Summary
Das Paradigma des chronischen psychosozialen Stresses (CGS) verwendet klinisch relevante Stressoren während der Schwangerschaft bei Mäusen, um psychiatrische Störungen von Müttern und Säuglingen zu modellieren. Hier bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Anwendung des CGS-Paradigmas und nachgelagerter Bewertungen, um dieses Modell zu validieren.
Abstract
Die peripartale Periode gilt als sensible Periode, in der nachteilige mütterliche Expositionen zu langfristigen negativen Folgen für Mutter und Nachkommen führen können, einschließlich der Entwicklung neuropsychiatrischer Störungen. Risikofaktoren, die mit dem Auftreten einer affektiven Dysregulation in der Mutter-Kind-Dyade verbunden sind, wurden umfassend untersucht. Die Exposition gegenüber psychosozialem Stress während der Schwangerschaft hat sich durchweg als einer der stärksten Prädiktoren herausgestellt. Mehrere Nagetiermodelle wurden erstellt, um diese Assoziation zu untersuchen; Diese Modelle beruhen jedoch auf der Verwendung von physischen Stressoren oder einer begrenzten Anzahl von psychosozialen Stressoren, die sich wiederholen, die die Art, Intensität und Häufigkeit von Stressoren, die von Frauen erlebt werden, nicht genau erfassen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Paradigma des chronischen psychosozialen Stresses (CGS) generiert, das verschiedene psychosoziale Beleidigungen unterschiedlicher Intensität verwendet, die auf unvorhersehbare Weise präsentiert werden. Das Manuskript beschreibt dieses neuartige CGS-Paradigma, bei dem schwangere weibliche Mäuse vom Schwangerschaftstag 6,5 bis 17,5 tagsüber und über Nacht verschiedenen Stressoren ausgesetzt sind. Tagesstressoren, zwei pro Tag durch eine 2- h-Pause getrennt, reichen von der Exposition gegenüber Fremdkörpern oder Raubtiergeruch bis hin zu häufigen Änderungen der Bettwäsche, Entfernung von Bettwäsche und Käfigneigung. Zu den Stressfaktoren über Nacht gehören kontinuierliche Lichteinwirkung, wechselnde Käfigkameraden oder Benetzung von Bettwäsche. Wir haben bereits gezeigt, dass die Exposition gegenüber CGS zur Entwicklung von mütterlichen neuroendokrinen und Verhaltensanomalien führt, einschließlich erhöhter Stressreaktivität, der Entstehung fragmentierter mütterlicher Pflegemuster, Anhedonie und angstbedingtem Verhalten, Kernmerkmalen von Frauen, die an perinataler Stimmung und Angststörungen leiden. Dieses CGS-Modell wird daher zu einem einzigartigen Werkzeug, das verwendet werden kann, um molekulare Defekte aufzuklären, die der mütterlichen affektiven Dysregulation zugrunde liegen, sowie transplazentale Mechanismen, die die fetale Neuroentwicklung beeinflussen und zu negativen langfristigen Verhaltensfolgen bei den Nachkommen führen.
Introduction
Die Mechanismen, die einer erhöhten Anfälligkeit für neuropsychiatrische Störungen bei Müttern und Säuglingen nach nachteiligen mütterlichen Expositionen in der peripartalen Periode zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt. Während der Schwangerschaft und des Übergangs in die postpartale Periode treten erhebliche mütterliche physiologische Veränderungen auf, einschließlich mehrerer neuroendokriner Anpassungen, von denen angenommen wird, dass sie nicht nur für die Neuroentwicklung gesunder Nachkommen, sondern auch für die Erhaltung der psychischen Gesundheit der Mutter von entscheidender Bedeutung sind1,2. Auf der Ebene der mütterlichen Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) werden Anpassungen sowohl in der zirkadianen als auch in der stressinduzierten Glukokortikoidfreisetzung beobachtet, einschließlich eines abgeflachten Rhythmus der tagaktiven HPA-Achsenaktivität und einer gedämpften HPA-Achsenreaktion auf akute Stressoren3,4,5. Angesichts der Tatsache, dass eine erhöhte HPA-Achsenaktivität bei einer Untergruppe von Frauen mit postpartaler affektiver Dysregulation berichtet wird, einschließlich erhöhter Konzentrationen zirkulierender Glukokortikoide und gehemmtem negativem Feedback6,7,8, wird angenommen, dass die Exposition gegenüber Stressoren, die zu einer erhöhten postpartalen Stressreaktivität führen und mütterliche HPA-Achsenanpassungen verhindern, die Anfälligkeit für neuropsychiatrische Störungen erhöhen.
