Summary
Kronik psikososyal stres (CGS) paradigması, annelerin ve bebeklerin psikiyatrik bozukluklarını modellemek için farelerde hamilelik sırasında klinik olarak ilgili stresörler kullanmaktadır. Burada, bu modeli doğrulamak için CGS paradigmasını ve aşağı akış değerlendirmelerini uygulamak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
Peripartum dönemi, olumsuz anne maruziyetlerinin nöropsikiyatrik bozuklukların gelişimi de dahil olmak üzere hem anne hem de yavrular için uzun süreli olumsuz sonuçlara neden olabileceği hassas bir dönem olarak kabul edilir. Anne-bebek boyasında duyuşsal düzensizlik ortaya çıkmasıyla bağlantılı risk faktörleri kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Hamilelik sırasında psikososyal strese maruz kalmak sürekli olarak en güçlü tahmincilerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Bu ilişkiyi keşfetmek için birkaç kemirgen modeli oluşturulmuştur; bununla birlikte, bu modeller, kadınların yaşadığı stresörlerin türünü, yoğunluğunu ve sıklığını doğru bir şekilde yakalayamayan fiziksel stresörlerin veya tekrarlayan bir şekilde sunulan sınırlı sayıda psikososyal stresörün kullanımına dayanır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, öngörülemeyen bir şekilde sunulan farklı yoğunlukta çeşitli psikososyal hakaretler kullanan kronik bir psikososyal stres (CGS) paradigması oluşturuldu. Makale, gebelik günü 6.5'ten 17.5'e kadar hamile dişi farelerin gün boyunca ve gece boyunca çeşitli stresörlere maruz kaldığı bu yeni CGS paradigmasını anlatıyor. Günde iki saat mola ile ayrılan günlük stresörler, yabancı nesnelere veya avcı kokusuna maruz kalmaktan yataklardaki sık değişikliklere, yatakların çıkarılmasına ve kafes yatırmaya kadar uzanır. Gece stresörleri arasında sürekli ışığa maruz kalma, kafes montaj ilişkilerini değiştirme veya yatakları ıslatma bulunur. Daha önce CGS'ye maruz kalmanın, artan stres reaktivitesi, parçalanmış anne bakım kalıplarının ortaya çıkması, anhedonia ve anksiyete ile ilgili davranışlar, perinatal ruh hali ve anksiyete bozukluklarından muzdarip kadınların temel özellikleri de dahil olmak üzere maternal nöroendokrin ve davranışsal anormalliklerin gelişmesiyle sonuçladığını göstermiştik. Bu nedenle, bu CGS modeli, anne duyuşsal düzensizliği altında bulunan moleküler kusurların yanı sıra fetal nörogelişimi etkileyen ve yavrularda olumsuz uzun vadeli davranışsal sonuçlara neden olan trans-plasetal mekanizmaları emmek için kullanılabilecek benzersiz bir araç haline gelir.
Introduction
Peripartum dönemindeki olumsuz anne maruziyetlerini takiben anne ve bebeklerde nöropsikiyatrik bozukluklara karşı artan duyarlılığın altında yer alan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Hamilelik sırasında önemli anne fizyolojik değişiklikleri meydana gelir ve doğum sonrası döneme geçiş, sadece sağlıklı yavru nörogelişimi için değil, aynı zamanda anne ruh sağlığını korumak için de kritik olduğu varsayımı yapılan birkaç nöroendokrin adaptasyon dahil1,2. Maternal hipotalamik hipofiz adrenal (HPA) ekseni seviyesinde, diurnal HPA eksen aktivitesinin daha düzleştirilmiş bir ritmi ve akut stresörlere hpa ekseni yanıtının sönümlenmesi de dahil olmak üzere hem sirkadiyen hem de stres kaynaklı glukokortikoid salınım seviyelerinde adaptasyonlar gözlenir3,4,5. Gelişmiş HPA eksen aktivitesinin, dolaşımdaki glukokortikoidlerin artan seviyeleri ve inhibe negatif geri bildirimler de dahil olmak üzere doğum sonrası duyuşsal düzensizliği olan kadınların bir alt kümesinde bildirildiği göz önünealındığında,doğum sonrası stres reaktivitesinin artmasına neden olan ve anne HPA ekseni adaptasyonlarının nöropsikiyatrik bozukluklara duyarlılığı artırdığı düşünülmektedir.
