Summary
يستخدم نموذج الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن (CGS) الضغوطات ذات الصلة سريريا أثناء الحمل في الفئران لنمذجة الاضطرابات النفسية للأمهات والرضع. هنا، نحن نقدم إجراء خطوة بخطوة لتطبيق نموذج CGS والتقييمات المصب للتحقق من صحة هذا النموذج.
Abstract
وتعتبر فترة ما حول الولادة فترة حساسة حيث يمكن أن يؤدي التعرض السلبي للأمهات إلى عواقب سلبية طويلة الأجل على كل من الأم والنسل، بما في ذلك تطور الاضطرابات العصبية النفسية. وقد درست على نطاق واسع عوامل الخطر المرتبطة بظهور خلل التنظيم العاطفي في الدياد الأمومي الرضيع. وقد برز باستمرار التعرض للإجهاد النفسي والاجتماعي أثناء الحمل كواحد من أقوى التوقعات. وقد تم إنشاء نماذج القوارض عدة لاستكشاف هذا الارتباط; ومع ذلك ، تعتمد هذه النماذج على استخدام الضغوطات الجسدية أو عدد محدود من الضغوطات النفسية والاجتماعية المقدمة بطريقة متكررة ، والتي لا تلتقط بدقة نوع وكثافة وتواتر الضغوطات التي تعاني منها النساء. للتغلب على هذه القيود، تم إنشاء نموذج الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن (CGS) الذي يستخدم الإهانات النفسية والاجتماعية المختلفة من كثافة مختلفة قدمت بطريقة لا يمكن التنبؤ بها. تصف المخطوطة نموذج CGS الجديد هذا حيث تتعرض الفئران الحامل، من اليوم الحملي 6.5 إلى 17.5، لضغوطات مختلفة خلال النهار والليل. تتراوح الضغوطات النهارية، وهما في اليوم يفصل بينهما فاصل 2 ساعة، من التعرض للأجسام الغريبة أو رائحة المفترس إلى التغيرات المتكررة في الفراش، وإزالة الفراش، وإمالة القفص. وتشمل الضغوطات بين عشية وضحاها التعرض المستمر للضوء، وتغيير الاصحاب قفص، أو التبول الفراش. لقد أظهرنا سابقا أن التعرض ل CGS يؤدي إلى تطور الغدد الصماء العصبية الأمومية والتشوهات السلوكية ، بما في ذلك زيادة التفاعل الإجهادي ، وظهور أنماط رعاية الأمهات المجزأة ، والهدونية ، والسلوكيات المتعلقة بالقلق ، والسمات الأساسية للنساء اللواتي يعانين من اضطرابات المزاج والقلق في الفترة المحيطة بالولادة. هذا النموذج CGS، لذلك، يصبح أداة فريدة من نوعها التي يمكن استخدامها لتوضيح العيوب الجزيئية الكامنة وراء خلل التنظيم العاطفي الأم، فضلا عن آليات عبر المشيمة التي تؤثر على النمو العصبي الجنيني ويؤدي إلى عواقب سلوكية سلبية على المدى الطويل في النسل.
Introduction
ولا تزال الآليات الكامنة وراء زيادة التعرض للاضطرابات العصبية النفسية لدى الأمهات والرضع بعد التعرض السلبي للأمهات في فترة ما حول الولادة غير معروفة إلى حد كبير. تحدث تغييرات فسيولوجية كبيرة للأم أثناء الحمل والانتقال إلى فترة ما بعد الولادة ، بما في ذلك العديد من التعديلات العصبية الصماوية التي يفترض أنها حاسمة ليس فقط للتنمية العصبية للنسل السليم ولكن أيضا للحفاظ على الصحة العقلية للأمهات1،2. على مستوى محور الغدة النخامية الأمومية (HPA) ، لوحظت التكيفات في كل من المستويات الإيقاعية والفعلية لإطلاق الجلوكوكورتيكويد ، بما في ذلك إيقاع أكثر تسطيحا لنشاط محور HPA النهاري واستجابة محور HPA المثبطة للضغوطالحادة 3و4و5. وبالنظر إلى أن يتم الإبلاغ عن تعزيز نشاط محور HPA في مجموعة فرعية من النساء مع خلل التنظيم العاطفي بعد الولادة، بما في ذلك زيادة مستويات الجلوكوكورتيكويدات المتداولة وتثبيط ردود الفعلالسلبية 6،7،8 ، والتعرض للضغوطات التي تؤدي إلىزيادةالتفاعل الإجهاد بعد الولادة ومنع التكيفات محور HPA الأم ويعتقد أن تزيد من التعرض للاضطرابات العصبية النفسية.
