Summary
Het chronische psychosociale stress (CGS) paradigma maakt gebruik van klinisch relevante stressoren tijdens de zwangerschap bij muizen om psychiatrische stoornissen van moeders en zuigelingen te modelleren. Hier bieden we een stapsgewijze procedure voor het toepassen van het CGS-paradigma en downstream-beoordelingen om dit model te valideren.
Abstract
De peripartumperiode wordt beschouwd als een gevoelige periode waarin ongunstige blootstellingen van moeders op lange termijn negatieve gevolgen kunnen hebben voor zowel moeder als nakomelingen, waaronder de ontwikkeling van neuropsychiatrische aandoeningen. Risicofactoren die verband houden met het ontstaan van affectieve dysregulatie bij de moeder-zuigeling dyad zijn uitgebreid bestudeerd. Blootstelling aan psychosociale stress tijdens de zwangerschap is consequent naar voren gekomen als een van de sterkste voorspellers. Verschillende knaagdiermodellen zijn gemaakt om deze associatie te verkennen; deze modellen zijn echter afhankelijk van het gebruik van fysieke stressoren of een beperkt aantal psychosociale stressoren die op een repetitieve manier worden gepresenteerd, die het type, de intensiteit en de frequentie van stressoren die vrouwen ervaren niet nauwkeurig vastleggen. Om deze beperkingen te overwinnen, werd een chronisch psychosociaal stress (CGS) paradigma gegenereerd dat verschillende psychosociale beledigingen van verschillende intensiteit gebruikt die op een onvoorspelbare manier worden gepresenteerd. Het manuscript beschrijft dit nieuwe CGS-paradigma waarbij zwangere vrouwelijke muizen, van zwangerschapsdag 6,5 tot 17,5, overdag en 's nachts worden blootgesteld aan verschillende stressoren. Dagstressoren, twee per dag gescheiden door een pauze van 2 uur, variëren van blootstelling aan vreemde voorwerpen of roofdiergeur tot frequente veranderingen in beddengoed, verwijdering van beddengoed en kooikanteling. Nachtelijke stressoren omvatten continue blootstelling aan licht, het verwisselen van kooimaten of het bevochtigen van beddengoed. We hebben eerder aangetoond dat blootstelling aan CGS resulteert in de ontwikkeling van maternale neuro-endocriene en gedragsafwijkingen, waaronder verhoogde stressreactiviteit, het ontstaan van gefragmenteerde moederzorgpatronen, anhedonia en angstgerelateerd gedrag, kernkenmerken van vrouwen die lijden aan perinatale stemmings- en angststoornissen. Dit CGS-model wordt daarom een uniek hulpmiddel dat kan worden gebruikt om moleculaire defecten op te helderen die ten grondslag liggen aan maternale affectieve dysregulatie, evenals trans-placentamechanismen die de foetale neuroontwikkeling beïnvloeden en resulteren in negatieve gedragsgevolgen op lange termijn bij de nakomelingen.
Introduction
De mechanismen die ten grondslag liggen aan een verhoogde gevoeligheid voor neuropsychiatrische aandoeningen bij moeders en zuigelingen na ongunstige blootstelling van de moeder in de peripartumperiode blijven grotendeels onbekend. Aanzienlijke fysiologische veranderingen van de moeder treden op tijdens de zwangerschap en de overgang naar de postpartumperiode, waaronder verschillende neuro-endocriene aanpassingen waarvan wordt aangenomen dat ze niet alleen van cruciaal belang zijn voor gezonde neuroontwikkeling vannakomelingen,maar ook voor het behoud van de geestelijke gezondheid van de moeder1,2. Op het niveau van de maternale hypothalamus hypofyse bijnier (HPA) as worden aanpassingen waargenomen in zowel circadiane als stress-geïnduceerde niveaus van glucocorticoïde afgifte, waaronder een afgevlakt ritme van dagelijk HPA-asactiviteit en gedempte HPA-asrespons op acute stressoren3,4,5. Gezien het feit dat verbeterde HPA-asactiviteit wordt gerapporteerd bij een subset van vrouwen met postpartum affectieve dysregulatie, waaronder verhoogde niveaus van circulerende glucocorticoïden en geremde negatieve feedback6,7,8, blootstelling aan stressoren die resulteren in verhoogde postpartum stress reactiviteit en voorkomen dat maternale HPA-asaanpassingen worden verondersteld de gevoeligheid voor neuropsychiatrische aandoeningen te verhogen.
