زرع الورم لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8+ المتسللة للورم في الفئران
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول زرع الورم لتوصيف الخلايا الليمفاوية المتأصلة في الورم والأطراف المشتقة من الورم في نموذج ورم الفئران. يكشف التتبع المحدد لتدفق الخلايا المناعية المشتقة من المتلقي باستخدام قياس التدفق الخلوي عن ديناميكيات النمط الظاهري والتغيرات الوظيفية لهذه الخلايا أثناء الاستجابات المناعية المضادة للورم.
Abstract
تلعب المناعة بوساطة الخلايا التائية دورا حاسما في الاستجابات المناعية ضد الأورام، حيث تلعب الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTLs) الدور الرائد في القضاء على الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن أصول وتجديد خلايا CD8 + T الخاصة بمستضد الورم داخل البيئة الدقيقة للورم (TME) لا تزال غامضة. يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا الورم الميلانيني B16F10-OVA ، الذي يعبر بثبات عن المستضد الجديد البديل ، ovalbumin (OVA) ، وفئران OT-I المعدلة وراثيا TCR ، حيث يتعرف أكثر من 90٪ من خلايا CD8 + T على وجه التحديد على الببتيد OVA المشتق من OVAOVA 257-264 (SIINFEKL) المرتبط بجزيء مركب التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى H2-K b. تمكن هذه الميزات من دراسة استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات أثناء تكوين الأورام.
من خلال الجمع بين هذا النموذج وجراحة زرع الورم، تم زرع أنسجة الورم من المتبرعين في الفئران المتلقية المتجانسة المتطابقة مع الورم لتتبع تدفق الخلايا المناعية المشتقة من المتلقي بدقة إلى أنسجة المتبرعين المزروعة، مما يسمح بتحليل الاستجابات المناعية ل CD8+ الخاص بالمستضدات المتأصلة في الورم والمستضد المحيطي المنشأ. الخلايا التائية. ووجد أن هناك انتقالا ديناميكيا يحدث بين هاتين المجموعتين. بشكل جماعي ، قدم هذا التصميم التجريبي نهجا آخر للتحقيق بدقة في الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8 + في TME ، مما سيلقي ضوءا جديدا على مناعة الورم.
Introduction
تلعب الاستجابة المناعية بوساطة الخلايا التائية CD8+ دورا محوريا في التحكم في نمو الورم. أثناء تكوين الورم ، يتم تنشيط خلايا CD8 + T الساذجة عند التعرف على المستضدات بطريقة مقيدة من الفئة I من MHC ومن ثم تتمايز إلى خلايا مستجيبة وتتسلل إلى كتلة الورم 1,2. ومع ذلك ، داخل البيئة الدقيقة للورم (TME) ، فإن التعرض للمستضدات لفترة طويلة ، وكذلك العوامل المثبطة للمناعة ، تدفع الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالورم إلى حالة نقص الاستجابة المعروفة باسم “الإرهاق”3. تختلف الخلايا التائية المستنفدة (Tex) عن الخلايا التائية المستجيبة أو الذاكرة المتولدة في العدوى الفيروسية الحادة ، سواء من الناحية النسخية أو اللاجينية. تتميز خلايا تكس هذه بشكل رئيسي بالتعبير المستمر والمرتفع لسلسلة من المستقبلات المثبطة بالإضافة إلى الفقدان الهرمي لوظائف المستجيب. علاوة على ذلك ، فإن ضعف القدرة التكاثرية للخلايا التائية CD8 + المنهكة يؤدي إلى انخفاض أعداد الخلايا التائية الخاصة بالورم ، بحيث لا يمكن للخلايا التائية CD8 + المتبقية داخل TME بالكاد توفير مناعة وقائية كافية ضد تطور الورم3. وبالتالي ، فإن الحفاظ على أو تعزيز خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد داخل الفخذ أمر لا غنى عنه لقمع الورم.
علاوة على ذلك ، يعتقد أن علاج حصار نقاط التفتيش المناعية (ICB) يعيد تنشيط Tex في الأورام عن طريق زيادة تسلل الخلايا التائية وبالتالي ، أعداد الخلايا التائية وتجديد وظائف الخلايا التائية لتعزيز قمع الورم. أدى التطبيق الواسع النطاق لعلاج ICB إلى تغيير مشهد علاج السرطان ، مع وجود مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من استجابات دائمة4،5،6. ومع ذلك ، فإن غالبية المرضى وأنواع السرطان لا يستجيبون أو يستجيبون مؤقتا فقط ل ICB. تم افتراض عدم كفاية تسلل الخلايا التائية في TME لتكون واحدة من الآليات الأساسية التي تمثل مقاومة ICB 7,8.
