Summary
Парадигма хронического психосоциального стресса (CGS) использует клинически значимые стрессоры во время беременности у мышей для моделирования психических расстройств матерей и младенцев. Здесь мы предоставляем пошаговую процедуру применения парадигмы CGS и последующих оценок для проверки этой модели.
Abstract
Периродовой период считается чувствительным периодом, когда неблагоприятное материнское воздействие может привести к долгосрочным негативным последствиям как для матери, так и для потомства, включая развитие нервно-психических расстройств. Факторы риска, связанные с возникновением аффективной дисрегуляции в диаде матери и ребенка, были широко изучены. Воздействие психосоциального стресса во время беременности неизменно становится одним из самых сильных предикторов. Для изучения этой связи было создано несколько моделей грызунов; однако эти модели основаны на использовании физических стрессоров или ограниченного числа психосоциальных стрессоров, представленных в повторяющейся форме, которые не точно отражают тип, интенсивность и частоту стрессоров, испытываемых женщинами. Чтобы преодолеть эти ограничения, была создана парадигма хронического психосоциального стресса (CGS), которая использует различные психосоциальные оскорбления различной интенсивности, представленные непредсказуемым образом. Рукопись описывает эту новую парадигму CGS, где беременные самки мышей с гестационного дня с 6,5 до 17,5 подвергаются воздействию различных стрессоров в течение дня и ночи. Дневные стрессоры, два в день разделенные 2-х ч перерывом, варьируются от воздействия посторонних предметов или запаха хищника до частых изменений в подстилке, удаления подстилки и наклона клетки. Ночные стрессоры включают непрерывное воздействие света, смену товарищей по клетке или смачивание постельного белья. Ранее мы показали, что воздействие CGS приводит к развитию материнских нейроэндокринных и поведенческих аномалий, включая повышенную реактивность на стресс, появление фрагментированных моделей ухода за матерью, ангедонию и тревожное поведение, основные особенности женщин, страдающих перинатальным настроением и тревожными расстройствами. Таким образом, эта модель CGS становится уникальным инструментом, который может быть использован для выяснения молекулярных дефектов, лежащих в основе материнской аффективной дисрегуляции, а также трансс плацентарных механизмов, которые влияют на нервное развитие плода и приводят к негативным долгосрочным поведенческим последствиям у потомства.
Introduction
Механизмы, лежащие в основе повышенной восприимчивости к нервно-психическим расстройствам у матерей и младенцев после неблагоприятного воздействия на матерей в периродовом периоде, остаются в значительной степени неизвестными. Существенные физиологические изменения матери происходят во время беременности и перехода к послеродовому периоду, включая несколько нейроэндокринных адаптаций, которые, как предполагается, имеют решающее значение не только для здорового развития потомства, но и для сохранения психического здоровья матери1,2. На уровне материнской гипоталамической оси надпочечников гипофиза (HPA) наблюдаются адаптации как циркадных, так и стресс-индуцированных уровней высвобождения глюкокортикоидов, включая более уплощенный ритм активности суточной оси HPA и ослабленную реакцию оси HPA на острые стрессоры3,4,5. Учитывая, что повышенная активность оси HPA сообщается у подгруппы женщин с послеродовой аффективной дисрегуляцией, включая повышенные уровни циркулирующих глюкокортикоидов и ингибированную отрицательную обратную связь6,7,8,воздействие стрессоров, которые приводят к повышенной реактивности послеродового стресса и предотвращают адаптацию оси HPA матери, как полагают, повышают восприимчивость к нервно-психическим расстройствам.
Чтобы прояснить влияние стресса на аффективную дисрегуляцию у матерей и младенцев, было создано несколько моделей стресса грызунов в перинатальный период. Большинство из этих моделей характеризуются применением физических стрессоров, которые приводят к гомеостатическим проблемам и изменениям физиологического статуса плотины9,таким как хронический стресссдерживания 10 и стресс плавания во время беременности11или послеродовой шок12. Хотя былопоказано,что эти парадигмы приводят к появлению послеродового депрессивного поведения и изменений в материнской помощи10,11,12,они были ограничены их неспособностью точно уловить психосоциальную природу стрессоров, обычно испытываемых человеческими матерями. Это становится особенно важным при попытке выявить нейроэндокринные последствия хронического стресса в перипартаумном периоде, учитывая, что обработка различных типов стрессоров, как полагают, опосредована различными нейронными сетями, оркеструющими активацию оси HPA9.