Om de effecten van stress op affectieve dysregulatie bij moeders en zuigelingen te verduidelijken, zijn verschillende knaagdiermodellen van stress in de peripartumperiode gegenereerd. Een meerderheid van deze modellen wordt gekenmerkt door de toepassing van fysieke stressoren die resulteren in homeostatische uitdagingen en veranderingen in de fysiologische toestand van de moeder9, zoals chronische terughoudendheidsstress10 en zwemstress tijdens dracht11, of postpartum shockblootstelling12. Hoewel is aangetoond dat deze paradigma's resulteren in de opkomst van postpartum depressief gedrag en veranderingen in de moederzorg10,11,12, zijn ze beperkt door hun onvermogen om de psychosociale aard van stressoren die vaak door menselijke moeders worden ervaren nauwkeurig vast te leggen. Dit wordt vooral belangrijk bij het proberen om de neuro-endocriene gevolgen van chronische stress in de peripartumperiode te onthullen, aangezien de verwerking van verschillende soorten stressoren wordt verondersteld te worden gemedieerd door verschillende neurale netwerken die HPA-asactivering orkestreren9.
Om deze beperking te overwinnen, hebben verschillende groepen stressparadigma's ontworpen met behulp van psychosociale beledigingen of een combinatie van fysieke en psychosociale stressoren. Het moederscheidingsmodel, waarbij moeders gedurende de postpartumperiode13,14enkele uren per dag van haar jongen worden gescheiden, en het chronische sociale stressmodel, waarbij de moeders worden blootgesteld aan een mannelijke indringer in aanwezigheid van hun nesten 15,16, hebben het ontstaan van afwijkingen in maternale zorg en depressieve fenotypes geassocieerd met fysieke stressparadigma's kunnen reproduceren. Het chronische ultramild stressparadigma, waarbij zwangere vrouwelijke muizen worden blootgesteld aan een verscheidenheid aan psychosociale beledigingen, waaronder kooikanteling en nachtelijke verlichting, evenals substantiële fysiologische beledigingen, zoals terughoudendheidsstress en voedselbeperking, heeft verder aangetoond dat blootstelling aan een gemengd karakter van stressoren resulteert in afwijkingen in het gedrag van moeders, waaronder beperkingen in maternale agressie, evenals dysregulatie in de circadiane activiteit van de HPA-as17,18. In overeenstemming met deze resultaten resulteert een afwisselende beperkingsspanning en overbevolkingsmodel tijdens de zwangerschap in verhogingen in postpartum maternale circadiane corticosteronspiegels en veranderingen in de moederzorg, hoewel er geen verschillen worden waargenomen in de heractiviteit van de HPA-as na blootstelling aan postpartum aan nieuwe acute beledigingen1.
Een uitbreiding van dit werk, het genereren van een zwangerschapsstressparadigma dat meerdere psychosociale beledigingen gebruikt die op een onvoorspelbare manier worden gepresenteerd en het gebruik van fysiologische stressoren minimaliseert. Studies hebben eerder aangetoond dat dit chronische psychosociale stressparadigma (CGS) resulteert in de ontwikkeling van maternale HPA-asdisfunctie, inclusief verbeterde stressreactiviteit in de vroege postpartumperiode19. Deze veranderingen worden geassocieerd met afwijkingen in het gedrag van de moeder, waaronder veranderingen in de kwaliteit van de moederzorg die pups ontvangen, en het ontstaan van anhedonische en angstachtige gedragingen19, kenmerken die consistent zijn met perinatale stemmings- en angststoornissen20,21. Bovendien vermindert de gewichtstoename van nakomelingen tijdens de postnatale periode na blootstelling in de baarmoeder aan CGS19, wat suggereert dat CGS aanhoudende negatieve programmeringseffecten kan hebben in toekomstige generaties.