Annelerde ve bebeklerde stresin duyuşsal düzensizlik üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için peripartum döneminde birkaç kemirgen stres modeli üretilmiştir. Bu modellerin çoğunluğu, homeostatik zorluklara ve baraj fizyolojik durumunda değişikliklere neden olan fiziksel stresörlerin uygulanması ile karakterizedir9, kronik kısıtlama stresi10 ve gebelik11sırasında yüzme stresi veya doğum sonrası şok maruziyeti12. Bu paradigmaların doğum sonrası depresif benzeri davranışların ortaya çıkmasına neden olduğu gösterilmiş olsa da, anne bakımında10,11,12, insan anneleri tarafından yaygın olarak görülen stresörlerin psikososyal doğasını doğru bir şekilde yakalayamamalarıyla sınırlıdır. Bu, peripartum döneminde kronik stresin nöroendokrin sonuçlarını ortaya çıkarmaya çalışırken, farklı stresör türlerinin işlenmesinin HPA eksen aktivasyonunu düzenleyen çeşitli sinir ağları tarafından aracılık ettiği düşünüldüğünde özellikle önemli hale gelir9.
Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, birkaç grup psikososyal hakaretler veya fiziksel ve psikososyal stresörlerin bir kombinasyonunu kullanan stres paradigmaları tasarlamıştır. Doğum sonrası13 , 14döneminde barajların yavrularından günde birkaç saat ayrıldığı anne ayırma modeli ve barajların15,16, anne bakımında anormalliklerin ortaya çıkmasını ve fiziksel stres paradigmalarıyla ilişkili depresif benzeri fenotipleri yeniden üretebildiği kronik sosyal stres modeli. Hamile dişi farelerin kafes eğme ve gece aydınlatması da dahil olmak üzere çeşitli psikososyal hakaretlere maruz kaldığı kronik ultramild stres paradigmasının yanı sıra kısıtlama stresi ve gıda kısıtlaması gibi önemli fizyolojik hakaretler, anne saldırganlığındaki bozukluklar da dahil olmak üzere anne davranışlarında anormalliklerle sonuçlanan stresörlerin karışık doğasına maruz kalmayı daha da ortaya çıkarmıştır. hpa ekseninin sirkadiyen aktivitesinde düzensizlik yanı sıra17,18. Bu sonuçlarla tutarlı olarak, gebelik sırasında alternatif bir kısıtlama stresi ve aşırı kalabalık modeli, doğum sonrası anne sirkadiyen kortikosteron seviyelerinde yükselmelerin yanı sıra anne bakımında değişikliklere neden olur, ancak doğum sonrası akut hakaretlere maruz kaldıktan sonra HPA ekseni yeniden aktivitesinde herhangi bir fark gözlenmez1.
Bu çalışmanın genişletilmesi, öngörülemeyen bir şekilde sunulan birden fazla psikososyal hakareti kullanan ve fizyolojik stresörlerin kullanımını en aza indiren bir gebelik stres paradigması oluşturur. Çalışmalar daha önce bu kronik psikososyal stres paradigmasının (CGS) doğum sonrası erken dönemde gelişmiş stres reaktivitesi de dahil olmak üzere maternal HPA eksen disfonksiyonunun gelişimiyle sonuçlendiğini göstermiştir19. Bu değişiklikler, yavrular tarafından alınan anne bakımının kalitesindeki değişiklikler ve anhedionik ve anksiyete benzeri davranışların ortaya çıkması da dahil olmak üzere anne davranışındaki anormalliklerle ilişkilidir19Perinatal ruh hali ve anksiyete bozuklukları ile tutarlı özellikler20,21. Ayrıca, yavru kilo alımı CGS19'arahim içi maruziyeti takiben doğum sonrası dönemde azaltır CGS'nin gelecek nesillerde kalıcı olumsuz programlama etkileri olabileceğini düşündürmektedir.
CGS paradigmasını geliştirmedeki amaç, öncelikle nöroendokrin düzensizlik ve perinatal ruh hali ve anksiyete bozukluklarının gelişimi ile ilişkili hakaretlerin türünü, yoğunluğunu ve sıklığını doğru bir şekilde yakalayan klinik olarak ilgili stresörleri kullanmaktı. Burada, çalışma hamile dişi farelerin CGS'ye nasıl tabi tutulacağına dair ayrıntılı bir protokol ve modelin geçerliliğini test etmek için kullanılabilecek aşağı akış değerlendirmeleri sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri Cincinnati Çocuk Tıp Merkezi'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygundu. CGS paradigması sırasında da dahil olmak üzere farelere her zaman standart kemirgen chow ve suya ad libitum erişimi sağlanmıştır. Fareler, aksi belirtilmedikçe (yani bir gecede ışıklara maruz kalma) 14 saat/10 saat açık-karanlık bir döngüde (06:00'da ışıklar) barındırıldı.