Um die Auswirkungen von Stress auf die affektive Dysregulation bei Müttern und Säuglingen aufzuklären, wurden mehrere Nagetiermodelle von Stress in der peripartalen Periode erstellt. Die meisten dieser Modelle sind durch die Anwendung von physischen Stressoren gekennzeichnet, die zu homöostatischen Herausforderungen und Veränderungen des physiologischen Status des Muttertiers9führen, wie chronischer Zurückhaltungsstress10 und Schwimmstress während derSchwangerschaft 11oder postpartale Schockexposition12. Obwohl gezeigt wurde, dass diese Paradigmen zur Entstehung von postpartalen depressiven Verhaltensweisen und Veränderungen in der mütterlichen Pflegeführen 10,11,12, wurden sie durch ihre Unfähigkeit, die psychosoziale Natur von Stressoren, die häufig von menschlichen Müttern erlebt werden, genau zu erfassen, eingeschränkt. Dies wird besonders wichtig, wenn versucht wird, die neuroendokrinen Folgen von chronischem Stress in der peripartalen Periode aufzudecken, da angenommen wird, dass die Verarbeitung verschiedener Arten von Stressoren durch unterschiedliche neuronale Netze vermittelt wird, die die HPA-Achsenaktivierung orchestrieren9.
Um diese Einschränkung zu überwinden, haben mehrere Gruppen Stressparadigmen entwickelt, die psychosoziale Beleidigungen oder eine Kombination aus physischen und psychosozialen Stressoren verwenden. Das mütterliche Trennungsmodell, bei dem Muttertiere während der postpartalen Periode13 , 14für mehrere Stunden pro Tag von ihren Welpen getrenntwerden,und das chronische soziale Stressmodell, bei dem die Muttertiere in Gegenwart ihrerWürfe 15 , 16 einemmännlichen Eindringling ausgesetztsind,konnten das Auftreten von Anomalien in der mütterlichen Pflege und depressiven Phänotypen im Zusammenhang mit physischen Stressparadigmen reproduzieren. Das Paradigma des chronischen Ultramild-Stresses, bei dem schwangere weibliche Mäuse einer Vielzahl von psychosozialen Beleidigungen ausgesetzt sind, einschließlich Käfigneigung und Beleuchtung über Nacht, sowie erheblichen physiologischen Beleidigungen wie Zurückhaltungsstress und Nahrungseinschränkung, hat weiter gezeigt, dass die Exposition gegenüber einer gemischten Natur von Stressoren zu Anomalien im mütterlichen Verhalten führt, einschließlich Beeinträchtigungen der mütterlichen Aggression. sowie Dysregulation in der circadianen Aktivität der HPA-Achse17,18. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen führt ein alternierendes Zurückhaltungsstress- und Überfüllungsmodell während der Schwangerschaft zu Erhöhungen des postpartalen mütterlichen zirkadianen Corticosteronspiegels sowie zu Veränderungen in der mütterlichen Versorgung, obwohl keine Unterschiede in der HPA-Achsenreaktivität nach postpartaler Exposition gegenüber neuartigen akuten Beleidigungen beobachtet werden1.
Eine Erweiterung dieser Arbeit, die ein Schwangerschaftsstressparadigma erzeugt, das mehrere psychosoziale Beleidigungen verwendet, die auf unvorhersehbare Weise präsentiert werden, und den Einsatz physiologischer Stressoren minimiert. Studien haben bereits gezeigt, dass dieses chronische psychosoziale Stressparadigma (CGS) zur Entwicklung einer dysfunktionalen mütterlichen HPA-Achse führt, einschließlich einer erhöhten Stressreaktivität in der frühen postpartalen Periode19. Diese Veränderungen sind mit Anomalien im mütterlichen Verhalten verbunden, einschließlich Veränderungen in der Qualität der mütterlichen Versorgung, die von Welpen erhalten werden, und das Auftreten von anhedonischen und angstähnlichen Verhaltensweisen19, Merkmale, die mit perinataler Stimmung und Angststörungen übereinstimmen20,21. Darüber hinaus nimmt die Gewichtszunahme der Nachkommen während der postnatalen Periode nach der In-utero-Exposition gegenüber CGS19ab, was darauf hindeutet, dass CGS in zukünftigen Generationen anhaltende negative Programmeffekte haben kann.
Ziel bei der Entwicklung des CGS-Paradigmas war es, in erster Linie klinisch relevante Stressoren zu verwenden, die die Art, Intensität und Häufigkeit von Beleidigungen, die oft mit neuroendokriner Dysregulation und der Entwicklung von perinatalen Stimmungs- und Angststörungen verbunden sind, genau erfassen. Hier bietet die Studie ein detailliertes Protokoll, wie schwangere weibliche Mäuse CGS unterzogen werden können, sowie nachgelagerte Bewertungen, mit denen die Gültigkeit des Modells getestet werden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee am Cincinnati Children's Medical Center genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health. Ad libitum Zugang zu Standard-Nagetier-Chow und Wasser wurde den Mäusen zu jeder Zeit zur Verfügung gestellt, auch während des CGS-Paradigmas. Mäuse wurden in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h / 10 h (Lichter um 06:00 Uhr) untergebracht, sofern nicht anders angegeben (d. H. Exposition gegenüber Lichtern über Nacht).