Het doel bij het ontwikkelen van het CGS-paradigma was om voornamelijk klinisch relevante stressoren te gebruiken, die nauwkeurig het type, de intensiteit en de frequentie van beledigingen vastleggen die vaak geassocieerd worden met neuro-endocriene dysregulatie en de ontwikkeling van perinatale stemmings- en angststoornissen. Hier biedt de studie een gedetailleerd protocol over hoe zwangere vrouwelijke muizen aan CGS kunnen worden onderworpen, evenals downstreambeoordelingen die kunnen worden gebruikt om de geldigheid van het model te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Cincinnati Children's Medical Center en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health. Ad libitum toegang tot standaard knaagdiervoer en water werd te allen tijde aan muizen verstrekt, ook tijdens het CGS-paradigma. Muizen werden gehuisvest op een licht-donkercyclus van 14 uur /10 uur (lichten op 06:00 uur), tenzij anders vermeld (d.w.z. blootstelling aan lichten 's nachts).
1. Voorbereiden op getijde paringen
- Ten minste 2 weken voorafgaand aan het opzetten van getijde paringen, huisvest de volwassen vrouwelijke muizen samen in een standaard muizenkooi (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), vier muizen per kooi. Label elke vrouwelijke muis met een specifiek ID-nummer via een oormerk.
OPMERKING: C57BL6 vrouwelijke muizen zonder eerdere zwangerschap en tussen 3 en 6 maanden oud werden gebruikt voor dit protocol. - Ten minste 1 week voorafgaand aan het opzetten van getijde paringen, huisvest de volwassen mannelijke muizen individueel om te worden gebruikt voor paring.
2. Het opzetten van getijde paringen
- Stel de getijde paringen in om 18:00 uur. Neem twee vrouwelijke muizen en plaats ze in een kooi die een individueel gehuisveste mannelijke muis vasthoudt. Scheid de getijde paringen de volgende ochtend om 08:00 uur.
3. Controle van de copulatorische stekker, aangeduid als zwangerschapsdag 0,5 (G0,5)
- Controleer onmiddellijk na het scheiden van getijde paringen op de aanwezigheid van een copulatorische plug in de vrouwelijke muizen. De aanwezigheid van een copulatory plug markeert G0.5. Laat de muis het draadraster in de kooi houden en til het voorzichtig op bij de staart om de vaginale opening te visualiseren.
OPMERKING: De aanwezigheid van een copulatory plug geeft aan dat seksuele activiteit heeft plaatsgevonden, maar garandeert geen zwangerschap. Verwacht bij het berekenen van het aantal experimentele muizen dat nodig is dat 50% van de muizen wordt aangesloten door getijde paringen en een zwangerschap om de incidentie van 60%-70% te stoppen. - Gebruik eenvoudig visueel onderzoek om de aanwezigheid van een copulatorische plug te identificeren (een ondoorzichtige witachtige geharde massa binnen of enigszins uitstekend uit de vaginale opening). Als de copulatoire plug niet gemakkelijk te herkennen is aan eenvoudig visueel onderzoek, plaats dan voorzichtig een stompe eindsonde in de vaginale opening. Identificeer de pluggen verder terug in de vagina door de weerstand van het inbrengen van de sonde.
- Scheid de vrouwelijke muizen met copulatoire pluggen en groepshuis in standaard muizenkooien, 3 tot 4 muizen per kooi.
4. Voorbereiden op CGS-paradigma
- Wijs willekeurig kooien toe waarin vrouwelijke muizen met copulatoire pluggen zijn ingedeeld in twee groepen op G5.5: Control en CGS-groep. Probeer kooien willekeurig te maken om een ongeveer gelijk aantal muizen per groep te hebben. Breng de muizen over naar schone standaard muizenkooien en label met een "niet storen" teken. Wijs deze kooien aan als "thuiskooien" voor muizen om ze aan het einde van elke stressor te plaatsen.
- Wijs een aparte ruimte in de muisfaciliteit aan om het CGS-paradigma uit te voeren. Ontwerp een 11-daags stressorregime, dat loopt van G6.5 tot G17.5, om elk van de 7-daagse stressoren [blootstelling aan vreemde voorwerpen (knikkers of lego), blootstelling aan roofdiergeur (vuil rattenbed), 30° kooikanteling, frequente veranderingen van beddengoed, verwijdering van beddengoed, beweging op shaker] twee keer per dag te gebruiken en om elk van de 3 nachtstressoren (nachtlampjes aan, kooimaat verandering, blootstelling aan nat beddengoed) 's nachts op een willekeurige manier. Zie figuur 1voor een mogelijk voorbeeldschema en een schema van experimenten die hieronder worden beschreven.