1. Zamanlanmış çiftleşmelere hazırlık
- Zamanlanmış çiftleşmeleri ayarlamadan en az 2 hafta önce, yetişkin dişi fareleri standart bir fare kafesinde (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), kafes başına dört farede bir araya getirin. Her dişi fareyi bir kulak etiketi aracılığıyla belirli bir kimlik numarasıyla etiketleyin.
NOT: Bu protokol için önceden hamileliği olmayan ve 3 ila 6 ay arasında olan C57BL6 dişi fareler kullanılmıştır. - Zamanlanmış çiftleşmeleri ayarlamadan en az 1 hafta önce, çiftleşme için kullanılacak yetişkin erkek fareleri ayrı ayrı barındırın.
2. Zamanlanmış çiftleşmeleri ayarlama
- Zamanlanmış çiftleşmeleri saat 18:00'de kurun. İki dişi fare alın ve onları ayrı ayrı yerleştirilmiş bir erkek fare tutan bir kafese yerleştirin. Zamanlanmış çiftleşmeleri ertesi sabah saat 08:00'e kadar ayırın.
3. Gebelik günü 0.5 (G0.5) olarak belirlenen koah fişinin kontrol edilmesi
- Zamanlanmış çiftleşmeleri ayırdıktan hemen sonra, dişi farelerde bir çiftleşme fişi olup olmadığını kontrol edin. Bir copulatory fişinin varlığı G0.5'i işaretleyecektir. Farenin tel ızgarayı kafesin içinde tutmasına izin verin ve vajinal açıklığı görselleştirmek için kuyruğundan hafifçe kaldırın.
NOT: Koah fişinin varlığı cinsel aktivitenin gerçekleştiğini gösterir, ancak hamileliği garanti etmez. Gerekli deneysel fare sayısını hesaplamaya çalışırken, farelerin% 50'sinin süreli çiftleşmelerden ve% 60-% 70'lik bir insidansı tıkamak için bir hamilelikten takılmasını bekleyin. - Bir koah fişinin varlığını tanımlamak için basit görsel muayene kullanın (vajinal açıklıktan hafifçe çıkıntılı veya opak beyazımsı sertleştirilmiş bir kütle). Koah tıkacı basit bir görsel muayene ile kolayca tanımlanmazsa, vajinal açıklığa hafifçe künt bir uç probu yerleştirin. Prob takılma direnci ile vajinanın daha gerisinde bulunan tıkaçları tanımlayın.
- Dişi fareleri copulatory fişlerle ayırın ve standart fare kafeslerinde grup evi, kafes başına 3 ila 4 fare.
4. CGS paradigması için hazırlık
- G5.5'te iki gruba çift koah tıkalı dişi fareleri barındıran kafesleri rastgele atayın: Kontrol ve CGS grubu. Kafesleri grup başına yaklaşık eşit sayıda fareye sahip olacak şekilde rastgeleleştirmeye çalış. Fareleri standart fare kafeslerini temizlemek ve "rahatsız etmeyin" işaretiyle etiketlemek için aktarın. Bu kafesleri farelerin her stresörün sonuna yerleştirmesi için "ev kafesleri" olarak belirleyin.
- CGS paradigmasını gerçekleştirmek için fare tesisinde ayrı bir oda belirleyin. G6.5'ten G17.5'e kadar uzanan 11 günlük bir stresör rejimi tasarlayın, 7 günlük stresörlerin her birini [yabancı nesnelere (mermerler veya legolar), yırtıcı kokuya maruz kalma (kirli fare yatakları), 30 ° kafes eğimi, sık sık yatak değiştirme, yatak kaldırma, çalkalayıcı üzerinde hareket] günde iki kez kullanmak ve 3 gece stresörünün her birini kullanmak için (gece ışıkları açık, kafes eşi değişimi, ıslak yataklara maruz kalma) rastgele bir şekilde bir gecede. Aşağıda açıklanan deneylerin olası bir örnek zamanlaması ve şeması için bkz.