1. Vorbereitung auf zeitaufgenommene Paarungen
- Mindestens 2 Wochen vor der Einrichtung der zeitlichen Paarung werden die erwachsenen weiblichen Mäuse zusammen in einem Standard-Mauskäfig (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm) untergebracht, vier Mäuse pro Käfig. Beschriften Sie jede weibliche Maus über eine Ohrmarke mit einer bestimmten ID-Nummer.
HINWEIS: C57BL6 weibliche Mäuse ohne vorherige Schwangerschaft und im Alter zwischen 3 und 6 Monaten wurden für dieses Protokoll verwendet. - Mindestens 1 Woche vor der Einrichtung von zeitlich abgestimmten Paarungen die erwachsenen männlichen Mäuse einzeln beherbergen, die für die Paarung verwendet werden sollen.
2. Einrichten von zeit zeitigen Paarungen
- Richten Sie die zeitierten Paarungen um 18:00 Uhr ein. Nehmen Sie zwei weibliche Mäuse und legen Sie sie in einen Käfig, in dem sich eine einzeln untergebrachte männliche Maus befindet. Trennen Sie die zeitgemessierten Paarungen am nächsten Morgen um 08:00 Uhr.
3. Überprüfung des Kopulationspfropfens, der als Schwangerschaftstag 0,5 (G0,5) bezeichnet wird
- Überprüfen Sie unmittelbar nach dem Trennen der zeitlich angeordneten Paarungen das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens bei den weiblichen Mäusen. Das Vorhandensein eines Kopulationssteckers markiert G0,5. Lassen Sie die Maus das Drahtgitter im Käfig halten und heben Sie es vorsichtig am Schwanz an, um die Vaginalöffnung zu visualisieren.
HINWEIS: Das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens weist darauf hin, dass sexuelle Aktivität stattgefunden hat, garantiert jedoch keine Schwangerschaft. Wenn Sie versuchen, die Anzahl der benötigten experimentellen Mäuse zu berechnen, erwarten Sie, dass 50% der Mäuse von zeitgesteuerten Paarungen und einer Schwangerschaft verstopft werden, um eine Inzidenz von 60% -70% zu erreichen. - Verwenden Sie eine einfache visuelle Untersuchung, um das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens (eine undurchsichtige weißlich gehärtete Masse innerhalb oder leicht aus der Vaginalöffnung herausragend) zu identifizieren. Wenn der Kopulationsstopfen durch einfache visuelle Untersuchung nicht leicht zu identifizieren ist, führen Sie vorsichtig eine stumpfe Endsonde in die Vaginalöffnung ein. Identifizieren Sie die Pfropfen, die sich weiter hinten in der Vagina befinden, durch den Widerstand des Sondeneinführungs.
- Trennen Sie die weiblichen Mäuse mit Kopulationspfropfen und Gruppenhaus in Standard-Mauskäfigen, 3 bis 4 Mäuse pro Käfig.
4. Vorbereitung auf das CGS-Paradigma
- Weisen Sie Käfige, die weibliche Mäuse mit kopatorischen Plugs beherbergen, nach dem Zufallsprinzip zwei Gruppen auf G5.5 zu: Kontroll- und CGS-Gruppe. Versuchen Sie, Käfige zu randomisieren, um eine ungefähr gleiche Anzahl von Mäusen pro Gruppe zu haben. Übertragen Sie die Mäuse in saubere Standard-Mauskäfige und beschriften Sie sie mit einem "Nicht stören"-Schild. Bezeichnen Sie diese Käfige als "Heimkäfige", damit Mäuse sie am Ende jedes Stressors platzieren können.
- Legen Sie einen separaten Raum in der Mauseinrichtung fest, um das CGS-Paradigma auszuführen. Entwerfen Sie ein 11-tägiges Stressor-Regime, das von G6.5 bis G17.5 reicht, um jeden der 7-Tage-Stressoren [Exposition gegenüber Fremdkörpern (Murmeln oder Legos), Geruchsexposition von Raubtieren (schmutzige Rattenbettwäsche), 30 ° Käfigneigung, häufiger Wechsel der Bettwäsche, Bettungsentfernung, Bewegung auf Shaker] zweimal täglich zu nutzen und jeden der 3 Nachtstressoren (Nachtlichter an, Käfigpartnerwechsel, Exposition gegenüber nasser Einstreu) über Nacht auf zufällige Weise. Einen möglichen Beispielzeitplan und ein Schema der unten beschriebenen Experimente finden Sie in Abbildung 1.
HINWEIS: Jeder Tägliche Stressor sollte in den Lichtzyklus von Mäusen fallen (Lichter an 06:00 h-20:00 h) und 2 h dauern, mit mindestens 2 h Pause zwischen Stressoren. Jeder Nachtstressor sollte zu Beginn des Dunkelzyklus (Licht aus 20:00 Uhr) aufgestellt und zu Beginn des Lichtzyklus getrennt werden (Lichter auf 06:00 Uhr).