لتوضيح آثار الإجهاد على الخلل العاطفي في الأمهات والرضع ، تم إنشاء العديد من نماذج القوارض من الإجهاد في فترة ما حول الولادة. وتتميز غالبية هذه النماذج من خلال تطبيق الضغوطات الجسدية التي تؤدي إلى تحديات الهوستاتيكي والتعديلات في الحالة الفسيولوجية السد9، مثل الإجهاد ضبط النفس المزمن10 والإجهاد السباحة خلال الحمل11، أو التعرض للصدمة بعد الولادة12. على الرغم من أن هذه النماذج قد ثبت أن يؤدي إلى ظهور السلوكيات الاكتئابية مثل ما بعد الولادة والتعديلات في رعاية الأم10،11،12، فقد كانت محدودة بسبب عدم قدرتها على التقاط بدقة الطبيعة النفسية والاجتماعية للضغوطات التي تعاني منها عادة الأمهات البشريات. هذا يصبح مهما بشكل خاص عند محاولة الكشف عن عواقب الغدد الصماء العصبية للإجهاد المزمن في فترة ما حول الولادة ، بالنظر إلى أن معالجة أنواع مختلفة من الضغوطات يعتقد أن بوساطة شبكات عصبية مختلفة تنسق تنشيط محور HPA9.
ومن أجل التغلب على هذا القيد، صممت عدة مجموعات نماذج للإجهاد تستخدم الإهانات النفسية والاجتماعية أو مزيج من الضغوطات الجسدية والنفسية والاجتماعية. وقد تمكن نموذج فصل الأم، حيث يتم فصل السدود عن صغارها لعدة ساعات يوميا خلالفترةما بعد الولادة13 و14،ونموذج الإجهاد الاجتماعي المزمن، حيث تتعرض السدود لدخيل ذكر في وجود القمامة15،16، من إعادة إنتاج ظهور تشوهات في رعاية الأمهات والأنماط الظاهرية الشبيهة بالاكتئاب المرتبطة بنماذج الإجهاد البدني. وقد كشف نموذج الإجهاد المزمن فائق السرعة، حيث تتعرض الفئران الحامل لمجموعة متنوعة من الإهانات النفسية والاجتماعية، بما في ذلك إمالة القفص والإضاءة بين عشية وضحاها، فضلا عن الإهانات الفسيولوجية الكبيرة، مثل الإجهاد ضبط النفس وتقييد الغذاء، التعرض لطبيعة مختلطة من الضغوطات يؤدي إلى تشوهات في سلوك الأم، بما في ذلك ضعف في العدوان الأم، وكذلك dysregulation في النشاط circadian من محور HPA17،18. واتساقا مع هذه النتائج، يؤدي إجهاد ضبط النفس بالتناوب ونموذج الاكتظاظ أثناء الحمل إلى ارتفاعات في مستويات الكورتيكوستيرون الأمومي بعد الولادة وكذلك التعديلات في رعاية الأمهات، على الرغم من عدم ملاحظة أي اختلافات في إعادة نشاط محور HPA بعد التعرض للإهانات الحادة الجديدة1.
التوسع في هذا العمل ، وتوليد نموذج الإجهاد الحملي الذي يستخدم الشتائم النفسية والاجتماعية المتعددة المقدمة بطريقة لا يمكن التنبؤ بها ويقلل من استخدام الضغوط الفسيولوجية. وقد أظهرت الدراسات سابقا هذا النموذج الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن (CGS) النتائج في تطوير ضعف محور HPA الأم, بما في ذلك تعزيز التفاعل الإجهاد في الفترة المبكرة بعد الولادة19. وترتبط هذه التغيرات مع تشوهات في سلوك الأم، بما في ذلك التعديلات في نوعية الرعاية الأمومية التي يتلقاها الجراء، وظهور السلوكيات anhedonic والقلق مثل19،ملامح تتفق مع اضطرابات المزاج والقلق في الفترة المحيطة بالولادة20،21. وعلاوة على ذلك، يقلل زيادة وزن النسل خلال فترة ما بعد الولادة بعد التعرض داخل الرحم ل CGS19،مما يشير إلى أن CGS قد يكون لها آثار برمجة سلبية مستمرة في الأجيال القادمة.
