Summary
Det kroniske psykososiale stressparadigmet (CGS) bruker klinisk relevante stressfaktorer under graviditet hos mus for å modellere psykiatriske lidelser hos mødre og spedbarn. Her tilbyr vi en trinnvis prosedyre for å bruke CGS-paradigmet og nedstrømsvurderinger for å validere denne modellen.
Abstract
Peripartumperioden regnes som en sensitiv periode der ugunstige mødreeksponeringer kan føre til langsiktige negative konsekvenser for både mor og avkom, inkludert utvikling av nevropsykiatriske lidelser. Risikofaktorer knyttet til fremveksten av affektiv dysregulering i mors-spedbarnsdyden har blitt grundig studert. Eksponering for psykososial stress under graviditet har konsekvent dukket opp som en av de sterkeste prediktorene. Flere gnagermodeller er opprettet for å utforske denne foreningen; Imidlertid er disse modellene avhengige av bruk av fysiske stressfaktorer eller et begrenset antall psykososiale stressfaktorer presentert på en repeterende måte, som ikke nøyaktig fanger typen, intensiteten og frekvensen av stressfaktorer opplevd av kvinner. For å overvinne disse begrensningene ble det generert et kronisk psykososialt stressparadigme (CGS) som bruker ulike psykososiale fornærmelser av forskjellig intensitet presentert på en uforutsigbar måte. Manuskriptet beskriver dette romanen CGS paradigme der gravide kvinnelige mus, fra svangerskapsdag 6,5 til 17,5, blir utsatt for ulike stressfaktorer i løpet av dagen og natten. Dagstressorer, to per dag skilt med en 2 timers pause, spenner fra eksponering for fremmedlegemer eller rovdyr lukt til hyppige endringer i sengetøy, fjerning av sengetøy og burhelming. Stressorer over natten inkluderer kontinuerlig lyseksponering, skiftende burkamerater eller fukt sengetøy. Vi har tidligere vist at eksponering for CGS resulterer i utvikling av mors nevroendokrine og atferdsmessige abnormiteter, inkludert økt stressreaktivitet, fremveksten av fragmenterte mors omsorgsmønstre, anhedonia og angstrelatert atferd, kjerneegenskaper hos kvinner som lider av perinatal stemning og angstlidelser. Denne CGS-modellen blir derfor et unikt verktøy som kan brukes til å belyse molekylære defekter som ligger til grunn for mors affektive dysregulering, samt trans-placental mekanismer som påvirker fosterets nevroutvikling og resulterer i negative langsiktige atferdsmessige konsekvenser hos avkom.
Introduction
Mekanismene som ligger til grunn for økt følsomhet for nevropsykiatriske lidelser hos mødre og spedbarn etter negativ mors eksponering i peripartumperioden, forblir stort sett ukjente. Betydelige mors fysiologiske endringer oppstår under graviditet og overgangen til postpartumperioden, inkludert flere nevroendokrine tilpasninger som antas å være kritiske, ikke bare for sunn avkom nevroutvikling, men også for å bevare mors mentale helse1,2. På nivået av den mors hypothalamus hypofyse binyreakse (HPA) observeres tilpasninger i både døgn- og stressinduserte nivåer av glukokortikoidfrigjøring, inkludert en mer flatt rytme av diurnal HPA-akseaktivitet og dempet HPA-akserespons på akutte stressorer3,4,5. Gitt at forbedret HPA-akseaktivitet rapporteres i en undergruppe av kvinner med postpartum affektiv dysregulering, inkludert økte nivåer av sirkulerende glukokortikoider og hemmet negativ tilbakemelding6,7,8, eksponering for stressorer som resulterer i økt postpartum stress reaktivitet og forhindre mors HPA akse tilpasninger antas å øke følsomheten for nevropsykiatriske lidelser.
For å belyse effekten av stress på affektiv dysregulering hos mødre og spedbarn, har flere gnagermodeller av stress i peripartumperioden blitt generert. Et flertall av disse modellene er preget av anvendelsen av fysiske stressfaktorer som resulterer i homeostatiske utfordringer og endringer i damfysiologisk status9, for eksempel kronisk selvbeherskelsesstress10 og svømmestress under svangerskap11, eller postpartum sjokkeksponering12. Selv om disse paradigmene har vist seg å resultere i fremveksten av postpartum depressiv-lignende atferd og endringer i mors omsorg10,11,12, har de vært begrenset av deres manglende evne til å nøyaktig fange den psykososiale naturen til stressorer som vanligvis oppleves av menneskelige mødre. Dette blir spesielt viktig når du prøver å avsløre de nevroendokrine konsekvensene av kronisk stress i peripartumperioden, gitt at behandling av forskjellige typer stressfaktorer antas å bli formidlet av forskjellige nevrale nettverk som orkestrerer HPA-akseaktivering9.
