоциты смесью внеклеточного матрикса и культуральной среды в соотношении 3:1.
2. Генетические манипуляции с органоидами мышиных гепатоцитов
- Одиночные клетки из органоидов гепатоцитов
- Добавьте 500 мкл раствора для холодной промывки/клеточного восстановительного раствора в каждую лунку. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрушить смесь клеточного / внеклеточного матрикса с помощью микропипетки, а затем перенести органоидную суспензию в 15 мл центрифужной трубки на льду. При желании время от времени поворачивайте трубку вверх и вниз, чтобы тщательно разморозить смесь.
- Центрифугу в течение 5 мин при 500-800 х г и 4 °С и выбросьте супернатант. Добавьте 1 мл раствора трипсина в гранулу и пипетку перемешать. Инкубировать при 37 °C в течение 5-10 мин, а затем остановить пищеварение, добавив 2-кратный объем моющей среды.
- Центрифугу в течение 5 мин при 800 х г и 4 °C и выбросьте супернатант. Повторно суспендируйте гранулу питательной средой и подсчитайте клетки с помощью гемацитометра.
- siRNA или трансфекция плазмиды
ПРИМЕЧАНИЕ: Более мелкие органоиды диаметром менее 50 мкм или одиночные клетки из гепатоцитарных органоидов трансфектируются миРНК с использованием липофектамина или плазмид с использованием трансфекционного реагента в соответствии с инструкциями производителя.- Смешайте siRNA или плазмиды с трансфекционным реагентом. Добавьте одиночные клетки из органоидов и смесь липофектамина-РНК/липо-плазмид (например, RNAiMAX) в 1-2 лунки в 24-луночной пластине и центрифуге в течение 1 ч при 500 х г и 32 °C. После центрифугирования инкубируют пластину в инкубаторе в течение 4-5 ч при 37 °С.
- Соберите клетки и семена во внеклеточный матрикс с питательной средой в концентрации 10 000 клеток на лунку. Измените среду на условие выделения через два дня после трансфекции. Оценить эффективность органообразования через 10 дней.
- Лентивирусная инфекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Малые органоиды диаметром менее 50 мкм или одиночные клетки из органоидов гепатоцитов инфицируются лентивирусом с использованием среды инфекционных реагентов согласно инструкциям производителя.- Смешайте 250 мкл одноклеточной суспензии из органоида и 250 мкл вирусных частиц в пробирке объемом 1,5 мл.
- Намажьте смесь и центрифугу в течение 1 ч при 500 х г и 32 °C. Инкубировать в течение 4-5 ч при 37 °С.
- Соберите клетки и семена во внеклеточный матрикс с культуральной средой. Измените среду на условие выделения через два дня после трансфекции. Оценить эффективность органообразования через 10 дней.
- Генная инженерия от CRISPR/Cas9
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предоставляем видео для этого выступления в дополнительных материалах. Одиночные клетки из органоидов были инфицированы лентивирусом или трансфектированы плазмидами, несущими sgRNA и Cas9.- Переваривать одиночные клетки из культивируемых и проходных гепатоцитарных органоидов по вышеуказанному способу.
- Инфицировать одиночные клетки сгРНК с использованием среды Opti-MEM и реагентов инфекции в соответствии с инструкциями производителя.
- Смешайте 250 мкл одноклеточной суспензии и 250 мкл вирусных частиц вместе в пробирке объемом 1,5 мл.
- Центрифугируют смесь 500 мкл в течение 1 ч при 500 х г и 32 °С, а затем инкубируют в течение 4-5 ч при 37 °С.
- Соберите клеточную суспензию и семена во внеклеточный матрикс. Оценить эффективность органообразования через 10 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Органоиды гепатоцитов из женского Alb-Cre; У мышей Rosa26-GFP (8 недель) наблюдали через пять дней после посева (рисунок 1А). Органоиды размножаются с положительным окрашиванием Ki67 (рисунок 1B). Интерферирующую экспрессию репрезентативных генов в органоидах гепатоцитов либо путем трансфекции siRNA, либо лентивирусной инфекции исследовали с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга. Результаты показаны на рисунках 2A и 2B. На рисунке 2C показаны результаты отбора органоидов печени после 14 дней лечения RSL-3 и экраном геномной библиотеки CRISPR/Cas9. Результаты показывают, что эти органоиды могут быть расширены in vitro и генетически манипулированы.
Рисунок 1: Создание и расширение органоидов мышиных гепатоцитов. (A) Репрезентативное изображение органоидов гепатоцитов из Alb-Cre; Роза26-ГФП. Шкала шкалы составляет 400 мкм. (B) Репрезентативное изображение целой горы органоидов гепатоцитов с антителами b-катенина и Ki67. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Генетические манипуляции с органоидами мышей гепатоцитов. (А) Уровень мРНК Hdac3 и Wee1 относительно GAPDH в органоидах гепатоцитов после трансфектирования siRNA. Полосы ошибок представляют стандартные ошибки (n=3). (B) Западный болтовой анализ органоидов, инфицированных лентивирусом. (C) Репрезентативное изображение органоидов печени после экрана CRISPR-Cas9 в культуральной среде с селекцией RSL-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный материал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность культивировать зрелые гепатоциты в течение длительных периодов времени имеет основополагающее значение для изучения фундаментальной науки о печени, токсикологии лекарств и гепатотропных микробиологических инфекций, таких как малярия и вирусы гепатита. Имея четко определенную нишу, протокол здесь устанавливает систему культивирования гепатоцитов. Этот протокол заставляет зрелые гепатоциты расширяться в 3D-культуре с гетерогенностью, которая повторяет взаимодействие клеток с клетками, большинство функций гепатоцитов и генетические модификации, что позволяет разрабатывать исследования функции генов и новые терапевтические пути к регенеративной терапии.
Высокое качество гепатоцитов очень важно для создания и генетического манипулирования органоидами гепатоцитов. Время переваривания коллагеназой довольно критично. Тем не менее, в методе остаются некоторые ограничения. Во-первых, в исследовании предлагается больше нишевых факторов, чтобы помочь органоидам расширяться дольше. Во-вторых, органоиды не любят быть одиночными клетками последовательно и часто. Органоиды, полученные из гепатоцитов, по-видимому, повторяют регенеративную реакцию взрослой печени после частичной гепатэктомии, но они все еще отличаются от покоящихся зрелых гепатоцитов.
Следует отметить, что использование органоидов гепатоцитов для расширения гепатоцитов открывает новые пути для исследований функции генов печени. Ожидается, что совместное культивирование органоидов с клетками сосудов, иммунными клетками и печеночными вирусами будет способствовать дальнейшему изучению ангиогенеза, микросред и инфекционных заболеваний печени. Стандартная система скрининга с высоким содержанием этих органоидов также рекомендуется для исследования детоксикации ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают никаких конфликтов.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Ханса Клеверса за любезное предоставление клеточных линий для получения рекомбинантного R-спондина1. Эта работа была поддержана грантами Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA0111400), Национального фонда естественных наук Китая (31970779) для H.H. и Группы междисциплинарных и инновационных исследований Фондов для молодежи Шаньдунского университета (2020QNQT003) до H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C.
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