5. Ausführen des CGS-Paradigmas
- Richten Sie spezifische Stressoren auf einem statischen Standardkäfig mit gefilterter Oberseite und Wasserflasche in dem Raum ein, der für das CGS-Paradigma vorgesehen ist. Bereiten Sie die Anzahl der statischen Käfige vor, die für das Experiment benötigt werden, abhängig von der Anzahl der Mauskäfige, die während der Randomisierung CGS unterzogen werden sollen. Bevor Sie mit jedem Stressor beginnen, übertragen Sie die Mauskäfige der CGS-Gruppe aus dem Gehäuseraum in den CGS-Raum.
HINWEIS: Führen Sie die Handhabung / Übertragung von Mäusen vom Heimkäfig zum Versuchskäfig und zurück in Laminar-Flow-Hauben durch. - Wenden Sie die folgenden Stressoren gemäß dem vordefinierten Regime an (siehe Schritt 4.2).
- Exposition gegenüber Fremdkörpern (Murmeln oder Legos): Legen Sie sechs Murmeln (14 mm Durchmesser) oder sechs Legos (verschiedene Formen, nicht mehr als 4 cm Höhe) zufällig in einen sauberen statischen Käfig mit Mausbettwäsche, ohne die Maus nestlets einzubeziehen. Legen Sie die Mäuse zusammen mit ihren Heimischen Käfigkollegen für 2 h in den statischen Käfig mit Fremdkörpern. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
HINWEIS: Reinigen Sie die Fremdkörper nach Gebrauch. - Raubtiergeruchsexposition (schmutzige Rattenbettwäsche): 1 cm tief in die Tiefe der frischen schmutzigen Rattenbettwäsche von weiblichen Ratten in einen sauberen statischen Käfig ohne Mausbettwäsche legen, ohne die Mauseinbettungen einzubeziehen. Legen Sie die Mäuse zusammen mit ihren Heimkäfig-Gegenstücken für 2 h in den statischen Käfig mit schmutziger Ratteneinstreu. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- 30° Käfigneigung: Legen Sie die Mäuse mit ihren Heimkäfig-Gegenstücken in einen sauberen statischen Käfig mit Mauseinstreu, ohne die Maus nestlets einzubeziehen. Neigen Sie den Käfig für 2 h um 30° gegen die Wand. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Häufige Bettwechsel: Legen Sie die Mäuse mit ihren Heimkäfig-Gegenstücken in einen sauberen statischen Käfig mit Mauseinstreu, ohne die Maus-Nestlets einzubeziehen. Ersetzen Sie die Mausbettwäsche alle 10 Minuten für 2 Stunden durch saubere Mausbettwäsche. Legen Sie die Mäuse während des Wechsels der Mauseinstreu vorsichtig in einen anderen sauberen Käfig, um einen direkten Kontakt mit den Mäusen zu vermeiden. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Einstreuentfernung: Legen Sie die Mäuse zusammen mit ihren Heimkäfigkollegen für 2 h in einen leeren, sauberen statischen Käfig (ohne Mauseinstreu oder Schmiedungen). Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Bewegung auf Shaker: Legen Sie die Mäuse mit ihren Heimischen Käfig-Gegenstücken in einen sauberen statischen Käfig mit Mausbettung, ohne die Maus-Nestlets einzubeziehen. Stellen Sie den statischen Käfig auf einen reziproken Laborschüttler, der für 2 h auf 140 Hübe pro Minute eingestellt ist. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Nächtliche Lichteinwirkung: Legen Sie die Mäuse mit ihren Heimkäfig-Gegenstücken in einen sauberen statischen Käfig mit Mausbettung, ohne die Maus nestlets einzubeziehen. Lassen Sie die Lichter über Nacht eingeschaltet (20:00 h-06:00 h), um den Dunkelzyklus zu stören. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Käfigpartnerwechsel: Übertragen Sie die Maus in einen sauberen statischen Käfig mit Mausbettwäsche, der von einer anderen Gruppe von zwei weiblichen Mäusen (intakte Weibchen, die nicht Teil der Behandlungs- oder Kontrollgruppe sind) untergebracht wird. Halten Sie die Maus über Nacht im statischen Käfig mit unbekannten Käfigkameraden. Bringen Sie die Maus am Ende des Stressors in ihren Heimkäfig mit ihren spezifischen Heimkäfig-Gegenstücken zurück.
- Exposition gegenüber nasser Einstreu: Füllen Sie den statischen Käfig mit Mausbettwäsche mit sauberem Wasser, das bei 24 °C gehalten wird, bis die Einstreu mit Wasser gesättigt ist. Legen Sie die Mäuse zusammen mit ihren Heimkäfigkollegen über Nacht in den statischen Käfig mit nasser Einstreu. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Exposition gegenüber Fremdkörpern (Murmeln oder Legos): Legen Sie sechs Murmeln (14 mm Durchmesser) oder sechs Legos (verschiedene Formen, nicht mehr als 4 cm Höhe) zufällig in einen sauberen statischen Käfig mit Mausbettwäsche, ohne die Maus nestlets einzubeziehen. Legen Sie die Mäuse zusammen mit ihren Heimischen Käfigkollegen für 2 h in den statischen Käfig mit Fremdkörpern. Bringen Sie die Mäuse am Ende des Stressors mit den gleichen Gegenstücken in ihren Heimkäfig zurück.