Чтобы преодолеть это ограничение, несколько групп разработали парадигмы стресса, использующие психосоциальные оскорбления или комбинацию физических и психосоциальных стрессоров. Модель материнского разделения, где плотины отделяются от ее детенышей в течение нескольких часов в день в течение послеродового периода13,14,и модель хронического социального стресса, где плотины подвергаются воздействию мужского незваного гостя в присутствии своих пометов15,16,смогли воспроизвести появление аномалий в материнской заботе и депрессивно-подобных фенотипов, связанных с парадигмами физического стресса. Парадигма хронического ультрамилодного стресса, когда беременные самки мышей подвергаются различным психосоциальным оскорблениям, включая наклон клетки и ночное освещение, а также существенным физиологическим оскорблениям, таким как стресс сдерживания и ограничение пищи, также показала, что воздействие смешанных стрессоров приводит к аномалиям в поведении матери, включая нарушения материнской агрессии. а также дисрегуляция в циркадной активности оси HPA17,18. В соответствии с этими результатами, модель переменного сдерживающего стресса и переполненности во время беременности приводит к повышению уровня циркадного кортикостерона у матерей в послеродовом периоде, а также к изменениям в уходе за матерью, хотя никаких различий в повторной активности оси HPA после послеродового воздействия новых острых инсультов1не наблюдается.
Расширение этой работы, создание парадигмы гестационного стресса, которая использует множественные психосоциальные оскорбления, представленные непредсказуемым образом, и сводит к минимуму использование физиологических стрессоров. Исследования ранее показали, что эта парадигма хронического психосоциального стресса (CGS) приводит к развитию дисфункции оси HPA у матери, включая повышенную реактивность к стрессу в раннем послеродовомпериоде 19. Эти изменения связаны с аномалиями в материнском поведении, включая изменения в качестве материнской помощи, получаемой детенышами, и появление ангедонического и тревожного поведения19,особенности, согласующееся с перинатальным настроением и тревожными расстройствами20,21. Кроме того, увеличение веса потомства уменьшается в течение постнатального периода после внутриутробного воздействия CGS19,что говорит о том, что CGS может иметь устойчивые негативные программные эффекты в будущих поколениях.
Целью разработки парадигмы CGS было использование клинически значимых стрессоров, которые точно отражают тип, интенсивность и частоту оскорблений, часто связанных с нейроэндокринной дисрегуляцией и развитием перинатальных расстройств настроения и тревоги. Здесь исследование предоставляет подробный протокол о том, как подвергнуть беременных самок мышей CGS, а также последующие оценки, которые могут быть использованы для проверки достоверности модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Детском медицинском центре Цинциннати и соответствовали руководящим принципам Национального института здравоохранения. Ad libitum доступ к стандартному чау-чау и воде для грызунов был предоставлен в любое время мышам, в том числе во время парадигмы CGS. Мышей размещали по циклу 14 ч/10 ч светло-темного (свет в 06:00 ч), если не указано иное (т.е. воздействие света ночью).
1. Подготовка к временным вязкам
- По крайней мере, за 2 недели до установки временных спариваний разместяйте взрослых самок мышей вместе в стандартной клетке для мышей (18,4 см х 29,2 см х 12,7 см), по четыре мыши на клетку. Пометьте каждую самку мыши определенным идентификационным номером с помощью ушной бирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовались самки мышей C57BL6 без предшествующих беременностей и в возрасте от 3 до 6 месяцев. - По крайней мере, за 1 неделю до установки временных спариваний, индивидуально размещайте взрослых самцов мышей, которые будут использоваться для спаривания.
2. Настройка временных вязок
- Настройте время спаривания в 18:00 ч. Возьмите двух самок мышей и поместите их в клетку, в которой содержится индивидуально размещенный самец мыши. Отделите синхронные спаривания на следующее утро до 08:00 ч.