أظهرت العديد من الدراسات عدم تجانس الخلايا التائية CD8+ المتسللة للورم (TILs) في كل من المرضى ونماذج الفئران9،10،11،12. وقد تم التأكيد على أن مجموعة فرعية من الخلايا التائية CD8 + التي تعبر عن عامل الخلايا التائية -1 (TCF1) في كتلة الورم تظهر خصائص تشبه الخلايا الجذعية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى مزيد من الخلايا التائية المنهكة نهائيا وهي مسؤولة عن انفجار الانتشار بعد علاج ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20 ، 21,22. ومع ذلك ، فقد ثبت أن نسبة صغيرة فقط من الخلايا التائية TCF1 + CD8 + الخاصة بالمستضد موجودة في TME وتولد مجموعة موسعة من النسل المتمايز استجابة ل ICB 23,24,25,26. ما إذا كان الحجم المحدود لهذه المجموعة كافيا لضمان استمرار الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTLs) للسيطرة على تطور الورم لا يزال غير معروف ، وما إذا كان هناك تجديد من الأنسجة الطرفية يتطلب المزيد من التحقيق. علاوة على ذلك ، تشير الأبحاث الحديثة إلى عدم كفاية قدرة التنشيط للخلايا التائية الخاصة بالورم الموجودة مسبقا وظهور أنماط استنساخ جديدة لم تكن موجودة من قبل بعد علاج بروتين موت الخلايا 1 المضاد للبرمجة. وهذا يشير إلى أن استجابة الخلايا التائية لحصار نقاط التفتيش قد تكون بسبب التدفق الجديد لذخيرة متميزة من استنساخ الخلايا التائية27. جنبا إلى جنب مع وجود جزء الخلايا التائية غير التفاعلية للخلايا غير التفاعلية في TME ، دفعت هذه النتائج إلى إنشاء نموذج allograft الورم لدراسة دور الخلايا التائية CD8 + Tالمشتقة من المحيط 11.
حتى الآن ، تم استخدام عدة أنواع من زرع الورم ، وكذلك نقل الخلايا المناعية بالتبني ، على نطاق واسع في مجال علم المناعة للورم28. يمكن وصف TILs ، وخلايا الدم الطرفية أحادية النواة ، والخلايا المناعية التفاعلية للورم التي نشأت من أنسجة أخرى بشكل جيد باستخدام هذه الطرق. ومع ذلك ، عند دراسة التفاعلات بين المناعة المضادة للورم الجهازية والمحلية ، تبدو هذه النماذج غير كافية لفحص التفاعلات بين الخلايا المناعية المشتقة من المحيط و TME. هنا ، تم زرع أنسجة الورم من المتبرعين في الفئران المتلقية المطابقة للورم لتتبع تدفق الخلايا المناعية المشتقة من المتلقي بدقة ومراقبة الخلايا المشتقة من المتبرع في TME بشكل متزامن.
في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج سينجيني للفئران من سرطان الجلد مع خط خلايا الورم الميلانيني B16F10-OVA ، والذي يعبر بثبات عن البويضات المستضدية الجديدة البديلة. الفئران OT-I المعدلة وراثيا TCR ، حيث تتعرف أكثر من 90٪ من خلايا CD8 + T على وجه التحديد على الببتيد OVA المشتق من OVA OVA257-264 (SIINFEKL) المرتبط بجزيء MHC من الفئة I H2-K b ، تمكن من دراسة استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات التي تم تطويرها في نموذج الورم B16F10-OVA. ومن خلال الجمع بين هذا النموذج وزرع الورم، تمت مقارنة الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8+ الخاصة بالمستضدات المتأصلة في الورم والخلايا الطرفية للكشف عن انتقال ديناميكي بين هاتين المجموعتين. بشكل جماعي ، قدم هذا التصميم التجريبي نهجا آخر للتحقيق بدقة في الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8 + في TME ، مما يلقي ضوءا جديدا على ديناميكيات الاستجابات المناعية للخلايا التائية الخاصة بالورم في TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
تلعب المناعة بوساطة الخلايا التائية دورا حاسما في الاستجابات المناعية ضد الأورام ، حيث تلعب CTLs الدور الرائد في القضاء على الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، لم يتم توضيح أصول CTLs الخاصة بمستضدات الورم داخل TME30. قدم استخدام بروتوكول زرع الورم هذا دليلا مهما على أن خلايا CD8 + T الخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من الصندوق الوطني للعلوم الطبيعية للباحثين الشباب المتميزين (رقم 31825011 إلى LY) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31900643 إلى QH ، رقم 31900656 إلى ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