كان الهدف في تطوير نموذج CGS هو الاستفادة في المقام الأول من الضغوطات ذات الصلة سريريا ، والتي تلتقط بدقة نوع وكثافة وتواتر الإهانات المرتبطة في كثير من الأحيان بخلل تنظيم الغدد الصماء العصبية وتطور اضطرابات المزاج والقلق في الفترة المحيطة بالولادة. هنا، تقدم الدراسة بروتوكولا مفصلا لكيفية إخضاع الفئران الإناث الحوامل ل CGS، فضلا عن التقييمات المصب التي يمكن استخدامها لاختبار صحة النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في المركز الطبي للأطفال في سينسيناتي على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة. تم توفير إمكانية الوصول إلى طعام القوارض القياسي والمياه في جميع الأوقات للفئران ، بما في ذلك خلال نموذج CGS. تم إيواء الفئران على مدار 14 ساعة / 10 ساعة ضوء الظلام دورة (أضواء على 06:00 ساعة) ما لم ينص على خلاف ذلك (أي التعرض للأضواء بين عشية وضحاها).
1. التحضير للتزاوج في الوقت المناسب
- قبل أسبوعين على الأقل من إعداد التزاوج في الوقت المناسب ، قم بإيواء الفئران الأنثوية البالغة معا في قفص فأر قياسي (18.4 سم × 29.2 سم × 12.7 سم) ، وأربعة فئران لكل قفص. تسمية كل فأرة أنثى برقم معرف محدد عبر علامة الأذن.
ملاحظة: تم استخدام الفئران الإناث C57BL6 مع عدم وجود الحمل السابق وبين 3 إلى 6 أشهر من العمر لهذا البروتوكول. - على الأقل 1 أسبوع قبل إعداد التزاوج في الوقت المناسب، منزل فردي الفئران الذكور البالغين لاستخدامها في التزاوج.
2. إعداد التزاوج في الوقت المناسب
- إعداد التزاوج في الوقت المحدد في الساعة 18:00. خذ فأرين أنثى ووضعهما داخل قفص يحمل فأرا ذكرا يسكنه بشكل فردي. فصل التزاوج في الوقت المناسب في صباح اليوم التالي من قبل 08:00 ساعة.
3. التحقق من المكونات copulatory، المعينة كيوم الحمل 0.5 (G0.5)
- مباشرة بعد فصل التزاوج في الوقت المناسب، تحقق من وجود المكونات copulatory في الفئران الإناث. وجود المكونات copulatory سوف علامة G0.5. السماح للفأر لعقد شبكة الأسلاك داخل القفص ورفع بلطف من الذيل لتصور فتحة المهبل.
ملاحظة: يشير وجود قابس التناسخ إلى حدوث نشاط جنسي ولكنه لا يضمن الحمل. عند محاولة حساب عدد الفئران التجريبية اللازمة ، توقع أن يتم توصيل 50٪ من الفئران من التزاوج الميزمان والحمل لسد معدل الإصابة بنسبة 60٪ -70٪. - استخدم الفحص البصري البسيط لتحديد وجود قابس كوبولاتوري (كتلة بيضاء مبهمة متصلبة داخل الفتحة المهبلية أو جاحظة قليلا منها). إذا لم يتم التعرف على المكونات copulatory بسهولة عن طريق الفحص البصري البسيط، أدخل بلطف مسبار نهاية حادة في فتحة المهبل. تحديد المقابس الموجودة مرة أخرى في المهبل من خلال مقاومة إدخال المسبار.
- فصل الفئران الإناث مع المقابس copulatory ومنزل المجموعة في أقفاص الماوس القياسية، 3-4 الفئران في القفص الواحد.
4. التحضير لنموذج CGS
- تعيين عشوائيا أقفاص الإسكان الفئران الإناث مع المقابس copulatory في مجموعتين على G5.5: التحكم ومجموعة CGS. محاولة عشوائية أقفاص أن يكون عدد متساو تقريبا من الفئران لكل مجموعة. نقل الفئران لتنظيف أقفاص الماوس القياسية وتسمية مع علامة "عدم الإزعاج". تعيين هذه الأقفاص بأنها "أقفاص منزلية" للفئران لوضعها في نهاية كل الإجهاد.
- تعيين غرفة منفصلة في مرفق الماوس لتنفيذ نموذج CGS. تصميم نظام الإجهاد لمدة 11 يوما، والذي يمتد من G6.5 إلى G17.5، للاستفادة من كل من الضغوطات 7 أيام [التعرض للأجسام الغريبة (الرخام أو legos)، والتعرض رائحة المفترس (الفراش الفئران القذرة)، 30 درجة إمالة القفص، والتغييرات المتكررة من الفراش، وإزالة الفراش، والحركة على شاكر] مرتين في اليوم الواحد، والاستفادة من كل من الضغوطات ليلة 3 (أضواء بين عشية وضحاها على، قفص زميله التغيير، والتعرض للفراش الرطب) بين عشية وضحاها بطريقة عشوائية. للحصول على جدول زمني محتمل لعينة وتخطيطي للتجارب الموضحة أدناه، راجع الشكل 1.