- Halten Sie während des CGS-Paradigmas die Kontrollmäuse ungestört in ihren Heimkäfigen im Wohnraum.
- Ersetzen Sie die gebrauchten Heimkäfige durch neue Heimkäfige auf G10.5. Auf G17.5, am Ende des Stressors über Nacht, werden alle versuchsexperimentellen Mäuse einzeln untergebracht, um sich auf die Geburt und die nachgelagerten funktionsbezogenen Bewertungen vorzubereiten.
6. Überwachung der experimentellen Mäuse während des CGS-Paradigmas
- Überwachen Sie die Mäuse alle 1 h während der Stressor-Anwendung, außer während der Stressoren über Nacht.
- Schließen Sie die Mäuse, die Belastungszeichen wie Wunden, Lethargie oder körperliche Anomalien aufweisen, aus dem Experiment aus. Wenden Sie sich bei Bedarf an das tierärztliche Personal.
7. Messung der prozentualen Körpergewichtszunahme während der Schwangerschaft bei den Versuchsmäusen (optional)
- Auf G6.5 die Mäuse einzeln wiegen, bevor Sie Stressoren ausgesetzt werden. Auf G17.5, am Ende des Stressors über Nacht, wiegen Sie die Mäuse einzeln. Wiegen Sie die Kontrollmäuse zu den entsprechenden Gestationszeitpunkten.
- Messen Sie die prozentuale Körpergewichtszunahme während der Schwangerschaft, indem Sie das Gewicht des ersten Tages des CGS-Paradigmas (G6,5) auf 100% festlegen.
8. Messung der postpartalen relativen Nebennierengewichte bei Versuchsmäusen (optional)
- Wiegen Sie am postpartalen Tag 2 (PP2) die Steuerung und die CGS-Dämme einzeln. Euthanisieren Sie die Dämme durch Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von zervikaler Dislokation in einem Abzug.
- Legen Sie die Mäuse auf eine Dissektionsplatte, sterilisieren Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere, um einen vertikalen Schnitt zu machen. Isolieren Sie die Nebennieren, die sich neben dem vorderen Pol der Nieren befinden, mit einer Zinnen bilateral. Sezieren Sie sorgfältig das Fettgewebe, das die Nebennieren unter einem Seziermikroskop umgibt.
- Wiegen Sie die bilateralen Nebennieren einzeln. Berechnen Sie die relativen Nebennierengewichte in Milligramm pro Gramm (Gesamtgewicht der rechten und linken Nebennieren/Körpergewicht).
9. Messung der postpartalen Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse (HPA) bei den experimentellen Mäusen (optional)
- In Vorbereitung auf HPA-Achsenmessungen euthanasieren Sie Würfe am postpartalen Tag 0 (PP0) auf 6 Welpen pro Wurf. Verwenden Sie Kohlendioxid-Inhalation, gefolgt von enthaupten mit chirurgischer Schere als sekundäre Methode der Euthanasie.
- Am postpartalen Tag 2 (PP2) halten Sie die Kontrolle und die CGS-Dämme in einem gut belüfteten 50-ml-Polypropylen-Konusrohr für 20 Minuten einzeln zurück. Entfernen Sie die Maus unmittelbar nach der Zurückhaltungsbelastung aus dem konischen Schlauch und halten Sie die Maus mit der nicht dominanten Hand zurück, indem Sie die lose Haut über die Schultern und nach vorne an die Ohren halten, um die Haut über dem Unterkiefer straff zu halten.
- Punktion der Submandibulären Vene mit einer Lanzette leicht hinter dem Unterkiefer, aber vor dem Gehörgang. Sammeln Sie bis zu 100 μL mütterliches Blut in einem Serumseparatorröhrchen. Nach der Probenentnahme sanften Druck mit Gaze auf die Einstichstelle ausüben, um die Blutung zu stoppen. Bringen Sie die Dämme in den Hauskäfig zurück, sobald die Blutung aufhört.
- Zentrifugieren Sie das Serumseparatorröhrchen bei 21.130 x g für 6 min und entfernen Sie das Serum vorsichtig. Lagern Sie das Serum bei -20 °C für den späteren Gebrauch. Messen Sie die Serumkorticosteronkonzentration mit einem ELISA-Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
10. Messung der postpartalen Verhaltensänderungen bei den Versuchsmäusen (optional)
- Um sich auf die Verhaltensanalyse vorzubereiten, keulen Sie Würfe auf 6 Welpen pro Wurf auf PP0.