NOT: Her gün stresör farelerin ışık döngüsüne (06:00 h-20:00 saat üzerindeki ışıklar) ve son 2 saat içinde, stresörler arasında en az 2 saat mola ile düşmelidir. Her gece stresör karanlık döngünün başına kurulmalı (ışıklar 20:00 sa kapalı) ve ışık döngüsünün başlangıcında ayrılmalıdır (ışıklar 06:00 saat).
5. CGS paradigmasının gerçekleştirilmesi
- CGS paradigması için belirlenen odada filtrelenmiş üst ve su şişesi bulunan standart bir statik kafeste özel stresörler kurun. Rastgeleleştirme sırasında CGS'ye tabi tutulmak üzere belirlenen fare kafeslerinin sayısına bağlı olarak deney için gereken statik kafes sayısını hazırlayın. Her stresöre başlamadan önce, CGS grubunun fare kafeslerini muhafaza odasından CGS odasına aktarın.
NOT: Farelerin ev kafesinden deneysel kafese ve laminer akış davlumbazlarına geri gönderilmesini gerçekleştirin. - Aşağıdaki stresörleri önceden tasarlanmış rejime göre uygulayın (adım 4.2'ye bakın).
- Yabancı nesnelere (mermerler veya legolar) maruz kalma: Fare yuvalarını dahil etmeden, fare yatakları ile rastgele temiz statik bir kafese rastgele dağılmış altı mermer (14 mm çapında) veya altı lego (farklı şekiller, yüksekliği 4 cm'yi geçmemek üzere) yerleştirin. Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte 2 saat boyunca yabancı nesnelerle statik kafese yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
NOT: Kullandıktan sonra yabancı nesneleri temizleyin. - Yırtıcı kokuya maruz kalma (kirli sıçan yatakları): Dişi sıçanlardan taze kirli sıçan yataklarının derinliğinde, fare yuvalarını dahil etmeden, fare yatağı olmayan temiz statik bir kafese yerleştirin. Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte 2 saat boyunca kirli sıçan yatakları ile statik kafese yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- 30° kafes eğimi: Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte fare yuvalarını dahil etmeden fare yatakları ile temiz statik bir kafese yerleştirin. Kafesi 30° olarak duvara doğru 2 saat boyunca eğin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- Yatak takımlarının sık sık değiştirilmesi: Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte fare yuvalarını dahil etmeden fare yatakları ile temiz statik bir kafese yerleştirin. Fare yataklarını 2 saat boyunca her 10 dakikada bir temiz fare yataklarıyla değiştirin. Fare yatakları değişiklikleri sırasında, farelerle doğrudan teması önlemek için fareleri yavaşça farklı bir temiz kafese yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- Yatak kaldırma: Fareleri ev kafesi meslektaşlarıyla birlikte 2 saat boyunca boş bir temiz statik kafese (fare yatağı veya yuvacığı olmadan) yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- Çalkalayıcı üzerinde hareket: Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte fare yuvalarını dahil etmeden fare yatakları ile temiz bir statik kafese yerleştirin. Statik kafesi, 2 saat boyunca dakikada 140 vuruşa ayarlanmış karşılıklı bir laboratuvar çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- Işıklara gece boyunca maruz kalma: Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte fare yuvalarını dahil etmeden fare yatakları ile temiz bir statik kafese yerleştirin. Karanlık döngüye müdahale etmek için ışıkları gece boyunca (20:00 s-06:00 saat) açık tutun. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- Kafes montaj ilişkisi değişikliği: Fareyi, iki dişi fareden oluşan farklı bir grup tarafından barındırılan fare yatakları ile temiz bir statik kafese aktarın (bozulmamış dişiler tedavi veya kontrol grubunun bir parçası değildir). Fareyi bir gecede yabancı kafes eşleriyle statik kafeste tutun. Stresin sonunda fareyi belirli ev kafesi meslektaşlarıyla ev kafesine geri döndürün.
- Islak yataklara maruz kalma: Statik kafesi fare yatağı ile yataklar suya doyuluna kadar 24 °C'de tutulan temiz suyla doldurun. Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte bir gecede ıslak yataklarla statik kafese yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- Yabancı nesnelere (mermerler veya legolar) maruz kalma: Fare yuvalarını dahil etmeden, fare yatakları ile rastgele temiz statik bir kafese rastgele dağılmış altı mermer (14 mm çapında) veya altı lego (farklı şekiller, yüksekliği 4 cm'yi geçmemek üzere) yerleştirin. Fareleri ev kafes meslektaşlarıyla birlikte 2 saat boyunca yabancı nesnelerle statik kafese yerleştirin. Fareleri, stresörün sonunda aynı meslektaşlarıyla ev kafeslerine geri döndürün.