ملاحظة: كل يوم الإجهاد ينبغي أن تقع ضمن دورة ضوء الفئران (أضواء على 06:00 ح-20:00 ساعة)، وآخر 2 ساعة، مع ما لا يقل عن 2 ساعة كسر بين الضغوطات. يجب إعداد كل الإجهاد الليلي في بداية دورة الظلام (أضواء قبالة 20:00 ساعة) وفصلها في بداية دورة الضوء (أضواء على 06:00 ساعة).
5. تنفيذ نموذج CGS
- إعداد الضغوطات محددة على قفص ثابت القياسية مع أعلى المصفاة وزجاجة مياه في الغرفة المخصصة لنموذج CGS. إعداد عدد الأقفاص الثابتة اللازمة للتجربة اعتمادا على عدد أقفاص الماوس المخصصة للخضوع ل CGS أثناء العشوائية. قبل البدء في كل عامل إجهاد، قم بنقل أقفاص الماوس الخاصة بمجموعة CGS من غرفة السكن إلى غرفة CGS.
ملاحظة: تنفيذ التعامل مع / نقل الفئران من قفص المنزل إلى قفص التجريبية والعودة في أغطية تدفق صفح. - تطبيق الضغوطات التالية وفقا لنظام مصممة مسبقا (الرجوع إلى الخطوة 4.2).
- التعرض للأجسام الغريبة (الرخام أو الليغو): ضع ستة رخامات (قطرها 14 مم) أو ستة ليغو (أشكال مختلفة، لا تتجاوز 4 سم في الارتفاع) موزعة عشوائيا في قفص ثابت نظيف مع فراش الماوس، دون تضمين nestlets الماوس. وضع الفئران جنبا إلى جنب مع نظرائهم قفص المنزل في قفص ثابت مع الأجسام الغريبة لمدة 2 ساعة. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
ملاحظة: تنظيف الكائنات الخارجية بعد الاستخدام. - التعرض لرائحة المفترس (فراش الفئران القذرة): ضع 1 سم في عمق فراش الفئران القذرة الطازجة من الفئران الإناث إلى قفص ثابت نظيف بدون فراش فأر ، دون تضمين nestlets الماوس. وضع الفئران جنبا إلى جنب مع نظرائهم قفص المنزل في قفص ثابت مع الفراش الفئران القذرة لمدة 2 ساعة. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- 30 درجة إمالة القفص: ضع الفئران مع نظيراتها قفص المنزل في قفص ثابت نظيف مع الفراش الماوس، دون بما في ذلك nestlets الماوس. إمالة القفص في 30 درجة ضد الجدار لمدة 2 ساعة. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- التغييرات المتكررة في الفراش: ضع الفئران مع نظيراتها في قفص المنزل في قفص ثابت نظيف مع فراش الماوس ، دون تضمين nestlets الماوس. استبدل فراش الفأرة بفراش الماوس النظيف كل 10 دقائق لمدة 2 ساعة. أثناء تغيير الفراش الماوس، وضع الفئران بلطف في قفص نظيف مختلف لتجنب الاتصال المباشر مع الفئران. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- إزالة الفراش: ضع الفئران مع نظيراتها في قفص المنزل في قفص ثابت نظيف فارغ (بدون فراش فأر أو nestlets) لمدة 2 ساعة. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- الحركة على شاكر : وضع الفئران مع نظرائهم قفص المنزل في قفص ثابت نظيف مع الفراش الماوس ، دون بما في ذلك nestlets الماوس. ضع القفص الساكن فوق شاكر مختبر متبادل تم ضبطه على 140 ضربة في الدقيقة لمدة 2 ساعة. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- التعرض بين عشية وضحاها للأضواء: ضع الفئران مع نظيراتها في القفص المنزلي في قفص ثابت نظيف مع فراش الماوس ، دون تضمين nestlets الماوس. إبقاء الأضواء مضاءة بين عشية وضحاها (20:00 ساعة-06:00 ساعة) للتدخل في دورة الظلام. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- تغيير رفيقة القفص: نقل الماوس إلى قفص ثابت نظيف مع فراش الماوس الذي يتم إيواؤه من قبل مجموعة مختلفة من الفئران الإناث اثنين (الإناث سليمة ليست جزءا من العلاج أو مجموعة التحكم). إبقاء الماوس في قفص ثابت مع الاصحاب قفص غير مألوف بين عشية وضحاها. إعادة الماوس إلى قفص المنزل مع نظرائه قفص المنزل محددة في ختام الإجهاد.