OPMERKING: Elke dag moet de stressor binnen de lichtcyclus van muizen vallen (lichten op 06:00 uur-20:00 uur) en ten minste 2 uur duren, met ten minste een pauze van 2 uur tussen de stressoren. Elke nachtstressor moet aan het begin van de donkere cyclus worden ingesteld (lichten uit 20:00 uur) en gescheiden aan het begin van de lichtcyclus (lichten aan 06:00 uur).
5. Het CGS-paradigma uitvoeren
- Stel specifieke stressoren in op een standaard statische kooi met gefilterde bovenkant en waterfles in de ruimte die is aangewezen voor het CGS-paradigma. Bereid het aantal statische kooien voor dat nodig is voor het experiment, afhankelijk van het aantal muizenkooien dat is aangewezen om CGS te ondergaan tijdens randomisatie. Voordat u met elke stressor begint, moet u de muizenkooien van de CGS-groep van de huiskamer naar de CGS-kamer overbrengen.
OPMERKING: Voer de behandeling/overdracht uit van muizen van de thuiskooi naar de experimentele kooi en terug in laminaire stromingskappen. - Breng de volgende stressoren aan volgens het vooraf ontworpen regime (zie stap 4.2).
- Blootstelling aan vreemde voorwerpen (knikkers of lego): Plaats zes knikkers (met een diameter van 14 mm) of zes lego (verschillende vormen, niet groter dan 4 cm hoog) willekeurig verdeeld in een schone statische kooi met muisbedden, zonder de muizennesten op te smeren. Plaats de muizen samen met hun tegenhangers van de thuiskooi gedurende 2 uur in de statische kooi met vreemde voorwerpen. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
OPMERKING: Reinig de vreemde voorwerpen na gebruik. - Blootstelling aan roofdiergeur (vuil rattenbed): Plaats 1 cm diep vers vuil rattenbedden van vrouwelijke ratten in een schone statische kooi zonder muizenbedden, zonder de muizennesten op te sten. Plaats de muizen samen met hun tegenhangers van de thuiskooi in de statische kooi met vuil rattenbedden gedurende 2 uur. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- 30° kooikanteling: Plaats de muizen met hun tegenhangers van de thuiskooi in een schone statische kooi met muizenbedden, zonder de muizennesten op te stenven. Kantel de kooi 2 uur tegen de muur. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Frequente veranderingen van beddengoed: Plaats de muizen met hun tegenhangers van de thuiskooi in een schone statische kooi met muisbedden, zonder de muizennesten op te stenven. Vervang het muisbed elke 10 minuten door schoon muisbed voor 2 uur. Tijdens het verschonen van het muizenbed plaatst u de muizen voorzichtig in een andere schone kooi om direct contact met de muizen te voorkomen. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Verwijdering van beddengoed: Plaats de muizen samen met hun tegenhangers van de thuiskooi gedurende 2 uur in een lege schone statische kooi (zonder muizenbedden of nestjes). Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Beweging op shaker: Plaats de muizen met hun tegenhangers van de thuiskooi in een schone statische kooi met muizenbedden, zonder de muizennesten op te stenuizen. Plaats de statische kooi bovenop een wederkerige lab shaker ingesteld op 140 slagen per minuut gedurende 2 uur. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Nachtelijke blootstelling aan lichten: Plaats de muizen met hun tegenhangers van de thuiskooi in een schone statische kooi met muisbedden, zonder de muizennesten op te snuiven. Houd de lichten 's nachts aan (20:00 uur-06:00 uur) om de donkere cyclus te verstoren. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Kooimaatwissel: Breng de muis over in een schone statische kooi met muisbedden die wordt gehuisvest door een andere groep van twee vrouwelijke muizen (intacte vrouwtjes die geen deel uitmaken van de behandeling of controlegroep). Houd de muis 's nachts in de statische kooi met onbekende kooigenoten. Breng de muis terug naar zijn thuiskooi met zijn specifieke tegenhangers van de thuiskooi aan het einde van de stressor.
