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Cancer Research

जेब्राफिश में गैर-अल्कोहल फैटी लिवर रोग-संबद्ध हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा की प्रारंभिक प्रगति के दौरान लिवर माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण

Published: April 1, 2021 doi: 10.3791/62457
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Hepatology), Albert Einstein College of Medicine, 3Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Marion Bessin Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine

Summary

यहां, हम प्रस्तुत करते हैं कि यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका परिदृश्य पर कोलेस्ट्रॉल अधिशेष के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक गैर-मादक फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) से जुड़े हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) जेब्राफिश मॉडल कैसे उत्पन्न किया जाए।

Abstract

यकृत कैंसर वर्तमान में दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौतों का तीसरा प्रमुख कारण है, और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) सभी यकृत कैंसर के मामलों का 75-90% है। हेपेटाइटिस बी / सी को रोकने और इलाज के लिए प्रभावी उपचार की शुरूआत के साथ, गैर-मादक फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी), और गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) के रूप में जाना जाने वाला अधिक आक्रामक रूप, आधुनिक समाजों में एचसीसी विकसित करने के लिए नंबर एक जोखिम कारक बन रहे हैं। एचसीसी के विकास पर एनएएसएच की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए हमने एनएएसएच से जुड़े एचसीसी जेब्राफिश को डिजाइन किया है। जेब्राफिश लार्वा की ऑप्टिकल स्पष्टता और आनुवंशिक पथीयता उन्हें गैर-इनवेसिव फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग का उपयोग करके यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका संरचना का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक और शक्तिशाली मॉडल बनाती है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट में कोलेस्ट्रॉल अधिशेष के प्रभाव और रोग के शुरुआती चरणों में प्रतिरक्षा कोशिका संरचना पर इसके प्रभाव की जांच करने के लिए एनएएसएच से जुड़े एचसीसी जेब्राफिश मॉडल का उपयोग कैसे किया जाए। सबसे पहले, हम एचसीसी लार्वा (एस 704टीजी) को खिलाते हैं, जो हेपेटोसाइट-विशिष्ट सक्रिय बीटा-कैटेनिन को व्यक्त करते हैं, एनएएसएच से जुड़े एचसीसी मॉडल को विकसित करने के लिए 8 दिनों के लिए 10% उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के साथ। यहां हम वर्णन करते हैं कि गैर-इनवेसिव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा यकृत में कई शुरुआती घातक विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग कैसे करें, जैसे कि यकृत क्षेत्र, कोशिका और परमाणु आकृति विज्ञान (हेपेटोसाइट्स क्षेत्र, परमाणु क्षेत्र, परमाणु: साइटोप्लाज्मिक अनुपात (एन: सी अनुपात), परमाणु परिपत्रता, माइक्रोन्यूक्लियस / फिर, टैग की गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं (न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं) के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करके हम दिखाते हैं कि एनएएसएच से जुड़े एचसीसी लार्वा में यकृत प्रतिरक्षा कोशिका संरचना का विश्लेषण कैसे किया जाए। वर्णित तकनीक प्रारंभिक हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस चरणों में यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका संरचना का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन उन्हें अन्य यकृत रोग मॉडल में ऐसी विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) सीमित चिकित्सीय विकल्पों के साथ एक आक्रामक कैंसर है। यह पाया गया है कि एचसीसी वाले सभी रोगियों में से 30% से अधिक मोटापे से ग्रस्त हैं और एनएएसएच है, जो एनएएफएलडी 1,2,3,4 का एक आक्रामक रूप है। कैलोरी समृद्ध आहार की खपत फैटी एसिड की उपलब्धता में काफी वृद्धि करती है जो स्थानीय और प्रणालीगत चयापचय बदलाव का कारण बनती है और स्टीटोसिस, हेपेटोसाइट चोट, सूजन और फाइब्रोसिस को ट्रिगर करती है - एनएएसएच की सभी प्रमुख विशेषताएं। एचसीसी में एनएएसएच प्रगति में यकृत में लिपिड का संचय शामिल है, जो सूजन को ट्रिगर करता है और प्रतिरक्षा कोशिका संरचना 5,6,7 को बदल देता है। यह समझना विशेष रुचि और महत्व का है कि यकृत रोग की प्रगति के दौरान यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका परिदृश्य कैसे बदल जाते हैं, और यह कुछ एटियोलॉजिकल कारकों के कारण कैसे बदलता है। यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका परिदृश्य पर कोलेस्ट्रॉल अधिशेष के प्रभाव की बेहतर पहचान करने के लिए, हमने एनएएसएच से जुड़े एचसीसी का एक अनूठा ज़ेब्राफिश मॉडल विकसित किया है। इस मॉडल के उपयोग ने हमें यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और यकृत रोग की प्रगति पर आहार और अतिपोषण के प्रभाव की बेहतर समझ दी है।

स्तनधारी मॉडल, जैसे कि चूहे और मानव ऊतक के नमूने, स्टीटोहेपेटाइटिस और स्टीटोसिस8 के रोगजनन को समझने में आवश्यक हैं। चूहे यकृत रोग और कैंसर के लिए पसंदीदा मॉडल हैं, लेकिन उनमें सेलुलर स्तर पर ऑप्टिकल स्पष्टता की कमी होती है, जबकि मानव ऊतक के नमूनों में अक्सर 3 डी वातावरण की कमी होती है जो पशु मॉडल नकल करने में सक्षम होते हैं। इन बाधाओं ने जेब्राफिश को अनुसंधान समुदाय में एक शक्तिशाली मॉडल बना दिया है। जेब्राफिश में कम से कम 70% जीन संरक्षण के साथ मनुष्यों के लिए उल्लेखनीय समानताएं हैं। वे यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट, यकृत सेलुलर संरचना, कार्य, सिग्नलिंग और चोटोंकी प्रतिक्रिया 9,10 को बनाए रखते हैं। एचसीसी के एक स्थापित ट्रांसजेनिक जेब्राफिश मॉडल के साथ संयोजन में उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार (एचसीडी) का उपयोग करते हुए, हमने एनएएसएच से जुड़े एचसीसी का एक जेब्राफिश मॉडल विकसित किया है।

यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें बताया गया है कि एनएएसएच से जुड़े एचसीसी जेब्राफिश मॉडल कैसे उत्पन्न करें और यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन कैसे करें और विवो में शुरुआती घातक विशेषताओं को कैसे संबोधित करें। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए हेपेटोसाइट झिल्ली और नाभिक के साथ जेब्राफिश ट्रांसजेनिक लाइनों के संयोजन में गैर-इनवेसिव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हम यकृत आकृति विज्ञान (क्षेत्र, मात्रा और सतह क्षेत्र), सेल और परमाणु आकृति विज्ञान (हेपेटोसाइट्स क्षेत्र, परमाणु क्षेत्र, एन: सी अनुपात, परमाणु परिपत्रता, माइक्रोन्यूक्लियस / परमाणु हर्नियेशन स्कोरिंग) और एंजियोजेनेसिस (पोत घनत्व) का विश्लेषण करके प्रारंभिक घातक विशेषताओं को संबोधित कर सकते हैं। प्रतिरक्षा कोशिका माइक्रोएन्वायरमेंट भी हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस 11,12,13,14 पर एक महत्वपूर्ण विशेषता है, इसलिए, हम यह भी दिखाते हैं कि टैग की गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं (न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं) के साथ ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों का उपयोग करके एनएएसएच से जुड़े एचसीसी लार्वा में यकृत प्रतिरक्षा कोशिका संरचना का विश्लेषण कैसे किया जाए। वर्णित तकनीक मॉडल के लिए अद्वितीय हैं और यकृत रोग की प्रगति में यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा कोशिका संरचना का मूल्यांकन करने के लिए बेहद उपयोगी हैं।