- التعرض للفراش الرطب: ملء القفص الساكن بفراش الماوس مع الحفاظ على المياه النظيفة عند 24 درجة مئوية حتى تشبع الفراش بالماء. ضع الفئران جنبا إلى جنب مع نظيراتها قفص المنزل في القفص ثابت مع الفراش الرطب بين عشية وضحاها. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- التعرض للأجسام الغريبة (الرخام أو الليغو): ضع ستة رخامات (قطرها 14 مم) أو ستة ليغو (أشكال مختلفة، لا تتجاوز 4 سم في الارتفاع) موزعة عشوائيا في قفص ثابت نظيف مع فراش الماوس، دون تضمين nestlets الماوس. وضع الفئران جنبا إلى جنب مع نظرائهم قفص المنزل في قفص ثابت مع الأجسام الغريبة لمدة 2 ساعة. إعادة الفئران إلى قفص وطنهم مع نفس النظراء في ختام الإجهاد.
- خلال نموذج CGS ، حافظ على فئران التحكم دون إزعاج في أقفاصها المنزلية داخل غرفة الإسكان.
- استبدل الأقفاص المنزلية المستعملة بأقفاص منزلية جديدة على G10.5. على G17.5، في ختام الإجهاد بين عشية وضحاها، منزل واحد جميع الفئران التجريبية للتحضير للتقييمات الوظيفية الحجل والمصب.
6. رصد الفئران التجريبية خلال نموذج CGS
- مراقبة الفئران كل 1 ساعة أثناء تطبيق الإجهاد، إلا خلال الضغوطات بين عشية وضحاها.
- استبعاد الفئران التي تظهر عليها علامات الاستغاثة، بما في ذلك الجروح أو الخمول أو أي شذوذ جسدي من التجربة. اتصل بالطاقم البيطري حسب الحاجة.
7. قياس نسبة زيادة وزن الجسم أثناء الحمل في الفئران التجريبية (اختياري)
- على G6.5، وزن الفئران بشكل فردي قبل التعرض للضغوطات. على G17.5 ، في ختام الإجهاد بين عشية وضحاها ، تزن الفئران بشكل فردي. وزن الفئران التحكم في نقاط زمنية الحمل المكافئة.
- قياس نسبة زيادة وزن الجسم أثناء الحمل عن طريق تحديد وزن اليوم الأول من نموذج CGS (G6.5) بنسبة 100٪.
8. قياس أوزان الغدة الكظرية النسبية بعد الولادة في الفئران التجريبية (اختياري)
- في اليوم الثاني بعد الولادة (PP2)، وزن التحكم وسدود CGS بشكل فردي. قتل السدود عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم في غطاء الدخان.
- ضع الفئران على لوحة تشريح ، وتعقيم منطقة البطن مع الإيثانول بنسبة 70 ٪ ، وفتح تجويف البطن باستخدام مقص لإجراء قطع عمودي. عزل الغدد الكظرية الواقعة بجوار القطب الأمامي للكلى مع ملقط، ثنائيا. تشريح بعناية الأنسجة الدهنية المحيطة الغدد الكظرية تحت المجهر تشريح.
- وزن الغدد الكظرية الثنائية بشكل فردي. حساب الأوزان الغدة الكظرية النسبية في ملليغرام لكل غرام (الوزن الإجمالي للغدد الكظرية اليمنى واليسار / وزن الجسم).
9. قياس نشاط محور الغدة الكظرية الغدية النخامية بعد الولادة (HPA) في الفئران التجريبية (اختياري)
- استعدادا لقياسات محور HPA، القتل الرحيم القمامة إلى 6 الجراء لكل القمامة في يوم ما بعد الولادة 0 (PP0). استخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون، تليها قطع الرأس مع مقص الجراحية كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.
- في اليوم الثاني بعد الولادة (PP2)، كبح جماح السيطرة بشكل فردي وسدود CGS داخل أنبوب بولي بروبلين مخروطي جيد التهوية سعة 50 مل لمدة 20 دقيقة. مباشرة بعد الإجهاد ضبط النفس، وإزالة الماوس من أنبوب مخروطي وكبح جماح الماوس مع اليد غير المهيمنة عن طريق عقد الجلد فضفاضة على الكتفين والخلفي إلى الأذنين أن يكون الجلد على مشدود الفك السفلي.
- ثقب الوريد تحت الفك السفلي مع لانسيت قليلا وراء الفك السفلي ولكن الأمامي لقناة الأذن. جمع ما يصل إلى 100 ميكرولتر من دم الأم في أنبوب فاصل المصل. بعد جمع العينة، ضعي ضغطا لطيفا بالشاش على موقع الثقب لوقف النزيف. أعد السدود إلى القفص المنزلي بمجرد توقف النزيف.