- Führen Sie eine Analyse der Fragmentierung der mütterlichen Pflege von PP2 bis PP5 durch. Setzen Sie die Dämme an jedem Tag während des Lichtzyklus für eine 5-minütige Gewöhnungszeit dem Testraum aus, bevor Sie das mütterliche Verhalten für einen Zeitraum von 30 Minuten auf Video aufnehmen.
- Beurteilen Sie die Fragmentierung der mütterlichen Pflege, indem Sie die durchschnittliche Länge eines einzelnen Leck- / Pflegekampfes und die Gesamtzahl der von Mutterdämmen durchgeführten Kämpfemessen 19.
HINWEIS: Leck- / Pflegeverhalten ist definiert als ein Verhalten, bei dem der Damm mit seiner Zunge Kontakt mit dem Körper des Welpen herstellt oder der Welpe vom Muttertier mit seinen Vorpfeupen behandelt wird. Ein Kampf ist definiert als eine ununterbrochene Zeitspanne, in der der Damm mit dem Lecken / Pflegen seiner Welpen beschäftigt ist.
- Beurteilen Sie die Fragmentierung der mütterlichen Pflege, indem Sie die durchschnittliche Länge eines einzelnen Leck- / Pflegekampfes und die Gesamtzahl der von Mutterdämmen durchgeführten Kämpfemessen 19.
- Führen Sie die Analyse der Anhedonie mittels Saccharose-Präferenztest (SPT) von PP0 bis PP6 durch. Setzen Sie die Dämme einer 100-ml-Flasche sauberem Wasser und einer 100-ml-Flasche mit 4% igem Saccharoselösung in ihrem Hauskäfig aus. Messen Sie die Menge an Wasser und Saccharose, die täglich verbraucht wird (in ml). Tauschen Sie die Flaschenplatzierung im Heimkäfig aus. Berechnen Sie die Saccharosepräferenz anhand der Durchschnittswerte der letzten 4 Tage: Präferenz % = [(Saccharoseverbrauch / Saccharose + Wasserverbrauch) x 100].
- Führen Sie eine Analyse des angstähnlichen Verhaltens über ein erhöhtes Nulllabyrinth (EZM) auf PP8 durch. Platzieren Sie die Dämme einzeln auf dem EZM-Gerät, das aus zwei geschlossenen Quadranten und zwei offenen Quadranten besteht, die vom Boden angehoben sind. Lassen Sie die Dämme das Labyrinth 5 Minuten lang ungestört erkunden. Quantifizieren Sie die im offenen Quadranten verbrachte Zeit und die Anzahl der Einträge in den offenen Quadranten.
11. Messung der Gewichtsveränderungen der postnatalen Nachkommen (optional)
- Um sich auf die Gewichtsanalyse der Nachkommen vorzubereiten, keulen Sie Würfe am Tag der Geburt (postnataler Tag 0, PN0) auf 6 Welpen pro Wurf.
- Zeichnen Sie das Gewicht der Welpen auf PN0 und zu verschiedenen Zeitpunkten während der postnatalen Periode auf (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Exposition der trächtigen weiblichen Mäuse gegenüber CGS führt zu Veränderungen chronischer stressrelevanter Parameter, einschließlich einer Verringerung der Körpergewichtszunahme während der Schwangerschaft (Abbildung 2A) und erhöhten Nebennierengewichten in der frühen postpartalen Periode (Abbildung 2B)19. Wichtig ist, dass die Exposition gegenüber CGS zu postpartalen Anomalien in der mütterlichen neuroendokrinen Funktion führt. CGS-Muttertiere weisen eine hyperaktive HPA-Achse auf, wie die erhöhten Serumkorticosteronspiegel nach der Anwendung einer neuartigen akuten Beleidigung belegen (Abbildung 3)19.
Die Exposition der trächtigen weiblichen Mäuse gegenüber CGS führt in der frühen postpartalen Periode zu Verhaltensanomalien, die die Entstehung eines depressiven Phänotyps widerzuspiegeln scheinen. CGS-Muttertiere zeigen Veränderungen in der mütterlichen Versorgung, was sich in einer Zunahme des Grades der Fragmentierung der mütterlichen Signale widerspiegelt, die von den Welpen empfangen werden. Die durchschnittliche Dauer von Leck-/Pflegeanfällen ist reduziert und mit einer Zunahme der mittleren Anzahl von Anfällen nach CGS verbunden, was auf zahlreiche kurze Episoden von Pflegeverhalten hinweist (Abbildung 4A, B)19. Die Saccharosepräferenz ist auch bei CGS-Dämmen im Vergleich zu Kontrolldämmen gedrückt, was auf das Vorhandensein von Anhedonie hindeutet (Abbildung 4C)19. Schließlich zeigen die CGS-Dämme auch ein erhöhtes angstbedingtes Verhalten, gemessen an einer Verringerung der Zeit, die in den offenen Quadranten des EZM im Vergleich zu Kontrolldämmen verbracht wird (Abbildung 4D)19.