- CGS paradigması sırasında, kontrol farelerini konut odasındaki ev kafeslerinde rahatsız edilmeden tutun.
- Kullanılmış ev kafeslerini G10.5'te yeni ev kafesleriyle değiştirin. G17.5'te, gecelik stresörün sonunda, parturition ve aşağı akış fonksiyonel değerlendirmelerine hazırlanmak için tüm deneysel fareleri tek haneye koyun.
6. CGS paradigması sırasında deneysel farelerin izlenmesi
- Gece stresörleri dışında, stresör uygulaması sırasında fareleri her 1 saat izleyin.
- Yaralar, uyuşukluk veya herhangi bir fiziksel anormallik de dahil olmak üzere tehlike belirtileri gösteren fareleri deneyden hariç tutun. Gerektiğinde veteriner personeliyle iletişime geçin.
7. Deneysel farelerde gebelik sırasında vücut ağırlığı kazancının yüzdesini ölçmek (isteğe bağlı)
- G6.5'te, stresörlere maruz kalmadan önce fareleri ayrı ayrı tartın. G17.5'te, gecelik stresörün sonunda, fareleri ayrı ayrı tartın. Kontrol farelerini eşdeğer gebelik zaman noktalarında tartın.
- CGS paradigmasının (G6.5) ilk gününün ağırlığını% 100 olarak ayarlayarak gebelik sırasında vücut ağırlığı kazancının yüzdesini ölçün.
8. Deneysel farelerde doğum sonrası göreli adrenal bez ağırlıklarının ölçülmesi (isteğe bağlı)
- Doğum sonrası 2. günde (PP2), kontrolü ve CGS barajlarını ayrı ayrı tartın. Barajları karbondioksit soluma ile ötenazi ve ardından duman kaputunda servikal çıkık.
- Fareleri bir diseksiyon plakasına yerleştirin, karın bölgesini% 70 etanol ile sterilize edin ve dikey bir kesim yapmak için makas kullanarak karın boşluğunu açın. Böbreklerin ön kutbuna bitişik bulunan böbrek üstü bezlerini iki taraflı olarak ön direk ile izole edin. Adrenal bezleri çevreleyen yağ dokusunu, bir diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice parçalara ayrıştırın.
- bilateral adrenal bezleri ayrı ayrı tartın. Göreli adrenal bez ağırlıklarını gram başına miligram olarak hesaplayın (sağın toplam ağırlığı ve sol adrenal bezler / vücut ağırlığı).
9. Deneysel farelerde doğum sonrası hipotalamik hipotalamik adrenal (HPA) eksen aktivitesinin ölçülmesi (isteğe bağlı)
- HPA eksen ölçümlerine hazırlık için, doğum sonrası 0 (PP0) günde çöp başına 6 yavruya ötenazi yapın. İkincil ötanazi yöntemi olarak karbondioksit soluma, ardından cerrahi makasla kafa kesme kullanın.
- Doğum sonrası 2. günde (PP2), kontrolü ve CGS barajlarını iyi havalandırılmış 50 mL polipropilen konik bir tüp içinde 20 dakika boyunca ayrı ayrı dizginlayın. Kısıtlama stresinden hemen sonra, fareyi konik tüpten çıkarın ve gevşek cildi omuzların üzerinde ve arkasını kulaklara tutarak, cildin mandibula gergin üzerinde olması için fareyi baskın olmayan elle zaptedin.
- Altidibüler damarı, mandibulanın biraz arkasında bir mızrakla delin, ancak kulak kanalına ön. Serum ayırıcı tüpte 100 μL'ye kadar anne kanı toplayın. Numune toplamadan sonra, kanamayı durdurmak için delinme bölgesine gazlı bezle hafif basınç uygulayın. Kanama durduğunda barajları ev kafesine geri verin.
- Serum ayırıcı tüpünü 6 dakika boyunca 21.130 x g'da santrifüj edin ve serumu dikkatlice çıkarın. Serumu daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın. Serum kortikosteron konsantrasyonu, üreticinin protokolünü takiben bir ELISA kiti ile ölçün.
10. Deneysel farelerde doğum sonrası davranış değişikliklerinin ölçülmesi (isteğe bağlı)
- Davranış analizine hazırlanmak için, PP0'de çöp başına 6 yavruya çöp itlaf edin.