- الطرد المركزي أنبوب فاصل المصل في 21,130 x g لمدة 6 دقائق وإزالة المصل بعناية. تخزين المصل في -20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. قياس تركيز الكورتيكوسترون المصل بواسطة مجموعة ELISA بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
10. قياس التغيرات السلوكية بعد الولادة في الفئران التجريبية (اختياري)
- للتحضير للتحليل السلوكي ، والقمامة اعدام إلى 6 الجراء لكل القمامة على PP0.
- إجراء تحليل لتجزئة رعاية الأم من PP2 إلى PP5. في كل يوم، خلال دورة الضوء، يعرض السدود إلى غرفة الاختبار لمدة 5 دقائق قبل تسجيل سلوك الأم بالفيديو لمدة 30 دقيقة.
- تقييم تجزؤ رعاية الأم من خلال قياس متوسط طول نوبة لعق / استمالة فردية والعدد الإجمالي للمباريات التي تؤديها السدود19.
ملاحظة: يتم تعريف سلوك لعق / الاستمالة على أنه سلوك حيث يقوم السد بالاتصال بجسم الجرو بلسانها ، أو يتم التعامل مع الجرو من قبل السد مع نبوئسها. يتم تعريف النوبة على أنها فترة زمنية غير منقطعة حيث يشارك السد في لعق / استمالة صغارها.
- تقييم تجزؤ رعاية الأم من خلال قياس متوسط طول نوبة لعق / استمالة فردية والعدد الإجمالي للمباريات التي تؤديها السدود19.
- إجراء تحليل ل anhedonia عن طريق اختبار تفضيل السكروز (SPT) من PP0 إلى PP6. تعريض السدود لزجاجة واحدة من المياه النظيفة سعة 100 مل وزجاجة واحدة سعة 100 مل من محلول السكروز بنسبة 4٪ في قفص منزلهم. قياس كمية الماء والسكيروز المستهلكة (في مل) يوميا. تبادل وضع زجاجة في القفص المنزلي. حساب تفضيل السكروز باستخدام المتوسطات من آخر 4 أيام: تفضيل ٪ = [(استهلاك السكروز / السكروز + استهلاك المياه) × 100].
- إجراء تحليل للسلوك مثل القلق عبر متاهة صفر مرتفعة (EZM) على PP8. ضع السدود بشكل فردي على جهاز EZM المكون من ربعين مغلقين ورباعيين مفتوحين مرتفعين من الأرض. السماح للسدود لاستكشاف المتاهة دون عائق لمدة 5 دقائق. قياس الوقت الذي يقضيه في الربع المفتوح وعدد الإدخالات في الأرباع المفتوحة.
11. قياس تغيرات وزن النسل بعد الولادة (اختياري)
- للتحضير لتحليل وزن النسل، تتناثر الجراء إلى 6 جراء لكل قمامة في يوم الولادة (يوم ما بعد الولادة 0، PN0).
- سجل وزن الجراء على PN0 وفي نقاط زمنية مختلفة خلال فترة ما بعد الولادة (PN2، 7، 15، 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعريض الفئران الإناث الحوامل ل CGS يؤدي إلى تغييرات في المعلمات المزمنة ذات الصلة بالإجهاد، بما في ذلك انخفاض في زيادة وزن الجسم أثناء الحمل(الشكل 2A)وزيادة أوزان الغدة الكظرية في فترة ما بعد الولادة المبكرة (الشكل 2B)19. الأهم من ذلك، التعرض لCGS يؤدي إلى تشوهات ما بعد الولادة في وظيفة الغدد الصماء العصبية الأمومية. السدود CGS المعرض محور HPA مفرط كما يتضح من زيادة مستويات الكورتيكوستيرون المصل بعد تطبيق إهانة حادة جديدة (الشكل 3)19.
تعريض الفئران الإناث الحوامل لCGS نتائج أخرى في التشوهات السلوكية في الفترة المبكرة بعد الولادة التي يبدو أنها تعكس ظهور النمط الظاهري مثل الاكتئاب. تعرض سدود CGS تغييرات في رعاية الأمهات كما تعكسها زيادة في درجة تفتيت الإشارات الأمومية التي تتلقاها الجراء. يتم تقليل متوسط مدة نوبات لعق / الاستمالة ويرتبط بزيادة في متوسط عدد نوبات بعد CGS، مما يدل على العديد من الحلقات القصيرة من السلوك رعاية (الشكل 4A، B)19. كما أن تفضيل السكروز مكتئب في سدود CGS بالمقارنة مع سدود التحكم ، مما يشير إلى وجود anhedonia (الشكل 4C)19. وأخيرا، تعرض سدود CGS أيضا سلوكيات متزايدة متعلقة بالقلق مقاسة بانخفاض الوقت الذي تقضيه في الأرباع المفتوحة من المنطقة الاقتصادية الخالصة بالمقارنة مع سدود التحكم (الشكل 4D)19.