Bei den Nachkommen führt die Exposition gegenüber CGS in-utero zu einer verminderten Gewichtszunahme während der postnatalen Periode, vom postnatalen Tag 7 bis 21, obwohl bei der Geburt keine Veränderungen beobachtet werden. Diese Verringerung der Körpergewichtszunahme ist bei Nachkommen beider Geschlechter vorhanden (Abbildung 5)19. Bemerkenswert ist, dass das CGS-Paradigma keinen Einfluss auf die Schwangerschaftslänge, die Wurfgröße oder das Geschlechterverhältnis pro Wurf hatte (Daten nicht gezeigt)19.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des CGS-Paradigmas und der funktionalen Bewertungen zur Validierung. Diese Zahl wurde von Zoubovsky, S.P. et al.19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Veränderungen der chronischen stressbedingten Parameter in den Mutterdämmen nach CGS-Exposition. (A) Veränderungen des Körpergewichts von G6,5-G17,5, Kontrolle = 17, CGS = 17. (B) Relative mütterliche Nebennierengewichte bei PP2, Kontrolle = 20, CGS = 15. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Zoubovsky, S.P. et al.19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Mütterliche HPA-Achsenmessungen nach CGS-Exposition. Mütterliche Serumkorticosteronspiegel gemessen nach 20 Minuten Zurückhaltungsstress auf PP2, Kontrolle = 8, CGS = 5. Daten dargestellt als Mittelwert + REM. *p < 0,05. Diese Zahl wurde von Zoubovsky, S.P. et al.19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Verhaltensänderungen in der frühen postpartalen Periode bei Mutterdämmen nach CGS-Exposition. (A) Mittlere Dauer und (B) Anzahl der leckenden/pflegenden Kämpfe, die von PP2-PP5 aufgezeichnet wurden, Kontrolle = 17, CGS = 17. (C) Prozentuale Saccharosepräferenz bei SPT, Kontrolle = 17, CGS = 19. (D) Gesamtzeit, die während des 5-minütigen Zeitraums im offenen Quadranten des EZM verbracht wurde, Kontrolle = 17, CGS = 19. Die Daten werden als Mittelwert + REM *p < 0,05, **p < 0,01 dargestellt. Diese Zahl wurde von Zoubovsky, S.P. et al.19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Veränderungen des Körpergewichts der Nachkommen während der postnatalen Entwicklung nach in-utero-Exposition gegenüber CGS. Das Körpergewicht der Nachkommen gemessen von PN0 bis PN21, Kontrolle = 17 Würfe, CGS = 17 Würfe. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Zoubovsky, S.P. et al.19modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Exposition der trächtigen Mäuse gegenüber CGS-Störungen nach der geburtlichen mütterlichen neuroendokrinen Funktion, einschließlich der HPA-Achsenreaktion auf neuartige Stressoren, und ist mit verschiedenen Verhaltensanomalien verbunden, die für perinatale Stimmungs- und Angststörungen relevant sind. Da das Modell einen Umweltrisikofaktor verwendet, wird eine höhere phänotypische Variation erwartet als sonst in genetischen Modellen beobachtet22. Dennoch können die Ergebnisse, die durch die Anwendung des CGS-Paradigmas erzielt werden, in allen Forschungslabors konsistent sein, wenn darauf geachtet wird, Variablen zu minimieren, die die Ergebnisse verwirren können.
Zu den kritischen Schritten im Protokoll gehören Schritte im Zusammenhang mit allgemeinen Haltungspraktiken, einschließlich der Unterbringung von Kontrollmäusen getrennt von CGS-Mäusen und zeitgesteuerten Paarungsschritten. Co-Housing-Kontrolle und CGS-Mäuse könnten an sich ein belastender Reiz für die Kontrollgruppe sein und daher neuroendokrine oder Verhaltensergebnisse verwirren23,24. Ebenso wird nicht empfohlen, Experimente mit trächtigen Mäusen zu initiieren, die vom Lieferanten versandt werden. Um die Effizienz von zeitlich abgestimmten Paarungen zu maximieren, wird empfohlen, erwachsene weibliche Mäuse mindestens 2 Wochen vor der Einrichtung von zeitlich abgestimmten Paarungen zusammenzubringen, um ihre Östruszyklen zu synchronisieren. Ebenso wird die Verwendung von sexuell erfahrenen erwachsenen männlichen Mäusen und die Verhinderung der Paarung von Männchen mindestens 1 Woche vor der Einrichtung von Zeitpaarungen ihre Fruchtbarkeit maximieren und das Potenzial für erfolgreiche Schwangerschaften erhöhen. Der Zeitplan des CGS-Paradigmas muss ebenfalls sorgfältig befolgt werden. Die Anwendung dieser Stressoren unterschiedlicher Intensität zu früh in der Schwangerschaft könnte die Entscheidungualisierung der Gebärmutter beeinflussen und die Implantation von Embryonen hemmen25. Es wurde auch festgestellt, dass