- PP2'den PP5'e anne bakımı parçalanmasının analizini yapın. Her gün, ışık döngüsü sırasında, anne davranışını 30 dakikalık bir süre boyunca videoya çekmeden önce barajları 5 dakikalık bir alışkanlık süresi boyunca test odasına maruz bırakır.
- Bireysel yalama/tımar bout'unun ortalama uzunluğunu ve barajlar tarafından gerçekleştirilen toplam bouts sayısını ölçerek anne bakımı parçalanmasını değerlendirin19.
NOT: Yalama/tımar davranışı, barajın yavrunun vücuduyla diliyle temas ettiği veya yavrunun baraj tarafından atalarıyla ele alındığı bir davranış olarak tanımlanır. Bir maç, barajın yavrularını yalama / tımar etme ile meşgul olduğu kesintisiz bir zaman dilimi olarak tanımlanır.
- Bireysel yalama/tımar bout'unun ortalama uzunluğunu ve barajlar tarafından gerçekleştirilen toplam bouts sayısını ölçerek anne bakımı parçalanmasını değerlendirin19.
- PP0'den PP6'ya sakkaroz tercih testi (SPT) ile anhedonia analizi yapın. Barajları ev kafeslerinde bir adet 100 mL temiz su şişesi ve %4 sakkaroz çözeltisinin bir adet 100 mL'lik şişesine maruz bırakın. Günlük tüketilen su ve sakkaroz miktarını (mL olarak) ölçün. Şişe yerleşimini ev kafesinde değiştir. Son 4 günün ortalamalarını kullanarak sakkaroz tercihini hesaplayın: tercih % = [(sakkaroz tüketimi / sakkaroz + su tüketimi) x 100].
- PP8'de yükseltilmiş sıfır labirent (EZM) aracılığıyla anksiyete benzeri davranışların analizini gerçekleştirin. Barajları, zeminden yükseltilmiş iki kapalı kadran ve iki açık kadrandan oluşan EZM aparatına ayrı ayrı yerleştirin. Barajların labirenti 5 dakika boyunca bozulmadan keşfetmesine izin verin. Açık kadranda harcanan süreyi ve açık kadranlara giriş sayısını ölçün.
11. Doğum sonrası yavru ağırlık değişikliklerinin ölçülmesi (isteğe bağlı)
- Yavru ağırlık analizine hazırlanmak için, doğum gününde çöp başına 6 yavruya (doğum sonrası 0, PN0) yavru itlaf edin.
- Doğum sonrası dönemde PN0'da ve farklı zaman noktalarında yavruların ağırlığını kaydedin (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hamile dişi farelerin CGS'ye maruz kalması, hamilelik sırasında vücut ağırlığı artışında azalma (Şekil 2A) ve doğum sonrası erken dönemde böbrek üstü bezi ağırlıklarının artması da dahil olmak üzere kronik stresle ilgili parametrelerde değişikliklere neden olur (Şekil 2B)19. Daha da önemlisi, CGS'ye maruz kalmak maternal nöroendokrin fonksiyonda doğum sonrası anormalliklerle sonuçlanır. CGS barajları, yeni bir akut hakaretin uygulanmasını takiben artan serum kortikosteron seviyelerinin kanıt ettiği gibi hiperaktif bir HPA ekseni sergiler (Şekil 3)19.
Hamile dişi farelerin CGS'ye maruz kalması, erken doğum sonrası dönemde depresif benzeri bir fenotipin ortaya çıkışını yansıtan davranışsal anormalliklerle daha da sonuçlanır. CGS barajları, yavrular tarafından alınan anne sinyallerinin parçalanma derecesindeki artışa yansıdığı için anne bakımında değişiklikler gösterir. Ortalama yalama/tımar nöbetleri süresi azalır ve CGS'yi takip eden ortalama bout sayısındaki artışla ilişkilidir, bu da çok sayıda kısa yetiştirme davranışı bölümünü gösterir (Şekil 4A,B)19. Sakkaroz tercihi, kontrol barajlarına kıyasla CGS barajlarında da depresiftir, bu da anhedonia varlığını düşündürmektedir (Şekil 4C)19. Son olarak, CGS barajları, kontrol barajlarına kıyasla EZM'nin açık kadranlarında harcanan sürede bir azalma ile ölçüldüğünde kaygı ile ilgili davranışların arttığını da gösterir (Şekil 4D)19.