في النسل، يؤدي التعرض ل CGS داخل الرحم إلى انخفاض زيادة الوزن خلال فترة ما بعد الولادة، من يوم ما بعد الولادة 7 إلى 21، على الرغم من عدم ملاحظة أي تغييرات عند الولادة. هذا الانخفاض في زيادة وزن الجسم موجود في ذرية من كلا الجنسين (الشكل 5)19. وتجدر الإشارة إلى أن نموذج CGS لم يكن له أي تأثير على طول الحمل أو حجم القمامة أو نسبة الجنس لكل القمامة (البيانات غير المعروضة)19.
الشكل 1:تخطيط نموذج CGS والتقييمات الوظيفية للتحقق من الصحة. وقد تم تعديل هذا الرقم من زوبوفسكي، س. ب. وآخرون19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:التغيرات في المعلمات المزمنة المرتبطة بالإجهاد في السدود بعد التعرض CGS. (A) يتغير وزن الجسم من G6.5-G17.5، التحكم = 17، CGS = 17. (ب) النسبية الأوزان الغدة الكظرية الأمومية في PP2, التحكم = 20, CGS = 15. البيانات المقدمة على أنها متوسط + SEM. *ص < 0.05، ****ص < 0.0001. وقد تم تعديل هذا الرقم من زوبوفسكي، س. ب. وآخرون19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياساتمحور HPA الأمومي بعد التعرض ل CGS. مستويات الكورتيكوستيرون مصل الأم تقاس بعد 20 دقيقة من الإجهاد ضبط النفس على PP2, التحكم = 8, CGS = 5. البيانات المقدمة على أنها متوسط + SEM. *p < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من زوبوفسكي، س. ب. وآخرون19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التغيرات السلوكية في فترة ما بعد الولادة المبكرة في السدود بعد التعرض CGS. (A) متوسط المدة و (ب) عدد نوبات لعق / الاستمالة المسجلة من PP2-PP5، التحكم = 17، CGS = 17. (C) تفضيل السكروز في SPT، التحكم = 17، CGS = 19. (د)إجمالي مقدار الوقت الذي يقضيه في الربع المفتوح من EZM خلال فترة 5 دقائق، التحكم = 17، CGS = 19. البيانات المقدمة على أنها متوسط + SEM *p < 0.05 ، **p < 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من زوبوفسكي، س. ب. وآخرون19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:التغيرات في وزن جسم النسل أثناء تطور ما بعد الولادة بعد التعرض داخل الرحم ل CGS. وزن الجسم ذرية تقاس من PN0 إلى PN21، التحكم = 17 القمامة، CGS = 17 القمامة. البيانات المقدمة على أنها متوسط + SEM. *ص < 0.05، ****ص < 0.0001. وقد تم تعديل هذا الرقم من زوبوفسكي، س. ب. وآخرون19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعريض الفئران الحامل لاضطرابات CGS وظيفة الغدد الصماء العصبية الأمومية بعد الولادة، بما في ذلك استجابة محور HPA لضغوط جديدة، ويرتبط مع مختلف التشوهات السلوكية ذات الصلة بمزاج الفترة المحيطة بالولادة واضطرابات القلق. وبالنظر إلى أن النموذج يستخدم استخدام عامل خطر بيئي، فمن المتوقع أن يكون الاختلاف الظاهري أعلى مما لوحظ في النماذج الجينية22. ومع ذلك، يمكن أن تكون النتائج التي يتم الحصول عليها من تطبيق نموذج CGS متسقة عبر مختبرات البحوث إذا تم الحرص على تقليل المتغيرات التي قد تربك النتائج.