- Blootstelling aan nat strooisel: Vul de statische kooi met muisbedden met schoon water dat op 24 °C wordt bewaard totdat het beddengoed verzadigd is met water. Plaats de muizen samen met hun tegenhangers van de thuiskooi 's nachts in de statische kooi met nat beddengoed. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Blootstelling aan vreemde voorwerpen (knikkers of lego): Plaats zes knikkers (met een diameter van 14 mm) of zes lego (verschillende vormen, niet groter dan 4 cm hoog) willekeurig verdeeld in een schone statische kooi met muisbedden, zonder de muizennesten op te smeren. Plaats de muizen samen met hun tegenhangers van de thuiskooi gedurende 2 uur in de statische kooi met vreemde voorwerpen. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi met dezelfde tegenhangers aan het einde van de stressor.
- Houd tijdens het CGS-paradigma de controlemuizen ongestoord in hun thuiskooien in de woonkamer.
- Vervang de gebruikte thuiskooien door nieuwe thuiskooien op G10.5. Op G17.5, aan het einde van de nachtelijke stressor, eenhuis alle experimentele muizen voor te bereiden op parturition en downstream functionele beoordelingen.
6. Monitoring van de experimentele muizen tijdens het CGS-paradigma
- Bewaak de muizen om de 1 uur tijdens het aanbrengen van de stressor, behalve tijdens nachtelijke stressoren.
- Sluit de muizen met noodverschijnselen, waaronder wonden, lethargie of enige fysieke afwijking, uit van het experiment. Neem indien nodig contact op met het veterinair personeel.
7. Meten van het percentage lichaamsgewichtstoename tijdens de dracht bij de experimentele muizen (optioneel)
- Weeg op G6.5 de muizen individueel vóór de blootstelling aan stressoren. Weeg de muizen op G17.5, aan het einde van de nachtelijke stressor, individueel. Weeg de controlemuizen op de equivalente zwangerschapstijdpunten.
- Meet het percentage gewichtstoename tijdens de zwangerschap door het gewicht van de eerste dag van het CGS-paradigma (G6.5) in te stellen op 100%.
8. Meten van de postpartum relatieve bijniergewichten bij experimentele muizen (optioneel)
- Weeg op postpartumdag 2 (PP2) de besturing en de CGS-dammen individueel. Euthanaseer de dammen door koolstofdioxide-inademing gevolgd door cervicale dislocatie in een zuurkast.
- Plaats de muizen op een dissectieplaat, steriliseer het buikgebied met 70% ethanol en open de buikholte met een schaar om een verticale snede te maken. Isoleer de bijnieren naast de voorste pool van de nieren met een tang, bilateraal. Ontleed voorzichtig het vetweefsel rond de bijnieren onder een ontleedmicroscoop.
- Weeg de bilaterale bijnieren individueel. Bereken de relatieve bijniergewichten in milligram per gram (totaal gewicht van de rechter- en linker bijnier/lichaamsgewicht).
9. Meten van de postpartum hypothalamus hypofyse bijnier (HPA) asactiviteit bij de experimentele muizen (optioneel)
- Ter voorbereiding op HPA-asmetingen euthanaseert u nesten tot 6 jongen per nest op postpartumdag 0 (PP0). Gebruik koolstofdioxide-inademing, gevolgd door onthoofding met een chirurgische schaar als secundaire methode van euthanasie.
- Op postpartum dag 2 (PP2) de besturing en de CGS-dammen in een goed geventileerde polypropyleen conische buis van 50 ml gedurende 20 minuten individueel beperken. Verwijder onmiddellijk na de stress van de terughoudendheid de muis uit de conische buis en houd de muis vast met de niet-dominante hand door de losse huid over de schouders en achterste tegen de oren te houden om de huid strak over de onderkaak te hebben.
- Prik de submandibulaire ader door met een lancet iets achter de onderkaak maar voorste naar de gehoorgang. Verzamel tot 100 μL moederbloed in een serumafscheiderbuis. Oefen na het verzamelen van het monster een zachte druk met gaas uit op de punctieplaats om het bloeden te stoppen. Breng de dammen terug naar de huiskooi zodra het bloeden stopt.
- Centrifugeer de serumafscheiderbuis gedurende 6 minuten op 21.130 x g en verwijder het serum voorzichtig. Bewaar het serum bij -20 °C voor later gebruik. Meet de serumcorticosteronconcentratie met een ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
10. Meten van de postpartum gedragsveranderingen bij de experimentele muizen (optioneel)
- Om zich voor te bereiden op de gedragsanalyse, ruimt u nesten op tot 6 pups per nest op PP0.