Protocol

अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के बाद पशु अध्ययन किए जाते हैं। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर और समाधानों के लिए व्यंजनों के लिए कृपया पूरक तालिका 1 देखें।

1. तीव्र कोलेस्ट्रॉल अधिशेष के लिए 10% कोलेस्ट्रॉल समृद्ध आहार की तैयारी।

  1. गोल्डन पर्ल डाइट के 2 x 4 ग्राम वजन 5-50 एनएम एक्टिव स्फीयर (जीपीएएस) को दो 25 एमएल ग्लास बीकर में - एक सामान्य आहार (एनडी) के लिए और दूसरा 10% उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार (एचसीडी) के लिए।
    नोट: ज़ेबराफिश लार्वा के लिए किसी भी वाणिज्यिक शुष्क खाद्य आहार का उपयोग किया जा सकता है।
  2. 10 एमएल ग्लास बीकर में 0.4 ग्राम कोलेस्ट्रॉल का वजन करें। बीकर को कुछ पन्नी से कवर करें।
  3. 20 ग्राम सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके डायथाइल ईथर के 5 एमएल को मापें। इसके बाद, एनडी बीकर में डायथाइल ईथर जोड़ें और तुरंत इसे स्पैटुला का उपयोग करके सूखे भोजन के साथ मिलाएं।
    सावधानी: डायथाइल ईथर आंख, त्वचा और श्वसन पथ में जलन का कारण बनता है। केवल एक रासायनिक फ्यूम हुड में उपयोग करें।
  4. 20 ग्राम सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके डायथाइल ईथर के 5 एमएल को फिर से मापें और इसे कोलेस्ट्रॉल के साथ 10 एमएल बीकर में जोड़ें, तुरंत सिरिंज के साथ ऊपर और नीचे मिलाएं।
  5. जल्दी से एचसीडी बीकर में कोलेस्ट्रॉल समाधान जोड़ें और तुरंत इसे एक स्पैटुला के साथ मिलाएं जब तक कि समाधान समान न हो जाए।
  6. डायथाइल ईथर को पूरी तरह से वाष्पित करने के लिए 24 घंटे तक हुड में बीकर छोड़ दें। अगले दिन, मूसल और मोर्टार का उपयोग करके जीपीएएस आहार को बारीक कणों में पीस लें।
    नोट: आहार को पीसना एक महत्वपूर्ण कदम है, लार्वा 50 एनएम से बड़े कणों को खाने में सक्षम नहीं होगा।
  7. प्रत्येक आहार को एक छोटे, लेबल वाले प्लास्टिक बैग या 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. कोलेस्ट्रॉल समृद्ध आहार के साथ अल्पकालिक लार्वा खिलाने के साथ एनएएसएच प्रेरण - स्थिर स्थितियां।

  1. दिन -1 पर ट्रांसजेनिक मछली लाइनें स्थापित करें (तालिका 1)। अगली सुबह (दिन 0), मछली पैदा होने के बाद, एक जाल छन्नी में अंडे इकट्ठा करें।
  2. भ्रूण के पानी (ई 3) के साथ एक धोने की बोतल का उपयोग करके, अंडे को अच्छी तरह से कुल्ला करें और अंडे को ई 3 माध्यम के साथ 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
  3. प्रजनन बक्से में जमा होने वाले सभी मलबे की प्लेटों को साफ करें, जिसमें कोई भी मृत या अनिषेचित अंडे शामिल हैं।
    नोट: सूक्ष्मजीवों के अनियंत्रित विकास और लार्वा विकास पर परिणामस्वरूप दोषों से बचने के लिए अंडे को कुल्ला करना और प्लेटों की सफाई महत्वपूर्ण है।
  4. अंडे को 70/80 प्रति 10 सेमी पेट्री व्यंजन (ई 3 के 25 एमएल में) के घनत्व में विभाजित करें। दिन 1 पर, एक ट्रांसइल्युमिनेशन बेस से लैस विच्छेदन दायरे के तहत, मृत भ्रूण या विकास संबंधी दोषों वाले भ्रूण की जांच और सफाई करें।
    नोट: विकास प्रभावों के साथ भ्रूण की पहचान करने और प्लेटों में सूक्ष्मजीवों के विकास की जांच करने के लिए ट्रांसइल्युमिनेशन बेस डार्कफील्ड मोड का उपयोग करें। विभिन्न सुविधाओं में उनके सिस्टम में अलग-अलग सूक्ष्मजीव उपज होती है। नकारात्मक प्रभावों से बचने के लिए यदि आवश्यक हो तो ई 3 माध्यम और / या व्यंजन बदलें।
  5. दिन 5 पर, 15 सेमी पेट्री डिश में सभी व्यंजनों से लार्वा मिलाएं, मेथिलीन ब्लू के बिना ई 3 जोड़ें। इसके बाद, फीडिंग बॉक्स में लार्वा को निम्नानुसार विभाजित करें (तालिका 2)।
    नोट: नियंत्रण स्थितियों में, प्रणालीगत पुरानी सूजन को ट्रिगर किए बिना स्वस्थ लार्वा उत्पन्न करने के लिए, लार्वा को प्रति दिन प्रति लार्वा लगभग 0.1 मिलीग्राम भोजन के साथ खिलाया जाना चाहिए। ध्यान दें कि भोजन की कुल मात्रा (तालिका 2) को प्रति दिन दो फीडिंग में समान रूप से विभाजित किया गया है।
  6. लार्वा को 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें, एक अंधेरे-प्रकाश चक्र (जैसे, 14 घंटे प्रकाश / 10 घंटे अंधेरे चक्र) में, और दिन 5 से दिन 12 तक दिन में दो बार लार्वा खिलाएं।
  7. किसी भी खाद्य मलबे के साथ-साथ 1 एमएल पिपेट टिप से जुड़े वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके माध्यम का 90-95% हिस्सा दैनिक रूप से। लार्वा को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए फीडिंग बॉक्स के एक कोने में मेथिलीन ब्लू के बिना नए ई 3 को सावधानीपूर्वक डालें।
    नोट: सूक्ष्मजीवों के अनियंत्रित विकास से बचने के लिए फीडिंग बॉक्स की दैनिक सफाई महत्वपूर्ण है।