Yavrularda, doğumda herhangi bir değişiklik gözlenmse de, doğum sonrası dönemde, doğum sonrası 7'den 21'e kadar kilo alımının azalmasına neden olur. Vücut ağırlığı alımındaki bu azalma her iki cinsiyetin yavrularında da mevcuttur (Şekil 5)19. Not olarak, CGS paradigmasının gebelik uzunluğu, çöp boyutu veya çöp başına cinsiyet oranı üzerinde herhangi bir etkisi olmadı (veriler gösterilmedi)19.
Şekil 1: CGS paradigmasının şeması ve doğrulama için fonksiyonel değerlendirmeler. Bu rakam Zoubovsky, S.P. ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CGS maruziyetini takiben barajlardaki kronik strese bağlı parametrelerdeki değişiklikler. (A) Vücut ağırlığı G6.5-G17.5, Kontrol = 17, CGS = 17'den değişir. (B) PP2' de göreli maternal adrenal bez ağırlıkları, Kontrol = 20, CGS = 15. Ortalama + SEM olarak sunulan veriler *p < 0.05, ****p < 0.0001. Bu rakam Zoubovsky, S.P. ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CGS maruziyeti sonrasında Maternal HPA ekseni ölçümleri. PP2, Control = 8, CGS = 5'te 20 dakikalık kısıtlama stresinden sonra ölçülen maternal serum kortikosteron düzeyleri. Ortalama + SEM olarak sunulan veriler *p < 0,05. Bu rakam Zoubovsky, S.P. ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CGS maruziyetini takip eden barajlarda doğum sonrası erken dönemde davranış değişiklikleri. (A) Ortalama süre ve (B) PP2-PP5, Kontrol = 17, CGS = 17'den kaydedilen yalama/tımar nöbetlerinin sayısı. (C) SPT, Control = 17, CGS = 19'da yüzde sakkaroz tercihi. (D) 5 dakikalık süre boyunca EZM'nin açık çeyreğinde harcanan toplam süre, Kontrol = 17, CGS = 19. Ortalama + SEM *p olarak sunulan veriler 0,05 <*** p < 0,01. Bu rakam Zoubovsky, S.P. ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: CGS'ye rahim içi maruziyeti takiben doğum sonrası gelişim sırasında yavru vücut ağırlığındaki değişiklikler. PN0'dan PN21'e kadar ölçülen yavru vücut ağırlığı, Kontrol = 17 çöp, CGS = 17 çöp. Ortalama + SEM olarak sunulan veriler *p < 0.05, ****p < 0.0001. Bu rakam Zoubovsky, S.P. ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hamile fareleri CGS perturbs postpartum maternal nöroendokrin fonksiyonuna maruz bırakma, yeni stresörlere HPA ekseni yanıtı da dahil olmak üzere ve perinatal ruh hali ve anksiyete bozuklukları ile ilgili çeşitli davranışsal anormalliklerle ilişkilidir. Modelin bir çevresel risk faktörünün kullanımını kullandığı göz önüne alındığında, genetik modellerde başka türlü gözlenenden daha yüksek fenotipik varyasyon beklenmektedir22. Bununla birlikte, CGS paradigmasının uygulanmasından elde edilen sonuçlar, sonuçları şaşırtabilecek değişkenleri en aza indirmeye özen gösterilirse araştırma laboratuvarlarında tutarlı olabilir.
Protokoldeki kritik adımlar arasında CGS farelerinden ayrı konut kontrol fareleri ve süreli çiftleşme adımları da dahil olmak üzere genel hayvancılık uygulamalarıyla ilgili adımlar yer alıyor. Ortak konut kontrolü ve CGS fareleri kendi başına kontrol grubu için stresli bir uyarıcı olabilir ve bu nedenle nöroendokrin veya davranışsal sonuçları şaşırtabilir23,24. Aynı şekilde, tedarikçiden gönderilen hamile farelerle deneylerin başlatılması önerilmez. Zamanlanmış çiftleşmelerin verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, yetişkin dişi fareleri östrus döngülerini senkronize etmek için zamanlanmış çiftleşmeleri ayarlamadan en az 2 hafta önce bir araya getirmek önerilir. Aynı şekilde, cinsel olarak deneyimli yetişkin erkek fareler kullanmak ve erkeklerin zamanlanmış çiftleşmeleri kurmadan en az 1 hafta önce çiftleşmelerini önlemek doğurganlıklarını en üst düzeye çıkaracak ve başarılı gebelik potansiyelini artıracaktır. CGS paradigmasının zaman çizelgesi de dikkatle takip edilmelidir. Gebelikte değişen yoğunluktaki bu stresörlerin çok erken uygulanması uterus desidulanizasyonunu etkileyebilir ve embriyo implantasyonunu engelleyebilir25. Farklı gebelik süresi pencerelerinde strese maruz kalmanın, erkek yavruların erken gebelik sırasında stresörlere karşı dişi yavrulardan önemli ölçüde daha savunmasız olduğu yavrular için cinsiyete özgü değişen nörogelişimsel hastalık riski taşıdığı bulunmuştur26,27. CGS programı, adaptasyon mekanizmalarının gelişimini ve genellikle öngörülebilir stresörlere tekrar tekrar maruz kalma ile ilişkili alışmayı önlemek için öngörülemezlik sağlayacak şekilde tasarlanmalıdır28. Son olarak, tüm barajlarda karşılaştırılabilir koşulları sağlamak ve çöp boyutu değişkenliklerinin annelik hormonunu veya davranış analizini şaşırtmasını önlemek için yavrular doğum gününde altı yavruya itlaf edilmelidir. Aynı şekilde, kısıtlama stresinin ve submandibuler kanamaların davranış üzerindeki şaşırtıcı etkilerini en aza indirmek için nöroendokrin ve davranışsal değerlendirmeler için farklı kohortlar istihdam edilmelidir. Yavrularla anne etkileşiminin bozulmasını en aza indirmek için anne bakımı değerlendirmesi ve diğer davranış parametrelerinin analizi için farklı kohortlar da kullanılmalıdır.
Geçerli iletişim kuralında çeşitli sınırlamalar vardır. CGS paradigmasının başlamasından önce hamile farelerin sayısını doğru bir şekilde tahmin edememe, önemli bir finansal ve hayvan kullanım yükü oluşturabilir. Hem çiftleşmenin hem de yumurtlamanın tipik olarak gerçekleştiği östrus aşamasında fareleri tanımlamak için vajinal sitolojinin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere zamanlanmış çiftleşmelerle daha öngörülebilir bir başarı elde etmek için protokolde değişiklikleryapılabilir. Farelerin ultrasonografik incelemesi, gebelik30'unçok erken aşamalarından gebelikleri doğru bir şekilde tanımlamak için alternatif bir non-invaziv teknik olarak CGS paradigmasına da dahil edilebilir. Artan yağ içeriğine sahip özel damızlık chow kullanımı, çiftleşme başarısını artırmak için diğer gruplar tarafından da kullanılmıştır31. Bununla birlikte, diyette değişiklik yaparken dikkatli olunmalıdır, bunun anne stres reaktivitesini ve davranışını etkileyebileceği göz önüne alındığında32. Ek olarak, mevcut protokolün vahşi tip C57BL / 6 farelerde etkili olduğu gösterilmiştir, ancak stres duyarlılığı, anne bakımı ve duygusal düzenlemede büyük farklılıklar gösterebilecekleri için farklı suşlar veya genetik geçmişler ve türler için protokolün değiştirilmesi gerekebilir.
Mevcut peripartum stres modelleriyle karşılaştırıldığında, CGS paradigması, anne bakımında, anhedonia ve anksiyetede gelişmiş anne stres reaktivitesi ve doğum sonrası anormallikler de dahil olmak üzere gözlenen hastalıkla ilgili endofenotipler göz önüne alındığında çevirisel olarak daha alakalı olduğunu kanıtlamaktadır. Bu değişiklikler perinatal ruh hali ve anksiyete bozuklukları ile ilişkili klinik bulguları yeniden özetler gibi görünmektedir. Bu modelin gelecekteki uygulamaları, anne psikososyal stresinin yavru beyin gelişimi ve hastalık duyarlılığı üzerindeki cinsiyete özgü etkilerini tanımlamak için CGS paradigmasının kullanılmasını içerir. CGS'nin plasental fonksiyon üzerindeki etkilerinin incelenmesi, anahtar plasental fonksiyonlardaki disfonksiyonun fetal beyin gelişimini etkilediği gösterilmiştir33. CGS paradigması ile çapraz koruyucu deneylerin dahililmesi, yavruların duygusal gelişimini şekillendirmede beslenme davranışındaki doğum sonrası anormalliklere karşı utero CGS maruziyeti ve ilişkili maternal hormonal milieu değişikliklerinin bireysel katkılarının anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü T32 GM063483-14 hibesi ve Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı'ndan destek almak istememektedir. Zoubovsky ve ark., 2019'dan uyarlanan veriler için Creative Common License aşağıdaki konumda bulunabilir: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