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الخطوات المتعلقة بالممارسات العامة للتربية، بما في ذلك فئران التحكم في الإسكان المنفصلة عن فئران CGS، وخطوات التزاوج في الوقت المناسب. يمكن السيطرة على السكن المشترك والفئران CGS في حد ذاته أن يكون حافزا المجهدة لمجموعة التحكم وبالتالي الخلط بين الغدد الصماء العصبية أو النتائجالسلوكية 23،24. وبالمثل، لا ينصح ببدء تجارب مع الفئران الحامل التي يتم شحنها من المورد. لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة من التزاوج في الوقت المناسب، فمن المستحسن لإيواء الفئران الإناث الكبار معا على الأقل 2 أسابيع قبل إعداد التزاوج في الوقت المناسب لمزامنة دورات estrus بهم. وبالمثل، فإن استخدام الفئران الذكور البالغة من ذوي الخبرة الجنسية ومنع الذكور من التزاوج قبل أسبوع واحد على الأقل من إعداد التزاوج في الوقت المناسب سيزيد من خصوبتهم ويزيد من إمكانية نجاح الحمل. كما يجب اتباع الجدول الزمني لنموذج CGS بعناية. يمكن أن يؤثر تطبيق هذه الضغوطات ذات الكثافة المتفاوتة في وقت مبكر جدا من الحمل على تحديد الرحم ويمنع زرع الجنين25. كما تم العثور على التعرض للإجهاد خلال النوافذ الزمنية الحملية المختلفة لتحمل مخاطر مختلفة لأمراض النمو العصبي الخاصة بالجنس للذرية ، حيث يكون النسل الذكور أكثر عرضة بكثير من النسل الأنثوي للضغوطات خلال الحمل المبكر26،27. يجب تصميم جدول CGS بطريقة تضمن عدم القدرة على التنبؤ لمنع تطوير آليات التكيف والتأقلم المرتبطة في كثير من الأحيان بالتعرض المتكرر لضغوط يمكن التنبؤ بها28. وأخيرا، ينبغي إعدام القمامة إلى ستة جراء في يوم الولادة لضمان ظروف مماثلة عبر جميع السدود ومنع تقلبات حجم القمامة من الخلط بين هرمون الأم أو تحليل السلوك. وبالمثل، ينبغي استخدام أفواج مختلفة للتقييمات العصبية الصماء والسلوكية للحد من الآثار المحيرة للإجهاد ضبط النفس والنزيف تحت الفك السفلي على السلوك. كما ينبغي استخدام أفواج مختلفة لتقييم رعاية الأمهات وتحليل المعلمات السلوكية الأخرى لتقليل اضطراب تفاعل الأمهات مع الجراء.
هناك العديد من القيود على البروتوكول الحالي. عدم القدرة على التنبؤ بدقة عدد الفئران الحامل قبل بدء نموذج CGS يمكن أن تشكل عبئا كبيرا من الناحية المالية والحيوانية. يمكن إجراء تعديلات على البروتوكول لتحقيق نجاح أكثر قابلية للتنبؤ مع التزاوج في الوقت المناسب ، بما في ذلك تقييم علم الخلايا المهبلي لتحديد الفئران في مرحلة استروس ، حيث يحدث كل من التزاوج والإباضة عادة29. ويمكن أيضا أن تدرج الفحص السونوغرافي للفئران في نموذج CGS كبديل تقنية غير الغازية لتحديد بدقة حالات الحمل من المراحل المبكرة جدا من الحمل30. استخدام طعام تربية خاصة، مع زيادة محتوى الدهون، كما تم استخدامها من قبل مجموعات أخرى لتحسين نجاح التزاوج31. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند إجراء تغييرات في النظام الغذائي ، بالنظر إلى أن هذا يمكن أن يؤثر على التفاعل مع الإجهاد الأمومي والسلوك32. بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن البروتوكول الحالي فعال في الفئران C57BL/6 البرية، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات البروتوكول لسلالات مختلفة أو خلفيات وراثية وكذلك الأنواع، لأنها قد يكون لها اختلافات كبيرة في حساسية الإجهاد، ورعاية الأمهات، والتنظيم العاطفي.
بالمقارنة مع نماذج الإجهاد المحيطة بالولادة الموجودة حاليا، يثبت نموذج CGS أنه أكثر أهمية من الناحية الترجمة نظرا للأنماط endophenotypes ذات الصلة بالأمراض التي لوحظت، بما في ذلك تعزيز التفاعل الإجهاد الأمومي وتشوهات ما بعد الولادة في رعاية الأمهات، والهدونية، والقلق. ويبدو أن هذه التعديلات تلخص النتائج السريرية المرتبطة باضطرابات المزاج والقلق في الفترة المحيطة بالولادة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج استخدام نموذج CGS لتحديد الآثار الخاصة بالجنس للإجهاد النفسي النفسي الأمومي على نمو دماغ النسل والتعرض للأمراض. دراسة آثار CGS على وظيفة المشيمة ينبغي النظر فيها، بالنظر إلى أن الخلل الوظيفي في وظائف المشيمة الرئيسية قد ثبت أن تؤثر على نمو دماغ الجنين33. إن دمج التجارب المتقاطعة مع نموذج CGS من شأنه أن يساعد بشكل أكبر في فهم المساهمات الفردية في التعرض ل CGS داخل الرحم والتغيرات المرتبطة بالوسط الهرموني الأمومي مقابل تشوهات ما بعد الولادة في رعاية السلوك في تشكيل التطور العاطفي للنسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة T32 GM063483-14 والمنحة ومؤسسة سينسيناتي لأبحاث الأطفال. بالنسبة للبيانات التي تم اقتباسها من Zoubovsky et al., 2019، يمكن العثور على الترخيص الإبداعي المشترك في الموقع التالي: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
