Ett långsiktigt ex vitro 3D organoid kultursystem inrättades från mus hepatocyter. Dessa organoider kan passeras och genetiskt manipuleras av lentivirus infektion av shRNA/ektopisk konstruktion, siRNA transfection och CRISPR-Cas9 teknik.
Levern är det största organet hos däggdjur. Det spelar en viktig roll i glukoslagring, proteinsekresion, metabolism och avgiftning. Som exekutor för de flesta leverfunktioner har primära hepatocyter begränsad prolifererande kapacitet. Detta kräver upprättandet av ex vivo hepatocytexpansion modeller för leverfysiologisk och patologisk forskning. Här isolerade vi murin hepatocyter genom två steg av kollagenas perfusion och etablerade en 3D organoid kultur som “mini-lever” för att rekapitulera cell-cell interaktioner och fysiska funktioner. Organoiderna består av heterogena cellpopulationer inklusive stamceller och mogna hepatocyter. Vi introducerar processen i detalj för att isolera och odla murin hepatocyter eller fetala hepatocyter för att bilda organoider inom 2-3 veckor och visa hur man passerar dem genom att mekaniskt pipettera upp och ner. Dessutom kommer vi också att introducera hur man smälter organoiderna i enstaka celler för lentivirusinfektion av shRNA / utomkvedskonstruktion, siRNA-transfektion och CRISPR-Cas9-teknik. Organoiderna kan användas för läkemedelsskärmar, sjukdomsmodellering och grundläggande leverforskning genom modellering av leverbiologi och patobiologi.
Organoider är självorganiserade, tredimensionella (3D) in vitro-kluster som inkluderar självförnyande stamceller och differentierade multi-lineageceller1,2. Organoiderna i många organ har etablerats antingen från pluripotenta eller vuxna stamceller av väldefinierade nischfaktorer inklusive tarmen, hjärnan, tjocktarmen, njuren, levern, bukspottkörteln, sköldkörteln, magen, huden och lungan3,4,5,6,7 . Organoiderna rekapitulerar fysiska cellfunktioner genom att efterlikna antingen utveckling (som härrör från embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller, PSC) eller homeostas/regenereringsprogression (härrör från vuxna stamceller, ASCs), vilket öppnar nya vägar inom sjukdomsforskning och terapi8,9.
Som det största organet hos däggdjur är levern främst ansvarig för lagring, metabolism och avgiftning. Två typer av epitelial celltyper, hepatocyter och cholangiocyter, konstruera den grundläggande enheten i en leverlobule. Hepatocyter är ansvariga för 70-80% av leverfunktionen10. Även om levern har anmärkningsvärd regenereringskapacitet, sker snabb förlust av hepatocytfunktioner under traditionell monolayer-odling av dysreglerad cellpolarisering och dedifferentiation, vilket ökar behovet av forskare och kliniker att bygga “gap-överbryggande” levermodeller i en maträtt. Fram till nyligen hade dock ex vivo-expansionsmodellerna från primära hepatocyter inte varit väletablerade11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableras från embryonala/inducerade pluripotenta stamceller, fibroblastkonvertering till hepatocytliknande celler och vävnadsbaserade celler. Utvecklingen av leverorganoider ökar tillämpningen av en in vitro-modell för läkemedelsskärmar och levertoxicitetsanalyser16,17.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att fastställa lever organoider från murine primära hepatocyter. Genom att använda detta protokoll, vi inrätta ett in vitro kultursystem av hepatocyt organoider med två perfusioner av kollagenas. Dessa organoider kan passeras för långsiktig expansion i månader. Deras fysiologiska funktion är mycket förenlig med hepatocyter. Dessutom ger vi också en detaljerad beskrivning av hur man utför genetisk manipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA-transduktion och CRISPR-Cas9-teknik med hjälp av organoider. Förökningen av hepatocytorganoider belyser möjligheten att använda organoider för att förstå leverbiologi och utveckla personliga och translationella medicinska metoder.
Förmågan att odla mogna hepatocyter under långa perioder är grundläggande för att studera lever grundläggande vetenskap, läkemedelstoxikologi och hepatotropa värdmikrobiologi infektioner såsom malaria och hepatitvirus. Med en väldefinierad nisch inrättar protokollet här ett kultursystem för hepatocyter. Detta protokoll driver mogna hepatocyter att expandera i 3D-kulturen med en heterogenitet som rekapitulerar cell-cellinteraktion, de flesta hepatocytfunktion och genetiska modifieringar, vilket möjliggör d…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar professor Hans Clevers för att han vänligen tillhandahåller cellinjerna för att producera rekombinant R-spondin1. Detta arbete stöddes av bidrag från National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) till H.H., och Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) till H.H.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |