Summary
慢性社会心理压力（CGS）范式利用小鼠怀孕期间的临床相关压力源来模拟母亲和婴儿的精神疾病。在此，我们提供了一个逐步应用 CGS 范式和下游评估来验证此模型的程序。
Abstract
产前期被认为是一个敏感期，母亲不良暴露可对母亲和后代造成长期的负面后果，包括神经精神病的发展。与母婴染料中出现情感调节不良有关的危险因素已得到广泛研究。怀孕期间暴露在社会心理压力中一直是最有力的预测因素之一。已创建若干啮齿动物模型来探索这种关联：然而，这些模型依赖于使用物理压力源或以重复方式呈现的有限数量的社会心理压力源，这些压力源无法准确捕捉女性经历的压力源的类型、强度和频率。为了克服这些限制，产生了一种慢性社会心理压力（CGS）范式，它采用了各种不同强度的社会心理侮辱，以不可预知的方式表现出来。手稿描述了这一新颖的CGS范式，怀孕的雌性小鼠，从妊娠期的6.5天到17.5日，在白天和夜间暴露在各种压力源中。日间压力源，每天两次，间隔2小时，范围从接触异物或捕食者气味到床上用品的频繁变化、床上用品的拆卸和笼子倾斜。隔夜压力因素包括连续光照射、更换笼子伴侣或湿床上用品。我们以前已经表明，接触CGS会导致孕产妇神经内分泌和行为异常的发展，包括压力反应性增加，产妇护理模式支离破碎的出现，厌食症和焦虑相关行为，患有围产期情绪和焦虑症的妇女的核心特征。因此，这个CGS模型成为一个独特的工具，可用于阐明孕产妇情感调节不良背后的分子缺陷，以及影响胎儿神经发育并导致后代长期行为不良后果的跨胎盘机制。
Introduction
在产妇在产妇期出现不良接触后，母亲和婴儿患神经精神病的易感性增加的机制在很大程度上仍不得而知。在怀孕期间和向产后期过渡期间，会发生重大的产妇生理变化，包括一些神经内分泌适应，这些适应被认为是不仅对健康的后代神经发育，而且对保护产妇心理健康至关重要。在母体下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴的水平，观察到昼夜和压力诱发的糖皮质激素释放水平的适应，包括更扁平的昼夜HPA轴活动节奏和抑制HPA轴对急性应激器的反应3，4，5。鉴于在产后情感调节障碍的一部分妇女中报告了增强的HPA轴活动，包括循环糖皮质激素水平增加和抑制的阴性反馈6、7、8，接触压力源导致产后压力反应增加，并防止产妇HPA轴适应被认为会增加对神经精神病的易感性。
为了阐明压力对母亲和婴儿情感调节不良的影响，在产中产生了几个啮齿动物压力模型。这些模型的特点是物理压力剂的应用，导致家庭静止的挑战和改变大坝生理状态9，如慢性约束应激10和游泳压力在妊娠期11，或产后休克暴露12。虽然这些范式已被证明导致产后抑郁症状行为的出现和产妇护理10，11，12的改变，他们一直受到限制，因为他们无法准确地捕捉人类母亲通常经历的压力源的心理社会性质。这变得特别重要时，试图揭示神经内分泌后果的慢性压力在产期，因为处理不同类型的压力源被认为是由不同的神经网络协调HPA轴激活9。
为了克服这一限制，一些团体设计了压力范式，采用社会心理侮辱或身体和社会心理压力因素的组合。产妇分离模型，在产后13、14期间，水坝每天与幼崽分离数小时，而长期社会压力模型，即水坝在15、16号垃圾面前暴露在男性入侵者面前，能够再现产妇护理异常和与身体压力范式相关的抑郁症状表型的出现。慢性超牛奶应激范式，其中怀孕的雌性小鼠暴露在各种社会心理侮辱，包括笼子倾斜和隔夜照明，以及大量的生理侮辱，如约束压力和食物限制，进一步揭示了暴露在混合性质的压力因素导致母亲行为异常，包括母体攻击性损伤， 以及HPA轴17，18的昼夜活动失调。与这些结果一致，妊娠期间交替的约束压力和过度拥挤模型导致产后母体昼夜皮质激素水平升高以及产妇护理的改变，尽管产后暴露于新的急性侮辱1后HPA轴的再活动没有观察到任何差异。
这项工作的扩展，产生一个妊娠压力范式，采用多种社会心理侮辱呈现在不可预知的方式，并尽量减少使用生理压力源。此前的研究表明，这种慢性社会心理应激范式（CGS）导致母体HPA轴功能障碍的发展，包括19日产后早期压力反应能力增强。这些变化与产妇行为的异常有关，包括幼崽接受的产妇护理质量的改变，以及出现无兴和焦虑样行为19，特征与围产期情绪和焦虑障碍20，21一一致。此外，在子宫内接触CGS19后产后，后代体重增加减少，这表明CGS可能对后代产生持续的负面编程影响。
开发 CGS 范式的目标是主要利用临床相关的压力源，准确捕获通常与神经内分泌调控和围产期情绪和焦虑障碍发展相关的侮辱类型、强度和频率。在这里，该研究提供了如何让怀孕的雌性小鼠接受CGS的详细协议，以及可用于测试模型有效性的下游评估。
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Protocol
描述的所有动物实验都得到了辛辛那提儿童医疗中心动物护理和使用委员会的批准，并且符合国家卫生研究院的指导方针。在CGS范式期间，随时向小鼠提供标准啮齿动物和水的 广告利比图姆 。小鼠被安置在14小时/10小时的光暗循环（灯在06：00h），除非另有规定（即，暴露在灯光过夜）。
1. 准备分时交配
- 在建立定时交配前至少2周，将成年雌性小鼠安置在标准小鼠笼中（18.4厘米×29.2厘米×12.7厘米），每个笼子内有4只小鼠。通过耳标给每只雌性鼠标贴上特定的 ID 号。
注：C57BL6雌性小鼠没有怀孕前和3至6个月年龄用于此协议。 - 在设置定时交配前至少1周，单独安置成年雄性小鼠用于交配。
2. 设置定时交配
- 在 18：00 h 设置定时交配。取两只雌性小鼠，并把它们放在笼子里，笼子里放着一只单独安置的雄性老鼠。第二天早上08：00前将分时交配分开。
3. 检查被指定为妊娠天 0.5 （G0.5） 的共脉插头
- 分离分时交配后，立即检查雌性小鼠是否有共冲插头。共冲塞的存在将标记 G0.5。让鼠标将铁丝网固定在笼子内，然后轻轻抬起尾巴，使阴道开口可视化。
注：有一个共用插头的存在表明性活动已经发生，但不能保证怀孕。在尝试计算所需的实验鼠数量时，预计 50% 的小鼠会从定时交配和怀孕中插入 60%-70% 的发生率。 - 使用简单的视觉检查来识别共脉塞的存在（阴道开口内或稍微突出的不透明白硬质量）。如果通过简单的视觉检查不容易识别共脉塞，请轻轻地将钝端探头插入阴道开口。通过探针插入的阻力，识别位于阴道后面的插头。
- 将雌性小鼠与共冲塞和组屋分开，在标准小鼠笼中，每个笼子内有3至4只小鼠。
4. 为 CGS 范式做准备
- 随机分配笼子，将雌性小鼠的共冲插头分成两组，即控制组和CGS组。尝试随机化笼子，使每组老鼠的数量大致相等。将鼠标转移到清洁标准鼠笼，并贴上"请勿打扰"标志。指定这些笼子为"家庭笼子"，供老鼠将它们放置在每个压力源的末端。
- 指定鼠标设施中的单独房间以执行 CGS 范式。设计一个11天的压力源方案，从G6.5到G17.5，利用每个7天的压力源[暴露在异物（大理石或乐高），捕食者气味暴露（肮脏的老鼠床上用品），30°笼倾斜，床上用品频繁更换，床上用品去除，摇床运动]每天两次，并利用每个3晚的压力源（夜间开灯， 笼伴侣的变化， 暴露在湿床上用品） 过夜随机的方式。有关下面描述的实验的可能示例时间表和示意图，请参阅图 1。
注：每天的压力源应位于小鼠的光循环内（灯在 06：00 h-20：00 h），持续 2 小时，压力源之间至少有 2 小时的中断时间。每个夜间压力源应在暗循环开始时设置（熄灯 20：00 h），并在光周期开始时分离（灯在 06：00 h）。
5. 执行 CGS 范式
- 在标准静态笼子上设置特定的压力源，在指定用于 CGS 范式的房间内设置带过滤顶部和水瓶。根据随机化期间指定接受CGS的鼠标笼的数量，准备实验所需的静态笼的数量。在启动每个压力源之前，将 CGS 组的鼠标笼从住房室转移到 CGS 室。
注：将小鼠从家庭笼子处理/转移至实验笼，然后放回层压流罩中。 - 根据预先设计的方案应用以下压力源（指步骤 4.2）。
- 接触异物（大理石或乐高）：放置六个弹珠（直径14毫米）或六个长腿（不同形状，高度不超过4厘米），随机分布到一个干净的静态笼子与鼠标床上用品，不包括老鼠窝。将鼠标与家笼子的对应物一起放入静态笼中，用异物放置2小时。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
注：使用后清洁异物。 - 捕食者气味暴露（脏老鼠床上用品）：将雌性大鼠的新鲜脏老鼠床上用品放入一个没有老鼠床上用品的干净静态笼子中，不包括老鼠窝。将鼠标与家庭笼子的对应物一起放入静态笼中，用脏老鼠床上用品放置2小时。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 30° 笼倾斜：将鼠标与家笼对应物放入带鼠标床上用品的干净静态笼中，不包括鼠窝。将笼子以 30° 的速度靠在墙上 2 小时。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 床上用品的频繁变化：将老鼠与家里的笼子放在一个干净的静态笼子里，用老鼠的床上用品，不包括老鼠窝。每 10 分钟用干净的鼠标床上用品替换鼠标床上用品 2 小时。在小鼠床上用品更换期间，轻轻地将小鼠放在另一个干净的笼子中，以避免与小鼠直接接触。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 拆下床上用品：将小鼠与家庭笼子的对应物一起放入空的干净静态笼中（没有鼠标床上用品或巢穴）2小时。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 摇床移动：将鼠标与家庭笼子的对应物放入带鼠标床上用品的干净静态笼中，不包括鼠窝。将静态笼子放在对等实验室摇床上，每分钟 140 次，每次 2 小时。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 夜间暴露在灯光下：将老鼠与家里的笼子一起放入一个干净的静态笼子里，配上老鼠床上用品，而不包括老鼠窝。保持灯亮过夜（20：00 h-06：00 h），以干扰暗循环。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 笼子伴侣变化：将鼠标转移到一个干净的静态笼子与鼠标床上用品，这是由两个雌性小鼠（完整的雌性不是治疗或对照组的一部分）的不同组。将鼠标与不熟悉的笼子伙伴一起关在静态笼子里过夜。在压力源结束时，将鼠标与特定的家笼对应方一起放回其主笼。
- 接触湿床上用品：用鼠标床上用品填充静态笼子，将清洁水保持在 24 °C，直到床上用品充满水。将老鼠与家里的笼子一起放入静态笼子里，用湿床上用品过夜。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 接触异物（大理石或乐高）：放置六个弹珠（直径14毫米）或六个长腿（不同形状，高度不超过4厘米），随机分布到一个干净的静态笼子与鼠标床上用品，不包括老鼠窝。将鼠标与家笼子的对应物一起放入静态笼中，用异物放置2小时。在压力源结束时，将老鼠送回他们的家庭笼子。
- 在 CGS 范式中，将对照鼠保持在住房室内的笼子中不受干扰。
- 在 G10.5 上用新的家庭笼子替换旧的家庭笼子。在G17.5，在隔夜压力源结束时，单屋所有实验鼠准备分区和下游功能评估。
6. 在CGS范式期间监测实验鼠
- 在压力源应用期间，每 1 小时监测一次小鼠，但隔夜压力源除外。
- 排除在实验中表现出痛苦迹象的小鼠，包括伤口、嗜睡或任何身体异常。根据需要联系兽医人员。
7. 测量实验鼠妊娠期间体重增加百分比（可选）
- 在G6.5上，在接触压力源之前分别称量小鼠。在G17.5上，在隔夜压力源结束时，分别称量小鼠。在等效妊娠时间点称量对照小鼠。
- 通过将 CGS 范式 （G6.5） 第一天的体重设定为 100%，测量妊娠期间体重增加的百分比。
8. 测量实验鼠产后相对肾上腺重量（可选）
- 在产后第 2 天 （PP2）， 分别称量控制和 CGS 大坝。通过吸入二氧化碳，然后在烟罩中颈椎错位，对大坝实施安乐死。
- 将小鼠放在解剖板上，用70%的乙醇对腹部区域进行消毒，然后用剪刀打开腹腔进行垂直切割。以双边方式将肾上腺与钳子隔离，与肾脏前极相邻。仔细解剖解剖显微镜下方肾上腺周围的脂肪组织。
- 单独称量双肾上腺。计算每克毫克的相对肾上腺重量（右肾上腺和左肾上腺/身体总重量）。
9. 测量实验鼠产后下垂体肾上腺（HPA）轴活动（可选）
- 为了准备HPA轴测量，在产后第0天（PP0）将垃圾安乐死至每只6只幼崽。使用二氧化碳吸入，然后用手术剪刀斩首作为安乐死的辅助方法。
- 产后第 2 天（PP2）将单独控制并限制 CGS 大坝在通风良好的 50 mL 聚丙烯锥形管内 20 分钟。约束应力后，立即将鼠标从锥形管中取出，用非主导手约束鼠标，将松弛的皮肤抱在肩部和后部到耳朵上，使皮肤在可粘性绷紧的部位上。
- 用长矛刺穿下部静脉，略在可穿戴但前部到耳道后面。在血清分离管中收集多达 100 μL 的母体血液。采集样品后，用纱布施加温和的压力，以止血。一旦出血停止，将水坝送回家庭笼子。
- 将血清分离管离心，在 21，130 x g 下 6 分钟，并小心地取出血清。将血清存储在 -20 °C 以供以后使用。根据制造商的协议，通过 ELISA 套件测量血清皮质酮浓度。
10. 测量实验鼠的产后行为变化（可选）
- 为了准备行为分析，在PP0上扑杀每只幼崽6只幼崽。
- 对从PP2到PP5的产妇护理碎片进行分析。每天，在光周期期间，将水坝暴露在测试室5分钟的居住期，然后对母体行为进行30分钟的录像。
- 通过测量单个舔/梳理回合的平均长度和大坝19进行回合的总次数来评估产妇护理的碎片。
注：舔/梳妆行为被定义为大坝用舌头接触幼崽身体的行为，或者大坝用她的前锯处理幼崽的行为。一回合被定义为一个不间断的时间，大坝从事舔/梳理她的幼崽。
- 通过测量单个舔/梳理回合的平均长度和大坝19进行回合的总次数来评估产妇护理的碎片。
- 通过从 PP0 到 PP6 的蔗糖偏好测试 （SPT） 对 anhedonia 进行分析。将大坝暴露在家中笼子里一瓶100mL的清洁水和一瓶100mL的4%蔗糖溶液中。测量每天消耗的水和蔗糖（mL）量。将瓶子放置在家庭笼子中。使用过去 4 天的平均值计算蔗糖偏好： 偏好百分比 = [蔗糖消费 / 蔗糖 = 水消耗） x 100] 。
- 通过 PP8 上的高架零迷宫 （EZM） 对类似焦虑的行为进行分析。将水坝单独放置在EZM装置上，由两个封闭象限和两个从地板上升高的开放象限组成。让水坝在不受干扰的情况下探索迷宫5分钟。量化在开放象限中花费的时间和进入开放象限的条目数量。
11. 测量产后后体重变化（可选）
- 为了准备后代体重分析，在出生当天（产后第0天，PN0），每只幼崽扑杀6只幼崽。
- 在产后期间（PN2、7、15、21）的不同时间点记录幼崽在PN0上的重量。
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Representative Results
将怀孕的雌性小鼠暴露在CGS中会导致慢性应激相关参数的变化，包括怀孕期间体重增加（图2A）减少，产后早期肾上腺重量增加（图2B）19。重要的是，接触CGS会导致产妇神经内分泌功能的产后异常。CGS大坝表现出一个过度活跃的HPA轴，这表现为血清皮质激素水平增加后，应用一种新的急性侮辱（图3）19。
将怀孕的雌性小鼠暴露在CGS中进一步导致产后早期的行为异常，这似乎反映了抑郁症状表型的出现。CGS大坝显示母体护理的改变，这反映在幼崽接收的母体信号碎片化程度的增加。舔/梳妆回合的平均持续时间减少，并与CGS后的平均回合数增加有关，表明许多培养行为的短集（图4A，B）19。与控制水坝相比，CGS大坝的蔗糖偏好也很低，这表明存在安希多尼亚（图4C）19。最后，CGS 大坝还显示与焦虑相关的行为增加，与控制大坝 （图 4D）19相比，在 EZM 的开放象限中花费的时间减少。
在后代中，在子宫内接触CGS会导致产后7至21日体重增加减少，尽管出生时没有观察到任何变化。体重增加的减少存在于两性后代（图5）19。值得注意的是，CGS范式对每只垃圾的妊娠长度、垃圾大小或性别比（未显示数据）19没有任何影响。
图1：CGS范式和功能评估的示意图，以进行验证。 这个数字已经从祖博夫斯基，S.P.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：CGS暴露后大坝中长期应激相关参数的变化。 （A） 体重从G6.5-G17.5、控制 = 17、CGS = 17变化。（B） 相对母体肾上腺重量在PP2，控制 = 20，CGS = 15。以平均值表示的数据 = SEM. *p < 0.05， ***p < 0.0001。这个数字已经从祖博夫斯基，S.P.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：CGS暴露后母体HPA轴测量。 母体血清皮质激素水平测量后 20 分钟的约束压力 PP2， 控制 = 8， CGS = 5.以平均值表示的数据 = SEM. *p < 0.05。这个数字已经从祖博夫斯基，S.P.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：CGS暴露后大坝产后初期的行为变化。 （A） 平均持续时间及（B） 从PP2-PP5、控制 = 17、CGS = 17记录的舔/梳妆次数。（C） SPT 中蔗糖偏好百分比， 控制 = 17， CGS = 19.（D） 在 5 分钟期间在 EZM 开放象限中花费的总时间，控制 = 17，CGS = 19。以平均值表示的数据 = SEM *p < 0.05， **p < 0.01。这个数字已经从祖博夫斯基，S.P.等人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：子宫内接触CGS后产后体重的变化。从 PN0 到 PN21 测量的后代体重，控制 = 17 个垃圾，CGS = 17 个垃圾。以平均值表示的数据 = SEM. *p < 0.05， ***p < 0.0001。这个数字已经从祖博夫斯基，S.P.等人修改。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