- Voer een analyse uit van de maternale zorgfragmentatie van PP2 naar PP5. Stel de dammen elke dag, tijdens de lichtcyclus, gedurende een gewenkingsperiode van 5 minuten bloot aan de testruimte voordat u het moedergedrag gedurende een periode van 30 minuten filmt.
- Beoordeel de fragmentatie van de moederzorg door de gemiddelde lengte van een individuele lik-/verzorgingsaanval en het totale aantal aanvallen uitgevoerd door moeders te meten19.
OPMERKING: Lik-/verzorgingsgedrag wordt gedefinieerd als een gedrag waarbij de moeder contact maakt met het lichaam van de pup met haar tong, of de pup wordt behandeld door de moeder met haar voorzagen. Een aanval wordt gedefinieerd als een ononderbroken periode waarin de moeder bezig is met het likken / verzorgen van haar pups.
- Beoordeel de fragmentatie van de moederzorg door de gemiddelde lengte van een individuele lik-/verzorgingsaanval en het totale aantal aanvallen uitgevoerd door moeders te meten19.
- Voer een analyse uit van anhedonie via sucrose preference test (SPT) van PP0 tot PP6. Stel de dammen bloot aan één fles schoon water van 100 ml en één fles van 4% sacharoseoplossing van 100 ml in hun thuiskooi. Meet de hoeveelheid water en sacharose die dagelijks (in ml) wordt geconsumeerd. Verwissel de flesplaatsing in de thuiskooi. Bereken de sacharosevoorkeur aan de hand van de gemiddelden van de afgelopen 4 dagen: voorkeur % = [(sucroseverbruik / sacharose + waterverbruik) x 100].
- Voer analyse uit van angstachtig gedrag via verhoogd nuldoolhof (EZM) op PP8. Plaats de dammen afzonderlijk op het EZM-apparaat bestaande uit twee gesloten kwadranten en twee open kwadranten die van de vloer zijn opgehoge. Laat de dammen het doolhof 5 minuten ongestoord verkennen. Kwantificeer de tijd die in het open kwadrant wordt doorgebracht en het aantal vermeldingen in de open kwadranten.
11. Meten van de postnatale veranderingen in het gewicht van de nakomelingen (optioneel)
- Om zich voor te bereiden op de gewichtsanalyse van nakomelingen, ruimt u nesten op tot 6 jongen per nest op de dag van geboorte (postnatale dag 0, PN0).
- Registreer het gewicht van pups op PN0 en op verschillende tijdstippen tijdens de postnatale periode (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het blootstellen van de zwangere vrouwelijke muizen aan CGS resulteert in veranderingen in chronische stressrelevante parameters, waaronder een vermindering van de gewichtstoename tijdens de zwangerschap (figuur 2A) en verhoogde bijniergewichten in de vroege postpartumperiode (Figuur 2B)19. Belangrijk is dat blootstelling aan CGS resulteert in postpartumafwijkingen in de neuro-endocriene functie van de moeder. CGS-dammen vertonen een hyperactieve HPA-as , zoals blijkt uit de verhoogde serumcorticosteronspiegels na de toepassing van een nieuwe acute belediging (figuur 3)19.
Het blootstellen van de zwangere vrouwelijke muizen aan CGS resulteert verder in gedragsafwijkingen in de vroege postpartumperiode die de opkomst van een depressief-achtig fenotype lijken te weerspiegelen. CGS-moederdammen vertonen veranderingen in de moederzorg, zoals blijkt uit een toename van de mate van fragmentatie van maternale signalen die door de pups worden ontvangen. De gemiddelde duur van likken / verzorgen periodes is verminderd en geassocieerd met een toename van het gemiddelde aantal aanvallen na CGS, wat wijst op tal van korte episodes van verzorgend gedrag (Figuur 4A, B)19. De voorkeur voor sucrose is ook depressief bij CGS-dammen in vergelijking met controledammen , wat wijst op de aanwezigheid van anhedonia (Figuur 4C)19. Ten slotte vertonen de CGS-dammen ook verhoogd angstgerelateerd gedrag , gemeten aan de hand van een vermindering van de tijd die in de open kwadranten van de EZM wordt doorgebracht in vergelijking met controledammen (Figuur 4D)19.