3. Проверка копуляторной пробки, обозначенной как гестационный день 0,5 (G0.5)
- Сразу после разделения временных спариваний проверьте наличие копуляторной пробки у самок мышей. Наличие копуляторной пробки отметит G0.5. Позвольте мыши удерживать проволочную сетку внутри клетки и осторожно поднять ее за хвост, чтобы визуализировать влагалищное отверстие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие копуляторной пробки указывает на сексуальную активность, но не гарантирует беременность. При попытке рассчитать необходимое количество экспериментальных мышей ожидайте, что 50% мышей будут подключены от временных спариваний и беременности, чтобы частота пробки 60%-70%. - Используйте простой визуальный осмотр, чтобы выявить наличие копуляторной пробки (непрозрачная беловатая затвердевших массы внутри или слегка выступающая из влагалищного отверстия). Если копуляторную пробку нелегко определить простым визуальным осмотром, аккуратно вставьте тупой концевой зонд во влагалищное отверстие. Определите пробки, расположенные дальше во влагалище, по сопротивлению введения зонда.
- Разделите самок мышей с помощью копуляторных пробок и разместите группу в стандартных клетках для мышей, от 3 до 4 мышей на клетку.
4. Подготовка к парадигме CGS
- Случайным образом распределите клетки, в которые вмещают самок мышей с копуляторными пробками, в две группы на G5.5: контрольную и группу CGS. Попытайтесь рандомизировать клетки, чтобы иметь примерно равное количество мышей в группе. Переведите мышей в чистые стандартные клетки для мышей и нанесите на этикетку знак «не беспокоить». Обозначьте эти клетки как «домашние клетки» для мышей, чтобы поместить их в конце каждого стрессора.
- Обозначьте отдельную комнату в мышином средстве для выполнения парадигмы CGS. Разработать 11-дневный режим стрессоров, который работает от G6.5 до G17.5, чтобы использовать каждый из 7-дневных стрессоров [воздействие посторонних предметов (шарики или лего), воздействие запаха хищника (грязная крысиная подстилка), наклон клетки на 30 °, частая смена постельного белья, удаление постельного белья, движение на шейкере] два раза в день и использовать каждый из 3 ночных стрессоров (включенный ночной свет, смена партнера клетки, воздействие мокрого постельного белья) ночью случайным образом. Для возможного примера расписания и схемы экспериментов, описанных ниже, см. Рисунок 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый день стрессор должен попадать в световой цикл мышей (свет на 06:00 ч-20:00 ч), и длиться 2 ч, с перерывом между стрессорами не менее 2 ч. Каждый ночной стрессор должен быть установлен в начале темного цикла (свет выключен 20:00 ч) и отделен в начале светового цикла (огни на 06:00 ч).
5. Выполнение парадигмы CGS
- Установите специальные стрессоры на стандартной статической клетке с фильтрованным верхом и бутылкой для воды в комнате, предназначенной для парадигмы CGS. Подготовьте количество статических клеток, необходимых для эксперимента, в зависимости от количества клеток для мышей, назначенных для прохождения CGS во время рандомизации. Перед началом каждого стрессора перенесите клетки мышей группы CGS из жилой комнаты в комнату CGS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните обработку/перенос мышей из домашней клетки в экспериментальную клетку и обратно в ламинарные вытяжки. - Применяйте следующие стрессоры в соответствии с заранее разработанным режимом (см. шаг 4.2).