将怀孕小鼠暴露在CGS干扰产后产妇神经内分泌功能，包括HPA轴对新压力源的反应，并与与围产期情绪和焦虑障碍相关的各种行为异常有关。鉴于该模型采用了环境危险因素的利用，预计表型变异性会高于遗传模型22中观察到的。然而，如果注意尽量减少可能混淆结果的变量，则从应用 CGS 范式中获得的结果可以在各研究实验室中保持一致。
协议中的关键步骤包括与一般饲养做法有关的步骤，包括独立于CGS小鼠的住房控制小鼠和定时交配步骤。共同住房控制和CGS小鼠本身可能是一个压力刺激对对照组，因此混淆神经内分泌或行为结果23，24。同样，不建议对从供应商运来的怀孕小鼠进行实验。为了最大限度地提高定时交配的效率，建议成年雌性小鼠在设置定时交配前至少2周将雌性小鼠安置在一起，以同步它们的雌性周期。同样，使用性经验丰富的成年雄性小鼠，并防止雄性在建立定时交配前至少1周交配，将最大限度地提高它们的生育能力，并增加成功怀孕的可能性。CGS 范式的时间表也必须仔细遵循。过早地在妊娠期施用这些不同强度的压力源会影响子宫分化并抑制胚胎植入。在不同的妊娠期窗口的压力暴露也被发现携带不同的性别特异性神经发育疾病的风险的后代，其中男性后代比女性后代更脆弱的压力，在怀孕早期怀孕26，27。CGS时间表的设计必须确保不可预测性，以防止适应机制的发展和适应往往与反复暴露在可预测的压力源28。最后，在出生当天，垃圾应被扑杀到六只幼崽身上，以确保所有水坝的可比条件，并防止垃圾大小变异混淆母体激素或行为分析。同样，应雇用不同的组群进行神经内分泌和行为评估，以尽量减少约束压力和亚脑出血对行为的混淆影响。还应使用不同的组群进行产妇护理评估和分析其他行为参数，以尽量减少产妇与幼崽互动的中断。
当前协议有几个限制。在CGS模式开始前无法准确预测怀孕小鼠的数量，可能会造成相当大的经济和动物使用负担。可以修改协议，以实现更可预测的成功与定时交配，包括评估阴道细胞学，以确定小鼠在埃斯特鲁斯阶段，其中交配和排卵通常发生在29。小鼠的超声检查也可以纳入CGS范式，作为替代的非侵入性技术，以准确识别怀孕从妊娠初期30。使用特殊育种周，随着脂肪含量的增加，也已被其他组采用，以提高交配成功31。然而，在改变饮食时必须谨慎，因为这可能会影响母亲的压力反应和行为。此外，目前的协议已被证明对野生型C57BL/6小鼠有效，但可能需要修改协议的不同菌株或遗传背景以及物种，因为它们在压力敏感性、产妇护理和情绪调节方面可能有很大差异。
与目前存在的产外压力模型相比，CGS 范式证明更具有转化相关性，因为观察到的与疾病相关的内啡肽类型，包括增强母体压力反应和产妇护理中的产后异常、anhedonia 和焦虑。这些改变似乎概括了与围产期情绪和焦虑症相关的临床发现。该模型的未来应用包括利用CGS范式来识别孕产妇心理社会压力对后代大脑发育和疾病易感性的特殊性别影响。鉴于关键胎盘功能功能障碍已证明会影响胎儿大脑发育，因此应考虑研究CGS对胎盘功能的影响。将交叉培养实验与CGS范式相结合，将进一步帮助理解子宫内CGS暴露和相关母体荷尔蒙环境变化与产后异常在培养行为方面对后代情绪发展的贡献。
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Disclosures
作者没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
作者希望感谢国家普通医学研究所T32 GM063483-14赠款和辛辛那提儿童研究基金会的支持。对于改编自 Zoubovsky 等人的数据，2019 年，创意通用许可证可在以下位置找到：http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
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