Bij de nakomelingen resulteert blootstelling aan CGS in-utero in een verminderde gewichtstoename tijdens de postnatale periode, van postnatale dag 7 tot 21, hoewel er bij de geboorte geen veranderingen worden waargenomen. Deze vermindering van de gewichtstoename is aanwezig bij nakomelingen van beide geslachten (Figuur 5)19. Het CGS-paradigma had geen effect op de zwangerschapsduur, de grootte van het nest of de geslachtsverhouding per nest (gegevens niet weergegeven)19.
Figuur 1: Schematisch van CGS paradigma en functionele beoordelingen voor validatie. Dit cijfer is gewijzigd uit Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Veranderingen in de chronische stressgerelateerde parameters in de dammen na blootstelling aan CGS. (A) Veranderingen in lichaamsgewicht ten opzichte van G6.5-G17.5, Controle = 17, CGS = 17. (B) Relatieve gewichten van de bijnier van de moeder bij PP2, Controle = 20, CGS = 15. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Dit cijfer is gewijzigd uit Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Maternale HPA-asmetingen na blootstelling aan CGS. Maternale serumcorticosteronspiegels gemeten na 20 minuten terughoudendheidsspanning op PP2, Controle = 8, CGS = 5. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde + SEM. *p < 0,05. Dit cijfer is gewijzigd uit Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Gedragsveranderingen in de vroege postpartumperiode bij dammen na blootstelling aan CGS. (A) Gemiddelde duur en (B) aantal likken/verzorgende periodes geregistreerd van PP2-PP5, Controle = 17, CGS = 17. (C) Procentuele sucrosevoorkeur in SPT, Control = 17, CGS = 19. (D) Totale hoeveelheid tijd doorgebracht in open kwadrant van EZM gedurende de periode van 5 minuten, Controle = 17, CGS = 19. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd uit Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Veranderingen in het lichaamsgewicht van de nakomelingen tijdens postnatale ontwikkeling na blootstelling in de baarmoeder aan CGS. Het lichaamsgewicht van de nakomelingen gemeten van PN0 tot PN21, Controle = 17 nesten, CGS = 17 nesten. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Dit cijfer is gewijzigd uit Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het blootstellen van de zwangere muizen aan CGS stoornissen postpartum maternale neuro-endocriene functie, met inbegrip van HPA-asrespons op nieuwe stressoren, en wordt geassocieerd met verschillende gedragsafwijkingen die relevant zijn voor perinatale stemmings- en angststoornissen. Aangezien het model gebruik maakt van een milieurisicofactor, wordt een hogere fenotypische variatie verwacht dan anderszins wordt waargenomen in genetische modellen22. Niettemin kunnen resultaten verkregen door toepassing van het CGS-paradigma consistent zijn in onderzoekslaboratoria als ervoor wordt gezorgd dat variabelen die resultaten kunnen verwarren, worden geminimaliseerd.
Kritieke stappen in het protocol omvatten stappen met betrekking tot algemene veehouderijpraktijken, waaronder het huisvesten van controlemuizen gescheiden van CGS-muizen, en getijde paringsstappen. Co-housing control en CGS-muizen kunnen op zichzelf een stressvolle stimulus zijn voor de controlegroep en daarom neuro-endocriene of gedragsresultaten verwarren23,24. Evenzo wordt het niet aanbevolen om experimenten te starten met zwangere muizen die van de leverancier worden verzonden. Om de efficiëntie van getijde paringen te maximaliseren, wordt aanbevolen om volwassen vrouwelijke muizen ten minste 2 weken voorafgaand aan het opzetten van getijde paringen samen te huisvesten om hun oestruscycli te synchroniseren. Evenzo zal het gebruik van seksueel ervaren volwassen mannelijke muizen en het voorkomen dat mannetjes ten minste 1 week voorafgaand aan het opzetten van getijde paringen paren, hun vruchtbaarheid maximaliseren en het potentieel voor succesvolle zwangerschappen vergroten. De tijdlijn van het CGS-paradigma moet ook zorgvuldig worden gevolgd. Het te vroeg in de zwangerschap toepassen van deze stressoren van verschillende intensiteit kan de decidualisatie van de baarmoeder beïnvloeden en de implantatie van embryo's remmen25. Stressblootstelling