- Воздействие посторонних предметов (шариков или лего): Поместите шесть шариков (14 мм в диаметре) или шесть лего (разных форм, не более 4 см в высоту), случайным образом распределенных в чистую статическую клетку с подстилкой мыши, не включая мышиные гнезда. Поместите мышей вместе с их домашними собратьями в клетку со статичными предметами на 2 ч. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите посторонние предметы после использования. - Воздействие запаха хищника (грязная крысиная подстилка): Поместите 1 см в глубину свежей грязной крысиной подстилки от самок крыс в чистую статическую клетку без мышиной подстилки, без включения мышиных гнезд. Поместите мышей вместе с их домашними коллегами в клетку в статическую клетку с грязной крысиной подстилкой на 2 ч. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Наклон клетки на 30 °: Поместите мышей с их домашними аналогами в клетку в чистую статическую клетку с подстилкой для мыши, не включая мышиных гнезд. Наклоняем клетку под 30° к стенке в течение 2 ч. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Частая смена подстилки: Поместите мышей с их домашними собратьями в клетку в чистую статическую клетку с подстилкой для мышей, не включая мышиных гнезд. Заменяйте подстилку мыши чистым мышиным постельным бельем каждые 10 мин в течение 2 ч. Во время изменений подстилки мышей осторожно поместите мышей в другую чистую клетку, чтобы избежать прямого контакта с мышами. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Удаление подстилки: Поместите мышей вместе с их домашними собратьями в клетку в пустую чистую статическую клетку (без подстилки для мышей или птят) на 2 ч. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Движение на шейкере: Поместите мышей с их домашними собратьями в клетку в чистую статическую клетку с подстилкой для мышей, не включая мышиных гнезд. Поместите статическую клетку на обратный лабораторный шейкер, рассчитанный на 140 ударов в минуту в течение 2 ч. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Ночное воздействие света: Поместите мышей с их домашними коллегами в клетку в чистую статическую клетку с подстилкой для мышей, не включая мышиных гнезд. Держите свет включенным на ночь (20:00 ч-06:00 ч), чтобы помешать темному циклу. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Изменение партнера клетки: Переведите мышь в чистую статическую клетку с подстилкой для мыши, в которой размещается другая группа из двух самок мышей (неповрежденные самки, не принадлежащие к лечению или контрольной группе). Держите мышь в статической клетке с незнакомыми товарищами по клетке на ночь. Верните мышь в ее домашнюю клетку с ее конкретными аналогами домашней клетки по завершении стрессора.
- Воздействие влажной подстилки: Наполните статическую клетку мышиной подстилкой чистой водой, выдерживают при 24 °C до тех пор, пока подстилка не насытится водой. Поместите мышей вместе с их домашними коллегами в клетку в статическую клетку с мокрым постельным бельем на ночь. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Воздействие посторонних предметов (шариков или лего): Поместите шесть шариков (14 мм в диаметре) или шесть лего (разных форм, не более 4 см в высоту), случайным образом распределенных в чистую статическую клетку с подстилкой мыши, не включая мышиные гнезда. Поместите мышей вместе с их домашними собратьями в клетку со статичными предметами на 2 ч. Верните мышей в их домашнюю клетку с теми же аналогами при заключении стрессора.
- Во время парадигмы CGS держите контрольных мышей нетронутыми в их домашних клетках внутри жилой комнаты.
- Замените использованные домашние клетки новыми домашними клетками на G10.5. На G17.5, по завершении ночного стрессора, все экспериментальные мыши должны были подготовиться к разустройству и последующим функциональным оценкам.
6. Мониторинг экспериментальных мышей в парадигме CGS
- Контролируйте мышей каждые 1 ч во время применения стрессора, за исключением ночных стрессоров.
- Исключите из эксперимента мышей, демонстрирующих признаки дистресса, включая раны, летаргию или любую физическую аномалию. При необходимости свяжитесь с ветеринарным персоналом.
7. Измерение процентного прироста массы тела во время беременности у экспериментальных мышей (необязательно)
- На G6.5 взвесьте мышей индивидуально перед воздействием стрессоров. На G17.5, в конце ночного стрессора, взвешивайте мышей индивидуально. Взвешивайте контрольных мышей в эквивалентных точках гестационного времени.
- Измерьте процент прироста массы тела во время беременности, установив вес первого дня парадигмы CGS (G6.5) как 100%.
8. Измерение послеродового относительного веса надпочечников у экспериментальных мышей (необязательно)
- На послеродовой день 2 (PP2) взвесьте контрольные и CGS плотины по отдельности. Усыплите плотины путем вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки в вытяжном капюшоне.
- Поместите мышей на рассеченную пластину, стерилизуйте брюшную область 70% этанолом и откройте брюшную полость ножницами, чтобы сделать вертикальный разрез. Выделяют надпочечники, расположенные рядом с передним полюсом почек, щипцами, двусторонне. Тщательно рассекте жировую ткань, окружающую надпочечники, под рассекающим микроскопом.
- Взвешивают двусторонние надпочечники индивидуально. Рассчитать относительную массу надпочечников в миллиграммах на грамм (общая масса правого и левого надпочечников/массы тела).