3. फीडिंग बॉक्स से निषेचन के बाद लार्वा के 13 दिनों का संग्रह।

  1. 13 वें दिन, स्थापित प्रयोगात्मक स्थितियों की संख्या के अनुसार संग्रह व्यंजन तैयार करें। एक स्थायी मार्कर पेन के साथ नमूने बदलने से बचने के लिए व्यंजन (ढक्कन और नीचे) के किनारे एक निशान बनाएं, उदाहरण के लिए सामान्य आहार (एनडी) के लिए एक काली पट्टी और एचसीडी के लिए दो काली धारियां।
  2. प्रत्येक डिश के तल को कवर करने के लिए मेथिलीन नीले रंग के बिना पर्याप्त ई 3 डालें। वैक्यूम सिस्टम का सावधानीपूर्वक उपयोग करके फीडिंग बॉक्स से पानी को एस्पिरेट करें, इन सामग्रियों को संग्रह व्यंजनों में स्थानांतरित करने से बचने के लिए नीचे से किसी भी मलबे या मृत लार्वा को एस्पिरेट करने की कोशिश करें।
  3. जब पानी का स्तर कम होने लगे, तो लार्वा को कोनों में से एक पर तैरने के लिए धीरे-धीरे फीडिंग बॉक्स उठाएं, फिर विपरीत दिशा में एस्पिरेट करें।
    नोट: पानी को पीते समय अलग-अलग व्यास की अनुमति देने के लिए, अलग-अलग ऊंचाइयों पर कट युक्तियों के साथ 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। विभिन्न आकारों के बीच वैकल्पिक, एक बड़े व्यास से शुरू करें, और पानी की मात्रा कम होने और लार्वा घनत्व बढ़ने पर एक छोटे में बदलें।
  4. एक बार जब केवल 20-30 एमएल तरल होता है, तो चरण 1 में तैयार किए गए संग्रह पेट्री डिश में सावधानीपूर्वक लार्वा को डिकेंट करें। डिश के ढक्कन पर फीडिंग बॉक्स से लेबल टेप रखें।
  5. सभी फीडिंग बॉक्स के लिए चरण 3.2-3.4 दोहराएं।

4. आहार प्रेरित हेपेटिक स्टीटोसिस के लिए नियंत्रण परख - ऑयल रेड ओ (ओआरओ) धुंधला, इमेजिंग और स्कोरिंग।

  1. ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, 15-20 लार्वा को 2 एमएल गोल तल ट्यूब में स्थानांतरित करें और लगभग 15-30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। ट्यूब से अधिकांश मीडिया को हटा दें।
  2. लार्वा को ठीक करने के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 2 एमएल 4% जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. अगली सुबह, 4% पीएफए समाधान निकालें और लार्वा को 1x PBS के 2 एमएल के साथ तीन बार धोएं।
  4. एक जाल अच्छी तरह से डालने के साथ प्रति स्थिति 12 वेल प्लेट (चित्रा 2 ए) तैयार करें।
  5. ग्लास पिपेट का उपयोग करके, लार्वा को 2 एमएल ट्यूब से कुएं में पहले रखे गए इंसर्ट में स्थानांतरित करें, 1x PBS के 5 एमएल जोड़ें। धुंधला होने के बाद नमूना भंडारण के लिए 2 एमएल ट्यूबों को सहेजें।
    चेतावनी: लार्वा इस स्तर पर बेहद चिपचिपे होते हैं, प्लास्टिक पिपेट का उपयोग न करें।
  6. लार्वा के साथ 60% आइसोप्रोपेनोल घोल के 5 एमएल के साथ दूसरे कुएं में डालें। 30 मिनट कमरे के तापमान (आरटी) के लिए लार्वा को इनक्यूबेट करें।
  7. इस बीच, 60% आइसोप्रोपेनोल समाधान में 0.3% तेल लाल ओ तैयार करें। 0.45 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके 0.3% तेल लाल समाधान को दो बार फ़िल्टर करें।
    नोट: आइसोप्रोपेनॉल में 3 एमएल 0.5% तेल रेड ओ को 2 एमएल आसुत जल के साथ मिलाकर प्रति कुएं 5 एमएल घोल तैयार करें। 60% आइसोप्रोपेनॉल समाधान में 0.3% तेल लाल ओ को ताजा तैयार करने की आवश्यकता है।
  8. इसके बाद, लार्वा के साथ जाल डालने को 60% आइसोप्रोपेनोल घोल में 5 एमएल ताजा बने 0.3% ऑयल रेड ओ के साथ दूसरे कुएं में स्थानांतरित करें। कोमल रॉकिंग के साथ आरटी में 3 घंटे के लिए लार्वा को इनक्यूबेट किया गया।
  9. ओआरओ धुंधला होने के बाद, लार्वा को 60% आइसोप्रोपेनॉल के साथ दूसरे कुएं में स्थानांतरित करके कुल्ला करें। लार्वा को 60% आइसोप्रोपेनोल में दो बार 30 मिनट के लिए धोएं, 60% आइसोप्रोपेनोल के साथ कुओं में क्रमिक रूप से सम्मिलित करके।
  10. लार्वा को 1x PBS-0.1% ट्वीन में 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं, 1x PBS-0.1% ट्वीन के साथ कुओं में क्रमिक रूप से सम्मिलित करके।
  11. लार्वा को 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। पीबीएसटी को हटा दें, 80% ग्लिसरॉल का 1 एमएल जोड़ें, और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  12. बेहतर इमेजिंग के लिए, लार्वा को 1x PBS-0.1% ट्वीन में स्थानांतरित करें और एक विच्छेदन दायरे के तहत दो # 55 बलों का उपयोग करके ऊतकों को सावधानीपूर्वक खींचकर यकृत को विच्छेदित करें।
    नोट: यदि कैस्पर पृष्ठभूमि इमेजिंग का उपयोग करके पूरे लार्वा का उपयोग किया जा सकता है।
  13. ग्लास पिपेट का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक यकृत को 50% ग्लिसरॉल के साथ चीनी मिट्टी के बरतन स्पॉट प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। लार्वा में हेरफेर करने के लिए एक छोटे उपकरण का उपयोग करके लिवर की स्थिति (उदाहरण के लिए, आईलैश टूल- चित्रा 2 बी)। रंगीन कैमरे से लैस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में छवि लिवर।
  14. स्कोर हेपेटिक स्टीटोसिस (कोई ओआरओ धुंधला नहीं = कोई नहीं; हल्का लाल ओआरओ धुंधला = हल्का; लाल-गहरे लाल ओआरओ धुंधला = मध्यम / गंभीर)।

5. जेब्राफिश घाव और फंसाने वाले उपकरण का उपयोग करके गैर-इनवेसिव कॉन्फोकल इमेजिंग फॉर ग्रोथ एंड इमेजिंग (जेडडब्ल्यूईडीजीआई)।