tijdens verschillende zwangerschapsvensters bleek ook een verschillend risico op geslachtsspecifieke neuroontwikkelingsziekten voor nakomelingen te dragen, waarbij mannelijke nakomelingen aanzienlijk kwetsbaarder zijn dan vrouwelijke nakomelingen voor stressoren tijdens de vroege zwangerschap26,27. Het CGS-schema moet zodanig zijn ontworpen dat onvoorspelbaarheid wordt gewaarborgd om de ontwikkeling van aanpassingsmechanismen en acclimatisatie te voorkomen die vaak gepaard gaan met herhaalde blootstelling aan voorspelbare stressoren28. Ten slotte moeten nesten op de dag van geboorte tot zes jongen worden geruimd om vergelijkbare omstandigheden op alle moeders te garanderen en te voorkomen dat variabiliteiten in de grootte van het nest de hormoon- of gedragsanalyse van de moeder verstoren. Evenzo moeten verschillende cohorten worden gebruikt voor neuro-endocriene en gedragsbeoordelingen om verstorende effecten van terughoudendheidsstress en submandibulaire bloedingen op gedrag te minimaliseren. Verschillende cohorten moeten ook worden gebruikt voor de beoordeling van de moederzorg en de analyse van andere gedragsparameters om verstoring van de interactie van de moeder met de pups tot een minimum te beperken.
Er zijn verschillende beperkingen aan het huidige protocol. Het onvermogen om het aantal zwangere muizen vóór de start van het CGS-paradigma nauwkeurig te voorspellen, kan een aanzienlijke financiële en dierlijke gebruikslast vormen. Wijzigingen kunnen worden aangebracht in het protocol om meer voorspelbaar succes te bereiken met getijde paringen, waaronder het evalueren van vaginale cytologie om muizen in het oestrusstadium te identificeren, waar zowel paring als ovulatie meestal voorkomen29. Ultraografisch onderzoek van muizen kan ook worden opgenomen in het CGS-paradigma als een alternatieve niet-invasieve techniek om zwangerschappen vanaf zeer vroege stadia van de zwangerschap nauwkeurig te identificeren30. Het gebruik van speciale foksoep, met een verhoogd vetgehalte, is ook door andere groepen gebruikt om het paringssucces te verbeteren31. Voorzichtigheid is echter geboden bij het aanbrengen van veranderingen in het dieet, aangezien dit de reactiviteit en het gedrag van de moeder kan beïnvloeden32. Bovendien is aangetoond dat het huidige protocol effectief is bij wilde C57BL/6-muizen, maar wijzigingen van het protocol kunnen nodig zijn voor verschillende stammen of genetische achtergronden en soorten, omdat ze grote variaties kunnen hebben in stressgevoeligheid, moederzorg en emotionele regulatie.
In vergelijking met de huidige peripartumstressmodellen blijkt het CGS-paradigma meer translationeel relevant te zijn gezien de resulterende ziekterelevante endofenotypen die zijn waargenomen, waaronder verbeterde reactiviteit van maternale stress en postpartumafwijkingen in de moederzorg, anhedonia en angst. Deze veranderingen lijken klinische bevindingen in verband met perinatale stemmings- en angststoornissen samen te vatten. Toekomstige toepassingen van dit model omvatten het gebruik van het CGS-paradigma om seksespecifieke effecten van psychosociale stress van moeders op de ontwikkeling van de hersenen van nakomelingen en de gevoeligheid voor ziekten te identificeren. Het bestuderen van de effecten van CGS op de placentafunctie moet worden overwogen, aangezien is aangetoond dat disfunctie in belangrijke placentafuncties van invloed is op de ontwikkeling van foetale hersenen33. Het opnemen van cross-fostering experimenten met het CGS-paradigma zou verder helpen om de individuele bijdragen in de blootstelling aan CGS in de baarmoeder en de bijbehorende hormonale omgevingsveranderingen van de moeder versus postpartumafwijkingen in het voeden van gedrag te begrijpen bij het vormgeven van de emotionele ontwikkeling van nakomelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen de steun van het National Institute of General Medical Sciences T32 GM063483-14 grant en Cincinnati Children's Research Foundation erkennen. Voor gegevens aangepast van Zoubovsky et al., 2019, Creative Common License is te vinden op de volgende locatie: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