9. Измерение активности оси послеродовой гипоталамического гипофиза надпочечников (HPA) у экспериментальных мышей (необязательно)
- При подготовке к измерениям оси HPA усыпьте пометы до 6 детенышей на помет в послеродовой день 0 (PP0). Используйте ингаляцию углекислого газа с последующим обезглавливанием хирургическими ножницами в качестве вторичного метода эвтаназии.
- На послеродовой день 2 (ПП2) индивидуально удерживайте контроль и плотины CGS внутри хорошо вентилируемой 50 мл полипропилеленовой конической трубки в течение 20 мин. Сразу после удерживающего напряжения выньте мышь из конической трубки и удерживайте мышь недоминирующей рукой, держа дряблую кожу над плечами и сдней стороны к ушам, чтобы кожа над мандиблей подтягивалась.
- Прокол подчелюстной веной ланцетом немного позади нижней нижней стороны, но перед ушным каналом. Соберите до 100 мкл материнской крови в сывороточной сепараторной трубке. После забора пробы нанесите мягкое давление марлей на место прокола, чтобы остановить кровотечение. Верните плотины в домашнюю клетку, как только кровотечение прекратится.
- Центрифугируют трубку сепаратора сыворотки при 21 130 х г в течение 6 мин и аккуратно удаляют сыворотку. Храните сыворотку при -20 °C для последующего использования. Измерьте концентрацию кортикостерона в сыворотке крови с помощью набора ИФА в соответствии с протоколом производителя.
10. Измерение послеродовых поведенческих изменений у подопытных мышей (необязательно)
- Чтобы подготовиться к поведенческому анализу, выбраковываем пометы до 6 детенышей на помет на PP0.
- Провести анализ фрагментации материнской помощи от PP2 до PP5. Каждый день, во время светового цикла, подвергайте плотины испытательной комнате в течение 5-минутного периода привыкания, прежде чем саперировать поведение матери в течение 30-минутного периода.
- Оцените фрагментацию материнского ухода, измерив среднюю продолжительность индивидуального облизывания/груминга и общее количество приступов, выполненных плотинами19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение при облизывании/уходе определяется как поведение, при котором дама вступает в контакт с телом щенка языком, или щенок обрабатывается плотиной с помощью ее предусилищ. Схватка определяется как непрерывный период времени, когда дама занимается облизыванием / уходом за своими щенками.
- Оцените фрагментацию материнского ухода, измерив среднюю продолжительность индивидуального облизывания/груминга и общее количество приступов, выполненных плотинами19.
- Выполните анализ ангедонии с помощью теста предпочтений сахарозы (SPT) от PP0 до PP6. Подвергайте дамбы воздействию одной бутылки чистой воды объемом 100 мл и одной бутылки 4% раствора сахарозы объемом 100 мл в их домашней клетке. Измерьте количество потребляемой воды и сахарозы (в мл) ежедневно. Замена места размещения бутылок в домашней клетке. Рассчитайте предпочтение сахарозы, используя средние значения за последние 4 дня: предпочтительное % = [(потребление сахарозы / сахарозы + потребление воды) x 100].
- Выполните анализ тревожного поведения через лабиринт с повышенным нулем (EZM) на PP8. Поместите плотины по отдельности на аппарат EZM, состоящий из двух закрытых квадрантов и двух открытых квадрантов, поднятых над полом. Позвольте плотинам исследовать лабиринт нетронутым в течение 5 минут. Количественно оцените время, проведенное в открытом квадранте, и количество записей в открытых квадрантах.
11. Измерение изменений веса потомства послеродового потомства (необязательно)
- Чтобы подготовиться к весовой анализу потомства, выбраковывают пометы до 6 детенышей на помет в день рождения (послеродовой день 0, ПН0).
- Регистрируют вес детенышей на PN0 и в разные моменты времени в течение постнатального периода (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воздействие на беременных самок мышей CGS приводит к изменениям параметров, имеющих отношение к хроническому стрессу, включая снижение прироста массы тела во время беременности(Рисунок 2A)и увеличение веса надпочечников в раннем послеродовом периоде(Рисунок 2B)19. Важно отметить, что воздействие CGS приводит к послеродовым аномалиям в нейроэндокринной функции матери. Плотины CGS демонстрируют гиперактивную ось HPA, о чем свидетельствует повышение уровня кортикостерона в сыворотке крови после применения нового острогоинсульта (рисунок 3)19.