  1. 1x Tricaine-E3 के 15-20 एमएल के साथ 10 सेमी पेट्री डिश तैयार करें, बस नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
    नोट: एक 1x Tricaine-E3 कार्यशील समाधान (0.16 mg/mL) को E3 के 48 mL में 25x Tricaine स्टॉक समाधान (4 mg/mL) के 2 mL को पतला करके प्राप्त किया जा सकता है। ट्राइकेन एकाग्रता 0.16 मिलीग्राम / एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि लार्वा इस विकास चरण में संज्ञाहरण के प्रति बेहद संवेदनशील हैं।
  2. प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ 15-20 लार्वा को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 1x Tricaine-E3 हो और 5 मिनट के लिए लार्वा को एनेस्थेटाइज करें।
  3. मेथिलीन ब्लू प्रति अच्छी तरह से मेथिलीन ब्लू के बिना 2-3 एमएल ई 3 के साथ एक 6 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
  4. एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर, वांछित फ्लोरोसेंट मार्करों (तालिका 1) के लिए एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को स्क्रीन करें। ई 3 में ट्राइकेन की न्यूनतम मात्रा में जांच किए गए लार्वा को स्थानांतरित करें और उन्हें छवि बनाने का समय होने तक 6 वेल प्लेट में ठीक होने दें।
    नोट: डबल, ट्रिपल और चौगुनी ट्रांसजेनिक लार्वा की स्क्रीनिंग में समय लगता है, लार्वा को ई 3 में रखें और ट्राइकेन के अनावश्यक जोखिम को कम करने के लिए अक्सर 6 वेल प्लेट से मीडिया बदलें। इसके अलावा, इस विकास चरण में लार्वा तैरते हैं, इसलिए ऊतक क्षति को प्रेरित किए बिना स्क्रीनिंग के लिए लार्वा को रखने के लिए एक आईलैश टूल का उपयोग करें।
  5. स्क्रीनिंग के बाद, 1x Tricaine-E3 के 25 एमएल के साथ 10 सेमी पेट्री डिश तैयार करें। प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ 15-20 लार्वा को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 1x Tricaine-E3 होता है और 5 मिनट के लिए एनेस्थेटाइज लार्वा होता है।
  6. इस बीच, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत घाव और फंसाने वाले उपकरण (जैसे, जेडडब्ल्यूईडीजीआई) 15,16 के कक्षों में 1x ट्राइकेन-ई 3 जोड़ें। पी 200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कक्षों और निरोधक सुरंग से हवा के बुलबुले हटा दें। कक्षों को भरने के लिए केवल पर्याप्त मात्रा छोड़ते हुए 1x Tricaine-E3 की सभी अधिकता को हटा दें।
  7. जेडडब्ल्यूईडीजीआई के लोडिंग कक्ष में एक एनेस्थेटाइज्ड लार्वा स्थानांतरित करें, और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे एक आईलैश टूल का उपयोग करके इसे रखें। धीरे से, लार्वा के सिर को टैप करें और इसे धक्का दें ताकि पूंछ निरोधक सुरंग में प्रवेश कर जाए। इसके अलावा, माइक्रोपिपेट का उपयोग करके लार्वा को सुरंग में प्रवेश करने में मदद करने के लिए घायल कक्ष से 1x Tricaine-E3 को हटा दें। सुनिश्चित करें कि लार्वा को बाएं लोब की इमेजिंग के लिए उचित रूप से तैनात किया गया है - उलटा माइक्रोस्कोप: बाईं ओर नीचे की ओर; सीधा माइक्रोस्कोप: बाईं ओर ऊपर की ओर।
    नोट: यदि एक zWEDGI उपलब्ध नहीं है, तो मछली को 1x Tricaine-E3 में 1% कम पिघलने बिंदु Agarose में रखा और तैनात किया जा सकता है, हालांकि, Agarose विसर्जन का उपयोग केवल त्वरित इमेजिंग (15 मिनट तक) के लिए किया जा सकता है।
  8. हेपेटोसाइट और परमाणु आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए, 40x वायु उद्देश्य और 2 μm ऑप्टिकल वर्गों के z-स्टैक का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि यकृत। यकृत आकृति विज्ञान, एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती के लिए 20 x वायु उद्देश्य और 5 μm ऑप्टिकल वर्गों के z-स्टैक का उपयोग करके छवि लिवर का उपयोग किया जाता है। बड़े यकृत वाले लार्वा के लिए, 2 x 2 टाइल छवियों को 75 μm के सभी यकृत और आसपास के क्षेत्र की इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए।
  9. इमेजिंग के बाद, निरोधक सुरंग से लार्वा खींचने और मेथिलीन नीले रंग के बिना ई 3 के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए 1x ट्राइकेन-ई 3 के साथ एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।

6. यकृत रूपात्मक विविधताओं का विश्लेषण।

नोट: नीचे सूचीबद्ध चरण यकृत सतह क्षेत्र और मात्रा परिमाणीकरण के लिए किए जाते हैं:

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। निरीक्षण फ़ोल्डर आइकन का चयन करते हुए एरिना में विश्लेषण की जाने वाली छवि फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर जोड़ें। इसके बाद, थंबनेल पर राइट क्लिक करके फ़ाइलों को प्रारूप (.ims) में परिवर्तित करने के लिए मूल Imaris फ़ाइल प्रारूप में परिवर्तित करें का चयन करें।
  2. सबमेनू को पार करने पर, प्रत्येक चैनल के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें। इसके बाद, नीले रंग पर क्लिक करते हुए यकृत से एक सतह बनाएं नई सतह जोड़ें बटन।
  3. इसके बाद, सतह निर्माण पैनल पर सेगमेंट का चयन करें जो मैन्युअल रूप से यकृत की सतह बनाने के लिए रुचि का एक क्षेत्र है।
  4. स्वत: निर्माण | छोड़ें क्लिक करें मैन्युअल रूप से संपादित करें विकल्प. समोच्च का चयन करें और दृश्य पैनल पर "वॉल्यूम" विकल्प का चयन करें।
    नोट: वॉल्यूम व्यू विकल्प को अचयनित करने की आवश्यकता है, अन्यथा विभिन्न जेड-स्टैक में रुचि के क्षेत्र का चयन सक्षम नहीं होगा।
  5. जेड-स्टैक्स के माध्यम से नेविगेट करें और मोड का चयन करके प्रत्येक विमान में रुचि का क्षेत्र खींचें, वह ड्राइंग मोड चुनें जिसे आप पसंद करते हैं। परिवर्तन सूचक को चयन मोड में खींचना शुरू करने के लिए और नेविगेट न करें, अगला ड्रा पर क्लिक करें और आरओआई खींचने के लिए पॉइंटर को लिवर के माध्यम से खींचना शुरू करें।
  6. विभिन्न फोकल विमानों में आरओआई का चयन करने के बाद सभी चयनित आरओआई को विलय करने और यकृत की सतह बनाने के लिए एक सतह बनाएं ।
  7. इसके बाद, नव निर्मित सतह का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स सिग्नल का एक मुखौटा बनाएं। सतह पर क्लिक करें और संपादन टैब (पेंसिल) के तहत मास्क ऑल चुनें। दिखाई देने वाली विंडो में, उस चैनल को चुनें जिसे आप मास्क करना चाहते हैं जिसका उपयोग यकृत की मात्रा और सतह क्षेत्र को मापने के लिए किया जाएगा। फिर, सतह के बाहर वोक्सेल को 0 पर सेट करें और मास्क लगाने से पहले डुप्लिकेट चैनल विकल्प पर टिक करें।
  8. विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण मेनू से यकृत सतह क्षेत्र और यकृत की मात्रा मूल्यों का उपयोग करें।