die Stressexposition während verschiedener Schwangerschaftszeitfenster ein unterschiedliches geschlechtsspezifisches Risiko für neurologische Entwicklungskrankheiten für Nachkommen mit sich bringt, wobei männliche Nachkommen während der frühen Schwangerschaft signifikant anfälliger sind als weibliche Nachkommen für Stressoren26,27. Der CGS-Zeitplan muss so gestaltet sein, dass er Unvorhersehbarkeit gewährleistet, um die Entwicklung von Anpassungsmechanismen und Akklimatisierung zu verhindern, die häufig mit wiederholter Exposition gegenüber vorhersehbaren Stressoren verbunden sind28. Schließlich sollten Würfe am Tag der Geburt auf sechs Welpen gekeult werden, um vergleichbare Bedingungen über alle Muttertiere hinweg zu gewährleisten und zu verhindern, dass Streugrößenvariabilitäten die mütterliche Hormon- oder Verhaltensanalyse verwirren. Ebenso sollten verschiedene Kohorten für neuroendokrine und Verhaltensbewertungen eingesetzt werden, um verwirrende Auswirkungen von Zurückhaltungsstress und submandibulären Blutungen auf das Verhalten zu minimieren. Verschiedene Kohorten sollten auch für die Beurteilung der mütterlichen Pflege und die Analyse anderer Verhaltensparameter verwendet werden, um die Störung der mütterlichen Interaktion mit den Welpen zu minimieren.
Es gibt mehrere Einschränkungen für das aktuelle Protokoll. Die Unfähigkeit, die Anzahl der trächtigen Mäuse vor Beginn des CGS-Paradigmas genau vorherzusagen, kann eine erhebliche finanzielle und tierische Belastung darstellen. Änderungen am Protokoll könnten vorgenommen werden, um einen vorhersehbareren Erfolg mit zeitlich geregelten Paarungen zu erzielen, einschließlich der Bewertung der vaginalen Zytologie zur Identifizierung von Mäusen im Östrusstadium, wo sowohl Paarung als auch Eisprung typischerweise auftreten29. Die ultraschallgraphische Untersuchung von Mäusen könnte auch als alternative nicht-invasive Technik in das CGS-Paradigma integriert werden, um Schwangerschaften ab sehr frühen Stadien der Schwangerschaft genau zu identifizieren30. Die Verwendung von speziellem Zuchtchow mit erhöhtem Fettgehalt wurde auch von anderen Gruppen eingesetzt, um den Paarungserfolg zu verbessern31. Bei Der Einführung von Ernährungsumstellungen ist jedoch Vorsicht geboten, da dies die Mütterstressreaktivität und das Verhalten beeinträchtigen könnte32. Darüber hinaus hat sich das aktuelle Protokoll bei Wildtyp-C57BL / 6-Mäusen als wirksam erwiesen, aber Änderungen des Protokolls können für verschiedene Stämme oder genetische Hintergründe sowie Arten erforderlich sein, da sie große Unterschiede in der Stressempfindlichkeit, der mütterlichen Pflege und der emotionalen Regulation aufweisen können.
Im Vergleich zu derzeit existierenden peripartalen Stressmodellen erweist sich das CGS-Paradigma angesichts der daraus resultierenden krankheitsrelevanten Endophenotypen als translational relevanter, einschließlich erhöhter mütterlicher Stressreaktivität und postpartaler Anomalien in der mütterlichen Versorgung, Anhedonie und Angstzuständen. Diese Veränderungen scheinen klinische Befunde im Zusammenhang mit perinatalen Stimmungs- und Angststörungen zu rekapitulieren. Zukünftige Anwendungen dieses Modells umfassen die Verwendung des CGS-Paradigmas, um geschlechtsspezifische Auswirkungen von mütterlichem psychosozialem Stress auf die Gehirnentwicklung und Krankheitsanfälligkeit der Nachkommen zu identifizieren. Die Untersuchung der Auswirkungen von CGS auf die Plazentafunktion sollte in Betracht gezogen werden, da gezeigt wurde, dass Eine Dysfunktion der wichtigsten Plazentafunktionen die Entwicklung des fetalen Gehirns beeinflusst33. Die Einbeziehung von Cross-Fostering-Experimenten mit dem CGS-Paradigma würde weiter dazu beitragen, die individuellen Beiträge in der utero CGS-Exposition und die damit verbundenen mütterlichen hormonellen Milieuveränderungen im Vergleich zu postpartalen Anomalien bei der Pflege des Verhaltens bei der Gestaltung der emotionalen Entwicklung der Nachkommen zu verstehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Unterstützung des National Institute of General Medical Sciences T32 GM063483-14 und der Cincinnati Children's Research Foundation anerkennen. Für Daten, die von Zoubovsky et al., 2019, angepasst wurden, finden Sie die Creative Common License an folgendem Ort: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