Воздействие на беременных самок мышей CGS также приводит к поведенческим аномалиям в раннем послеродовом периоде, которые, по-видимому, отражают появление депрессивно-подобного фенотипа. Плотины CGS демонстрируют изменения в материнской помощи, что отражается в увеличении степени фрагментации материнских сигналов, получаемых детенышами. Средняя продолжительность облизывания/груминга сокращается и связана с увеличением среднего числа приступов после CGS, что указывает на многочисленные короткие эпизоды питательного поведения(Рисунок 4A,B)19. Предпочтение сахарозы также подавлено в плотинах CGS по сравнению с контрольными плотинами, что свидетельствует о наличии ангедонии(рисунок 4C)19. Наконец, плотины CGS также демонстрируют повышенное поведение, связанное с тревогой, что измеряется сокращением времени, проведенного в открытых квадрантах EZM по сравнению с контрольными плотинами(рисунок 4D)19.
У потомства воздействие CGS внутриутробно приводит к снижению прибавки в весе в постнатальный период, с 7 по 21 день, хотя никаких изменений при рождении не наблюдается. Это снижение прибавки в массе тела присутствует у потомства обоих полов(Рисунок 5)19. Следует отметить, что парадигма CGS не оказала никакого влияния на длину гестационности, размер помета или соотношение полов на помет (данные не показаны)19.
Рисунок 1:Схема парадигмы CGS и функциональные оценки для валидации. Эта цифра была изменена с Zoubovsky, S.P. et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Изменения хронических стрессовых параметров в плотинах после воздействия CGS. (A)Изменения массы тела от G6.5-G17.5, Control = 17, CGS = 17. (B) Относительные материнские веса надпочечников при PP2, контроль = 20, CGS = 15. Данные представлены как среднее значение + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Эта цифра была изменена с Zoubovsky, S.P. et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Материнские измерения оси HPA после воздействия CGS. Уровни кортикостерона в сыворотке крови матери измеряются после 20 мин сдерживающей нагрузки на PP2, контроль = 8, CGS = 5. Данные представлены как среднее значение + SEM. *p < 0,05. Эта цифра была изменена с Zoubovsky, S.P. et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Поведенческие изменения в раннем послеродовом периоде в плотинах после воздействия CGS. (A) Средняя продолжительность и(B)количество приступов облизывания/груминга, зарегистрированных из PP2-PP5, Control = 17, CGS = 17. (C) Процентное предпочтение сахарозы в SPT, Control = 17, CGS = 19. (D) Общее количество времени, проведенного в открытом квадранте EZM в течение 5-минутного периода, Контроль = 17, CGS = 19. Данные представлены как среднее значение + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Эта цифра была изменена с Zoubovsky, S.P. et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Изменения массы тела потомства во время постнатального развития после внутриутробного воздействия КГС. Масса тела потомства измеряется от PN0 до PN21, Контроль = 17 пометов, CGS = 17 пометов. Данные представлены как среднее значение + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Эта цифра была изменена с Zoubovsky, S.P. et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воздействие на беременных мышей пергабит CGS послеродовой нейроэндокринной функции матери, включая реакцию оси HPA на новые стрессоры, и связано с различными поведенческими аномалиями, относящимися к перинатальному настроению и тревожным расстройствам. Учитывая, что модель использует фактор экологического риска, ожидается более высокая фенотипическая изменчивость, чем в других наблюдаемых в генетических моделях22. Тем не менее, результаты, полученные в результате применения парадигмы CGS, могут быть согласованы между исследовательскими лабораториями, если принять меры для минимизации переменных, которые могут спутать результаты.