नोट: यकृत क्षेत्र परिमाणीकरण के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन करें।

  1. Fiji सॉफ्टवेयर खोलें। प्लगइन्स मेनू पर, बायो-फॉर्मेट आयातक के बाद बायो-फॉर्मेट का चयन करें, छवि फ़ाइल खोलने के लिए स्प्लिट चैनल विकल्प पर टिक करें।
  2. छवि मेनू पर, यह जांचने के लिए गुणों का चयन करें कि छवि में सही पिक्सेल आकार और वोक्सेल गहराई है, यदि सही मान नहीं हैं। इसके बाद, छवियों मेनू पर जाएं, ब्राइटनेस और कंट्रास्ट के बाद समायोजित करें पर क्लिक करें, छवि चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें।
  3. इसके बाद, हेपेटोसाइट्स चैनल का उपयोग करके यकृत का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाते हैं। छवियों मेनू पर जाएं, स्टैक्स पर क्लिक करें और उसके बाद जेड प्रोजेक्ट। अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का चयन करें.
  4. फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से लार्वा यकृत के आसपास रुचि (आरओआई) का एक क्षेत्र बनाएं। इसके बाद, विश्लेषण मेनू पर यकृत क्षेत्र प्राप्त करने के लिए माप पर क्लिक करें। परिणामों को आगे के विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें।

7. हेपेटोसाइट और परमाणु रूपात्मक विश्लेषण।

  1. Fiji सॉफ्टवेयर खोलें। प्लगइन्स मेनू पर, छवि फ़ाइल खोलने के लिए स्प्लिट चैनल विकल्प पर बायो-फॉर्मेट आयातक टिक के बाद बायो-फॉर्मेट का चयन करें।
  2. छवि मेनू पर, यह जांचने के लिए गुणों का चयन करें कि छवि में सही पिक्सेल आकार और वोक्सेल गहराई है, यदि सही मान नहीं हैं। इसके बाद, छवियों मेनू पर जाएं, ब्राइटनेस और कंट्रास्ट के बाद समायोजित करें पर क्लिक करें, छवि चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें।
  3. विश्लेषण मेनू में उन सभी मापदंडों पर माप टिक सेट करें जिनका आप विश्लेषण करना चाहते हैं (उदाहरण के लिए, क्षेत्र, परिधि, और आकार वर्णनकर्ता)। हेपेटोसाइट झिल्ली फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें। जेड के माध्यम से नेविगेट करते हुए, एक हेपेटोसाइट के चारों ओर सही आरओआई खींचने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें। इसके बाद, विश्लेषण मेनू पर हेपेटोसाइट्स क्षेत्र की गणना करने के लिए माप पर क्लिक करें।
  4. 15-30 हेपेटोसाइट्स के लिए चरण 7.3 दोहराएं। परिणामों को आगे के विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें।
  5. इसके बाद, न्यूक्लियस फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें। जेड के माध्यम से नेविगेट करते हुए, हेपेटोसाइट नाभिक के चारों ओर सही आरओआई खींचने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें। इसके बाद, विश्लेषण मेनू पर परमाणु क्षेत्र और परिपत्रता की गणना करने के लिए माप पर क्लिक करें।
  6. 15-30 हेपेटोसाइट्स के लिए चरण 7.5 दोहराएं। परिणामों को आगे के विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें, जिसमें परमाणु: साइटोप्लाज्मिक अनुपात का परिमाणीकरण शामिल है।
  7. माइक्रोन्यूक्लियस और हर्नियेशन की उपस्थिति के लिए स्कोर नमूने निम्नानुसार हैं (तालिका 3)।

8. एंजियोजेनेसिस विश्लेषण।

  1. मैन्युअल रूप से इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 6 पर वर्णित यकृत के लिए एक सतह बनाएं। इस सतह को "यकृत सतह" के रूप में नाम दें।
  2. यकृत के अंदर एंडोथेलियल कोशिकाओं के संकेत के लिए एक मुखौटा बनाएं। सतह पर क्लिक करें और संपादन टैब (पेंसिल) के तहत मास्क ऑल चुनें। दिखाई देने वाली खिड़की में, यकृत से पोत संकेतों को अलग करने के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं चैनल का चयन करें। सतह के बाहर वोक्सेल को 0 पर सेट करें और मास्क लगाने से पहले डुप्लिकेट चैनल विकल्प पर टिक करें।
  3. नए एंडोथेलियल कोशिकाओं के नकाबपोश चैनल को लिवर वास्कुलचर के रूप में नाम दें।
  4. पोत की मात्रा और सतह क्षेत्र को मापने के लिए एक दूसरी सतह बनाएं। नीले रंग पर क्लिक करें नई सतह जोड़ें बटन. सतह निर्माण के पहले चरण में सुनिश्चित करें कि सभी विकल्प स्वचालित रूप से एक सतह बनाने के लिए अचयनित हैं।
  5. दूसरे चरण में एक सतह बनाने के लिए लिवर वैस्कुलचर चैनल चुनें। जहाजों से अधिक से अधिक विवरणों का पता लगाने और थ्रेशोल्डिंग विकल्प में पृष्ठभूमि घटाव को सक्षम करने के लिए स्मूथिंग विकल्प का चयन करें।
  6. थ्रेशोल्डिंग को समायोजित करें जो यह सुनिश्चित करता है कि पता लगाई गई सतह यकृत वाहिका संकेत के साथ सह-स्थानीयकरण है। सांख्यिकीय विश्लेषण मेनू से सतह क्षेत्र और आयतन मानों का उपयोग करें। निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके पोत घनत्व सूचकांक की गणना करें:
    वाहिका घनत्व सूचकांक (यकृत2 द्वारा) = (पोत सतह क्षेत्र (μm2)) / (यकृत सतह क्षेत्र (μm2))
    वाहिका घनत्व सूचकांक (यकृत3 द्वारा) = (पोत की मात्रा (3 एम3)) / (यकृत की मात्रा (3 एम3))

9. प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती विश्लेषण।

  1. Fiji सॉफ्टवेयर खोलें। प्लगइन्स मेनू पर, छवि फ़ाइल खोलने के लिए स्प्लिट चैनल विकल्प पर बायो-फॉर्मेट आयातक टिक के बाद बायो-फॉर्मेट का चयन करें।
  2. छवि मेनू पर, यह जांचने के लिए गुणों का चयन करें कि छवि में सही पिक्सेल आकार और वोक्सेल गहराई है, यदि सही मान नहीं हैं। इसके बाद, छवियों के मेनू पर जाएं, चमक और कंट्रास्ट के बाद समायोजित पर क्लिक करें, छवि चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज - एमचेरी या डीटोमाटो; न्यूट्रोफिल - बीएफपी; टी-कोशिकाएं - ईजीएफपी; हेपेटोसाइट्स - ईजीएफपी या एमचेरी)।
  3. इसके बाद, प्रत्येक चैनल के लिए अधिकतम तीव्रता अनुमान बनाएं।
  4. जैसा कि खंड 6 (चरण 6.9-6.12) में वर्णित है, लार्वा यकृत के आसपास एक आरओआई बनाएं और यकृत क्षेत्र को मापें। यकृत क्षेत्र और 75 μm आसपास के क्षेत्र ("भर्ती क्षेत्र") सहित एक दूसरा ROI बनाएं।
  5. इसके बाद, संपादन मेनू पर चयन विकल्प चुनें और उसके बाद प्रबंधक में जोड़ें। एक जन्मजात प्रतिरक्षा सेल चैनल अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का चयन करते हुए, भर्ती क्षेत्र सेट करने के लिए आरओआई प्रबंधक विंडो से यकृत आरओआई पर क्लिक करें।
  6. प्लगइन्स मेनू पर, सेल काउंटर के बाद विश्लेषण विकल्प का चयन करें और भर्ती क्षेत्र के अंदर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गणना करें। एक स्प्रेडशीट पर यकृत क्षेत्र में भर्ती प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रिकॉर्ड संख्या।
  7. प्रति यकृत क्षेत्र में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या को सामान्य करके न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज और टी-सेल घनत्व की गणना करें।

Representative Results

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) ज़ेबराफिश मॉडल में एक अल्पकालिक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार पेश करके, जो बीटा-कैटेनिन (एस 704टीजी) के हेपेटोसाइट विशिष्ट संवैधानिक रूप से सक्रिय रूप को अतिरंजित करता है; टीजी (fabp10a: pt-B-cat, crya: Venus)17, हम NASH-संबद्ध HCC के एक गैर-स्तनधारी कशेरुक मॉडल बनाने में सक्षम हैं। यकृत रोग की प्रगति को हेपेटिक स्टीटोसिस, यकृत आकार, हेपेटोसाइट, परमाणु आकृति विज्ञान, एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ (चित्रा 1) को मापकर जल्दी से निगरानी की जा सकती है।

सामान्य आहार के साथ खिलाए गए एचसीसी लार्वा में हल्के हेपेटिक स्टीटोसिस नहीं दिखाई देते हैं, जिसे ऑयल रेड ओ स्टेनिंग द्वारा मापा जाता है। हालांकि, उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के साथ खिलाए गए एचसीसी लार्वा हेपेटिक स्टीटोसिस में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाते हैं (चित्रा 2)।

यकृत रोग का एक प्रसिद्ध मार्कर हेपेटोमेगाली17 है। यकृत के आकार का मूल्यांकन करने के लिए, एचसीसी लार्वा को ट्रांसजेनिक लाइन के साथ पार किया जा सकता है जो विशेष रूप से हेपेटोसाइट्स पर एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करता है, जैसे कि टीजी (फैबपी 10 ए: एच 2बीएमचेरी)। हेपेटोमेगाली का आकलन करने के लिए, यकृत क्षेत्र (2 डी), यकृत सतह क्षेत्र और यकृत की मात्रा (3 डी) का मूल्यांकन किया जाता है। कोलेस्ट्रॉल अधिशेष के संपर्क में आने के 8 दिनों के बाद, एचसीसी लार्वा में यकृत वृद्धि देखी गई (चित्रा 3)।

गैर-इनवेसिव लाइव इमेजिंग का उपयोग करते हुए, हेपेटोसाइट झिल्ली (जैसे टीजी (फैबपी 10 ए: लाइफ-एक्टिन-ईजीएफपीपी) और हेपेटोसाइट्स नाभिक (जैसे टीजी (फैब 10 ए: एच 2 बी-एमचेरी) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक मछली लाइनों का उपयोग हेपेटोसाइट्स में घातकता से जुड़े सेलुलर और परमाणु आकृति विज्ञान परिवर्तनों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। हेपेटोसाइट क्षेत्र एनएएसएच से जुड़े एचसीसी (चित्रा 4 ए, बी, डी), साथ ही परमाणु क्षेत्र (चित्रा 4 सी, ई) और परमाणु: साइटोप्लाज्मिक अनुपात (चित्रा 4 एफ) में बढ़ गया था। एचसीडी + एचसीसी समूह (चित्रा 4 जी) में परमाणु परिपत्रता में एक महत्वपूर्ण कमी भी देखी गई थी। लिपोटॉक्सिसिटी डीएनए क्षति को ट्रिगर करती है, जो माइक्रोन्यूक्लियस की उपस्थिति में कार्सिनोजेनेसिस की एक विशेषता है। एच 2 बी-एमचेरी मार्कर का उपयोग करके हमने उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार (चित्रा 4 एच) के साथ खिलाए गए एचसीसी लार्वा में माइक्रोन्यूक्लियस की अधिक घटना देखी।

हेपेटिक वास्कुलचर का मूल्यांकन आसानी से ट्रांसजेनिक टैग लाइन का उपयोग करके ज़ेब्राफिश मॉडल में किया जा सकता है, जैसे कि टीजी (केडीआरएल: एमचेरी या टीजी (एफएलआई: ईजीएफपी), जो वास्कुलचर को लेबल करते हैं। एचसीसी + एचसीडी लार्वा (चित्रा 5) में पोत घनत्व की एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई थी।

एनएएसएच से जुड़े एचसीसी में शुरू होने वाली भड़काऊ प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली एक ट्रांसजेनिक मछली लाइन, जैसे कि टीजी (एमएफएपी 4: टीडीटोमाटो-सीएएएक्स; lyz: BFP), को एचसीसी ट्रांसजेनिक लाइन के साथ पार किया गया था। न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज की घुसपैठ एचसीडी के साथ खिलाए गए एचसीसी और एचसीसी दोनों में होती है, जिसका मूल्यांकन यकृत और आसपास के क्षेत्र (आसपास के क्षेत्र में 75 μm तक) की संख्या और घनत्व की मात्रा का परिमाणीकरण करके किया गया था (चित्रा 6ए-एच)। फिर भी, एचसीसी + एचसीडी ने न्यूट्रोफिल संख्या और घनत्व (आंकड़े 6 एफ-एच) में महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित की। निषेचन के 13 दिनों के बाद, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली पहले से ही कार्यात्मक है। टी-कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक मछली लाइन का उपयोग करना, जैसे कि टीजी (एलसीके: ईजीएफपी), और एचसीसी ट्रांसजेनिक लाइन के साथ संयोजन में; हमने यकृत में टी-कोशिकाओं की भर्ती पर कोलेस्ट्रॉल अधिशेष के प्रभाव का मूल्यांकन किया। एचसीडी के साथ खिलाए गए एचसीसी लार्वा में टी-सेल घनत्व और समग्र संख्या में उल्लेखनीय कमी देखी गई (चित्रा 6आई-के)।