Критические шаги в протоколе включают шаги, связанные с общей практикой животноводства, включая размещение контрольных мышей отдельно от мышей CGS, и этапы спаривания по времени. Совместное размещение контрольных и CGS мышей само по себе может быть стрессовым стимулом для контрольной группы и, следовательно, сбивать с толку нейроэндокринные или поведенческие результаты23,24. Аналогичным образом, не рекомендуется начинать эксперименты с беременными мышами, отправленными от поставщика. Чтобы максимизировать эффективность синхронизированных спариваний, рекомендуется размещать взрослых самок мышей вместе, по крайней мере, за 2 недели до установки временных спариваний для синхронизации их циклов течки. Аналогичным образом, использование взрослых самцов мышей с сексуальным опытом и предотвращение спаривания самцов по крайней мере за 1 неделю до установления временных спариваний максимизирует их фертильность и увеличивает потенциал для успешной беременности. Необходимо также тщательно соблюдать график парадигмы CGS. Применение этих стрессоров различной интенсивности слишком рано во время беременности может повлиять на децидуализацию матки и ингибировать имплантацию эмбриона25. Было также обнаружено, что воздействие стресса во время различных гестационных временных периодов несет различный риск развития нервно-специфического пола для потомства, где мужское потомство значительно более уязвимо, чем женское потомство, к стрессорам во время ранней беременности26,27. График CGS должен быть составлен таким образом, чтобы он обеспечивал непредсказуемость для предотвращения развития адаптационных механизмов и акклиматизации, часто связанных с повторным воздействием предсказуемых стрессоров28. Наконец, пометы должны быть выбракованы до шести детенышей в день рождения, чтобы обеспечить сопоставимые условия на всех плотинах и предотвратить изменение размера помета от путаницы в анализе материнских гормонов или поведения. Аналогичным образом, различные когорты должны использоваться для нейроэндокринных и поведенческих оценок, чтобы свести к минимуму смешанные эффекты сдерживающего стресса и подчелюстных кровотечений на поведение. Различные когорты также должны использоваться для оценки материнской заботы и анализа других поведенческих параметров, чтобы свести к минимуму нарушение материнского взаимодействия с детенышами.
Существует несколько ограничений текущего протокола. Неспособность точно предсказать количество беременных мышей до начала парадигмы CGS может представлять собой значительное финансовое бремя и нагрузку на использование животных. В протокол могут быть внесены изменения для достижения более предсказуемого успеха с временными спариваниями, включая оценку вагинальной цитологии для выявления мышей в стадии течки, где обычно происходит как спаривание, так и овуляция29. Ультразвуковое исследование мышей также может быть включено в парадигму CGS в качестве альтернативного неинвазивного метода для точного выявления беременностей с очень ранних стадий беременности30. Использование специальных племенных чау с повышенным содержанием жира также использовалось другими группами для улучшения брачного успеха31. Тем не менее, следует соблюдать осторожность при внесении изменений в диету, учитывая, что это может повлиять на реактивность и поведение матери при стрессе32. Кроме того, было показано, что текущий протокол эффективен для мышей дикого типа C57BL/6, но модификации протокола могут потребоваться для различных штаммов или генетического фона, а также видов, поскольку они могут иметь большие различия в чувствительности к стрессу, материнской заботе и эмоциональной регуляции.
По сравнению с существующими в настоящее время моделями перипартового стресса, парадигма CGS оказывается более трансляционно значимой, учитывая наблюдаемые эндофенотипы, связанные с заболеванием, включая повышенную реактивность материнского стресса и послеродовые аномалии в уходе за матерью, ангедонию и беспокойство. Эти изменения, по-видимому, повторяют клинические результаты, связанные с перинатальным настроением и тревожными расстройствами. Будущие применения этой модели включают использование парадигмы CGS для выявления специфических для пола эффектов материнского психосоциального стресса на развитие мозга потомства и восприимчивость к болезням. Следует рассмотреть вопрос об изучении влияния CGS на функцию плаценты, учитывая, что дисфункция в ключевых функциях плаценты влияет на развитие мозга плода33. Включение перекрестных экспериментов с парадигмой CGS поможет понять индивидуальный вклад внутриутробного воздействия CGS и связанных с ним изменений в гормональной среде матери по сравнению с послеродовыми аномалиями в воспитании поведения в формировании эмоционального развития потомства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку со стороны Гранта Национального института общих медицинских наук T32 GM063483-14 и Фонда детских исследований Цинциннати. Для данных, адаптированных из Zoubovsky et al., 2019, Creative Common License можно найти по следующему адресу: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