ट्रांसजेनिक ज़ेबराफिश लाइनें ZFIN संदर्भ जाँच
कैस्पर रॉयए 9; mitfaw2 हेपेटिक स्टीटोसिस
टीजी (फैबपी 10 ए: पीटी-β-catenin_cryaa: शुक्र / s704Tg / uwm41Tg यकृत आकृति विज्ञान
Tg (fabp10a:pt-β-catenin_cryaa: शुक्र; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP) s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg हेपेटोसाइट्स और परमाणु आकृति विज्ञान
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ crya:Venus; fli:EGFP) s704Tg / y1Tg एंजियोजेनेसिस
टीजी (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: शुक्र;  mfap4: टमाटर-CAAX; lyzC: BFP) s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल भर्ती
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:शुक्र; lck:EGFP) s704Tg / cz1Tg टी-सेल भर्ती

तालिका 1: ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों का उपयोग विभिन्न परखों में किया जाता है।

लार्वा की संख्या फीडिंग बॉक्स का आकार प्रति दिन भोजन की मात्रा (मिलीग्राम) E3 वॉल्यूम (ml)
30-40 छोटे प्रजनन बॉक्स 3-4 200
60-80 छोटे/बड़े प्रजनन बॉक्स 6-8 400
100-150 बड़ा प्रजनन बॉक्स 10-15 500

तालिका 2: फीडिंग बॉक्स की शर्तें सेट करें।

फेनोटाइप स्कोरिंग विधि
कोई नहीं सामान्य नाभिक, कोई माइक्रोन्यूक्लियस या हर्नियेशन नहीं
हलका माइक्रोन्यूक्लियस की कम संख्या (दृश्य के क्षेत्र में 5 से कम) और / या हर्नियेशन
मध्यम / गंभीर मध्यम से उच्च संख्या में माइक्रोन्यूक्लियस (दृश्य के क्षेत्र में 5 से अधिक) और / या हर्नियेशन

तालिका 3: माइक्रोन्यूक्लियस और न्यूक्लियर हर्नियेशन स्कोरिंग।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल आरेख मुख्य प्रयोगात्मक चरणों और विश्लेषण दृष्टिकोण को सारांशित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लिवर स्टीटोसिस के लिए नियंत्रण परख - ओआरओ धुंधला। एचसीसी लार्वा को सामान्य या उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के साथ खिलाया गया था और हेपेटिक स्टीटोसिस का आकलन करने के लिए ऑयल रेड ओ (ओआरओ) धुंधला किया गया था। (ए) जाल वेल इंसर्ट का उपयोग करके अनुक्रमिक ओआरओ धुंधला करने के लिए 12 वेल प्लेट का आरेख। (बी) लार्वा में हेरफेर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आईलैश उपकरण की छवि। (सी) तेल लाल से सना यकृत की प्रतिनिधि छवियां; एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा। (डी) ची-स्क्वायर ग्राफ यकृत स्टीटोसिस के विभिन्न स्कोरिंग के साथ लार्वा के प्रतिशत को दर्शाता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: यकृत के आकार से प्रतिनिधि छवियां। ट्रांसजेनिक एचसीसी लार्वा को यकृत मार्कर (टीजी (फैबपी 10 ए: एच 2 बी-एमचेरी)) को व्यक्त करते हुए एक जेडडब्ल्यूईडीजीआई का उपयोग करके एक उल्टे स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लाइव और गैर-आक्रामक रूप से चित्रित किया गया था। (ए) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत के प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण। (बी-डी) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत क्षेत्र (बी) यकृत सतह क्षेत्र (सी) और यकृत की मात्रा (डी) सहित यकृत रूपात्मक परिवर्तन दिखाने वाला ग्राफ। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हेपेटोसाइट्स और नाभिक आकृति विज्ञान से प्रतिनिधि छवियां। हेपेटोसाइट झिल्ली (टीजी (फैबपी 10 ए: लाइफ-एक्टिन-ईजीएफपी) और हेपेटोसाइट्स नाभिक (टीजी (फैबपी 10 ए: एच 2 बी-एमचेरी) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक एचसीसी लाइनों को चित्रित किया गया था। (ए-सी) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा के एफ-एक्टिन और हेपेटोसाइट नाभिक के प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण। खुले तीर के निशान बढ़े हुए नाभिक दिखाते हैं; सफेद तीर के निशान परिवर्तित आकार के साथ नाभिक दिखाते हैं; और लाल तीर माइक्रोन्यूक्लियस और परमाणु हर्नियेशन दिखाते हैं। (डी-जी) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी 13 दिन पुराने लार्वा में सेल और परमाणु मापदंडों के औसत को दिखाने वाले ग्राफ। (डी) हेपेटोसाइट्स क्षेत्र। (ङ) परमाणु क्षेत्र। (च) परमाणु: साइटोप्लाज्म अनुपात। (छ) परमाणु परिपत्रता। प्रत्येक बिंदु प्रति लार्वा औसत का प्रतिनिधित्व करता है। डॉट प्लॉट्स औसत ±एसईएम (एच) ची-स्क्वायर ग्राफ दिखाते हैं जो माइक्रोन्यूक्लियस और न्यूक्लियर हर्नियेशन के विभिन्न स्कोरिंग के साथ लार्वा का प्रतिशत दिखाते हैं। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: यकृत वाहिका से प्रतिनिधि छवियां। हेपेटोसाइट नाभिक (टीजी (फैब 10 ए: एच 2 बी-एमचेरी) और एंडोथेलियल कोशिकाओं (टीजी) एफएलआई: ईजीएफपी) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक एचसीसी लाइनें। (ए) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत वाहिका के प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण। (बी-सी) एचसीसी और एचसीसी + एचएफसीडी लार्वा में यकृत सतह क्षेत्र (बी) मात्रा (सी) द्वारा पोत घनत्व सूचकांक दिखाने वाला ग्राफ। डॉट प्लॉट ्स का मतलब दिखाता है ±SEM. स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: यकृत प्रतिरक्षा कोशिका परिदृश्य से प्रतिनिधि छवियां। ट्रांसजेनिक एचसीसी लाइन मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल (टीजी (एमएफएपी 4: टीडीटोमाटो-सीएएएक्स; लाइज़: बीएफपी) या टी-कोशिकाओं (टीजी (एलसीके-ईजीएफपी) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करती है। (ए, सी, एफ) 13 दिन पुराने एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत क्षेत्र में यकृत और ल्यूकोसाइट भर्ती के प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण। (बी) चित्रित यकृत क्षेत्र का आरेख। (डी-ई) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत क्षेत्र में मैक्रोफेज घनत्व (डी) और संख्या (ई) दिखाने वाला ग्राफ। (G-H) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत क्षेत्र में न्यूट्रोफिल घनत्व (जी) और संख्या (एच) दिखाने वाला ग्राफ। (छ) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत क्षेत्र में टी सेल भर्ती के प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण। (एच-आई) एचसीसी और एचसीसी + एचसीडी लार्वा में यकृत क्षेत्र में टी सेल घनत्व (एच) और संख्या (आई) दिखाने वाला ग्राफ। डॉट प्लॉट ्स का मतलब दिखाता है ±SEM. स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: बफर और समाधान की तालिका कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एचसीसी की बढ़ती घटनाओं के साथ, विशेष रूप से एनएएसएच प्रेरित एचसीसी, एनएएसएच से जुड़े एचसीसी में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए अधिक कुशल मॉडल होना बहुत महत्वपूर्ण है। यकृत रोग की प्रगति और हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस को बेहतर ढंग से समझने के लिए यकृत में सेल-सेल इंटरैक्शन का डीकन्वोल्यूशन महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण विवो और गैर-आक्रामक रूप से यकृत रोग की प्रगति का विश्लेषण करने का एक अनूठा तरीका प्रदान करता है।

एनएएसएच से जुड़े एचसीसी मॉडल की स्थापना की सफलता के लिए आहार की तैयारी महत्वपूर्ण है। ज़ेबराफ़िश के लिए आहार तैयार करते समय, हानिकारक प्रभावों से बचने के लिए डायथाइल ईथर को फ्यूम हुड के अंदर पूरी तरह से वाष्पित करना महत्वपूर्ण है। लार्वा के साथ इन आहारों का उपयोग करने के लिए (निषेचन के 5-12 दिन बाद), लार्वा द्वारा भोजन के सेवन को सुनिश्चित करने के लिए आहार को महीन कणों में पीसना बेहद महत्वपूर्ण है। लार्वा में भोजन के सेवन का मूल्यांकन करने के लिए फ्लोरोसेंटली टैग किए गए फैटी एसिड एनालॉग का उपयोग किया जा सकता है।

लार्वा को प्रजनन बक्से में रखने और भोजन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न प्लेटों से लार्वा को मिलाकर प्रयोगात्मक नमूनाकरण समान हो। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि दिन 0 से शुरू होने वाले विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट, प्रत्येक प्लेट में प्रचारित होते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं।

एक और महत्वपूर्ण कदम लार्वा की गिनती करना है, यह जानने के लिए कि प्रत्येक फीडिंग बॉक्स के लिए कितने भोजन की आवश्यकता है। यदि प्रत्येक बॉक्स में मौजूद लार्वा की संख्या के लिए भोजन की मात्रा पर्याप्त नहीं है, तो दो परिदृश्यों में से एक होगा: 1) लार्वा को कम खिलाया जाएगा; 2) लार्वा को ओवरफेड किया जाएगा। गलत भोजन से कुपोषण या अतिपोषण से जुड़ी अस्वास्थ्यकर स्थितियां होंगी, जैसे कि सूजन, जो यकृत माइक्रोएन्वायरमेंट को काफी प्रभावित करेगी। यदि गलत भोजन होता है, तो लार्वा गति के मुद्दों को दिखाएगा। इस विकास चरण में, लार्वा को गहन रूप से तैरना चाहिए, इसलिए यदि गति के मुद्दों पर ध्यान दिया जाता है तो लार्वा को अस्वास्थ्यकर परिस्थितियों (कुपोषण या ओवरफीडिंग के कारण कोलेस्ट्रॉल की विषाक्त खुराक के संपर्क में) के तहत उठाया गया था। इस कारण से, सामान्य और कोलेस्ट्रॉल समृद्ध दोनों आहारों के लिए भोजन प्रक्रियाओं को कसकर नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है। हेपेटोमेगाली (यकृत का आकार) और ऊतक और अंगों, विशेष रूप से यकृत और आंत (न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज की बढ़ती घुसपैठ) की उपस्थिति सहित लार्वा के भोजन और स्वास्थ्य की सटीकता को जल्दी से संबोधित करने के लिए कुछ परख किए जा सकते हैं।

ई 3 के 95% की दैनिक सफाई और प्रतिस्थापन फीडिंग बॉक्स में सूक्ष्मजीवों के विकास को कम करने और लार्वा स्वास्थ्य और अस्तित्व में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, लार्वा को स्टैंड-अलोन रैक सिस्टम में रखा जा सकता है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, 3-लीटर टैंक में 60-80 लार्वा रखें। प्रवाह को तेजी से टपकने वाले मोड में समायोजित करके और लार्वा को दिन में दो बार 3-4 मिलीग्राम (एएम और पीएम) खिलाकर न्यूनतम स्तर पर पानी के प्रवाह को बनाए रखें। प्रत्येक टैंक में सही प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से पानी के प्रवाह की जांच की जानी चाहिए। हमारी प्रयोगशाला में, यह विधि हमें 10% एचसीडी के अल्पकालिक भोजन के साथ 95-100% जीवित रहती है। इसके अलावा, इस विधि ने वर्णित स्थिर आहार प्रोटोकॉल में आवश्यक दैनिक सफाई और पानी के आदान-प्रदान में निहित कार्यभार को बहुत कम कर दिया।

जबकि हमने अल्पकालिक जोखिम में एनएएसएच को प्रेरित करने के लिए 10% कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध आहार का उपयोग किया (स्टीटोहेपेटाइटिस को प्रेरित करने के लिए 5 दिन पर्याप्त हैं), आहार परिवर्तन किया जा सकता है और फ्रुक्टोज 18, फैटी एसिड (जैसे पाल्मिटिक एसिड) 19, या फीडिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है जिसे 4% कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध आहार20 का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है। वर्तमान में, एचसीसी के लिए कुछ सफल चिकित्सीय लक्ष्य हैं और एनएएसएच के लिए कोई नहीं है। ज़ेब्राफिश मॉडल का उपयोग हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस पर हमारे ज्ञान का विस्तार करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, लेकिन बड़े थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग करने के लिए एक अद्वितीय कशेरुक प्रणाली भी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकें यकृत रोग और हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस के लिए भविष्य के निष्कर्षों और चिकित्सीय लक्ष्यों की सुविधा प्रदान करेंगी।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन ज़ेबराफिश कोर फैसिलिटी तकनीशियन क्लिंटन डेपाओलो और स्पार्टक कलिनिन को हमारी ज़ेब्राफ़िश लाइनों की सहायता और रखरखाव के लिए स्वीकार करना चाहते हैं। एफजेएमएन कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट और फाइब्रोलैमेलर कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholesterol Sigma C8667-25G Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm Fisher 07-200-223
Corning Netwells inserts Fisher 07-200-212
Diethyl ether Fisher 60-046-380 Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar Fisher NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in Fisher 22-183624
4% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres Brine Shrimp Direct - Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets Fisher 22-170-404
Isopropanol Fisher BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack Crystalgen 221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM Fisher 08-747D
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol Sigma O1391-500ML
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Vactrap VWR 76207-630 Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope Leica M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope Nikon Nikon CSU-W1
Stereomicroscope Leica S9i with transilluminated base
Software
Fiji Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6 Bitplane; Oxford Instruments.

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 170
जेब्राफिश में गैर-अल्कोहल फैटी लिवर रोग-संबद्ध हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा की प्रारंभिक प्रगति के दौरान लिवर माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण
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Michael, C., Martínez-Navarro, F. J., de Oliveira, S. Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62457, doi:10.3791/62457 (2021).

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