For å overvinne denne begrensningen har flere grupper designet stressparadigmer som bruker psykososiale fornærmelser eller en kombinasjon av fysiske og psykososiale stressfaktorer. Den mors separasjonsmodell, hvor dammer er skilt fra valpene sine i flere timer per dag i postpartumperioden13,14, og den kroniske sosiale stressmodellen, hvor dammene er utsatt for en mannlig inntrenger i nærvær av deres kull15,16, har vært i stand til å reprodusere fremveksten av abnormiteter i mors omsorg og depressive-lignende fenotyper forbundet med fysiske stressparadigmer. Det kroniske ultramild stressparadigmet, hvor gravide kvinnelige mus blir utsatt for en rekke psykososiale fornærmelser, inkludert burvinkel og nattbelysning, samt betydelige fysiologiske fornærmelser, som selvbeherskelsesstress og matrestriksjon, har ytterligere avslørt eksponering for en blandet karakter av stressfaktorer resulterer i abnormiteter i mors oppførsel, inkludert svekkelser i mors aggresjon, samt dysregulering i døgnaktiviteten til HPA-aksen17,18. I samsvar med disse resultatene resulterer en vekslende selvbeherskelsesstress og overbefolkningsmodell under svangerskapet i økninger i postpartum mors circadian kortikosteronnivåer samt endringer i mors omsorg, selv om det ikke observeres forskjeller i HPA-aksens reaktivitet etter postpartumeksponering for nye akutte fornærmelser1.
En utvidelse av dette arbeidet, som genererer et svangerskapsstressparadigme som bruker flere psykososiale fornærmelser presentert på en uforutsigbar måte og minimerer bruken av fysiologiske stressfaktorer. Studier har tidligere vist at dette kroniske psykososiale stressparadigmet (CGS) resulterer i utvikling av mors HPA-aksedysfunksjon, inkludert forbedret stressreaktivitet i tidlig postpartumperiode19. Disse endringene er forbundet med abnormiteter i mors oppførsel, inkludert endringer i kvaliteten på mors omsorg mottatt av valper, og fremveksten av anhedonic og angstlignende atferd19, funksjoner i samsvar med perinatal stemning og angstlidelser20,21. Videre reduseres avkom vektøkning i løpet av barselperioden etter in-utero eksponering for CGS19, noe som tyder på at CGS kan ha vedvarende negative programmeringseffekter i fremtidige generasjoner.
Målet med å utvikle CGS-paradigmet var først og fremst å utnytte klinisk relevante stressfaktorer, som nøyaktig fanger opp type, intensitet og frekvens av fornærmelser som ofte er forbundet med nevroendokrine dysregulering og utvikling av perinatal stemning og angstlidelser. Her gir studien en detaljert protokoll for hvordan man skal utsette gravide kvinnelige mus for CGS, samt nedstrøms vurderinger som kan brukes til å teste gyldigheten av modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøk ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved Cincinnati Children's Medical Center og var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer. Ad libitum tilgang til standard gnager chow og vann ble gitt til enhver tid til mus, inkludert under CGS paradigmet. Mus ble plassert på en 14 t / 10 t lys-mørk syklus (lys på 06: 00 h) med mindre annet er spesifisert (dvs. eksponering for lys over natten).
1. Forberedelse for tidsbelagte parringer
- Minst 2 uker før du setter opp tidsbetimede parringer, hus de voksne kvinnelige musene sammen i et standard musebur (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), fire mus per bur. Merk hver kvinnelige mus med et bestemt ID-nummer via en ørekode.
MERK: C57BL6 kvinnelige mus uten tidligere graviditet og mellom 3 og 6 måneder ble brukt til denne protokollen. - Minst 1 uke før du setter opp tidsbetimede parringer, må du individuelt huse de voksne hannmusene som skal brukes til parring.
2. Sette opp tidsbetimede parringer
- Sett opp de tidsbetimede parringene i 18:00 h. Ta to kvinnelige mus og plasser dem inne i et bur som holder en individuelt plassert mannlig mus. Skill de tidsbelagte parringene neste morgen med 08:00 h.
3. Kontroll av kopulatorisk plugg, angitt som svangerskapsdag 0,5 (G0,5)
- Umiddelbart etter separering av tidsinnlagte parringer, sjekk om det er en kopulatorisk plugg i de kvinnelige musene. Tilstedeværelsen av en kopulatorisk plugg vil markere G0,5. La musen holde trådgitteret inne i buret og løft det forsiktig ved halen for å visualisere vaginalåpningen.
MERK: Tilstedeværelsen av en kopulatorisk plugg indikerer at seksuell aktivitet har skjedd, men garanterer ikke en graviditet. Når du prøver å beregne antall eksperimentelle mus som trengs, kan du forvente at 50% av musene blir plugget fra tidsinnstilte parringer og en graviditet for å plugge forekomst på 60% -70%. - Bruk enkel visuell undersøkelse for å identifisere tilstedeværelsen av en kopulatorisk plugg (en ugjennomsiktig hvitaktig herdet masse i eller litt utstikkende fra vaginalåpningen). Hvis kopulatorisk plugg ikke lett identifiseres ved enkel visuell undersøkelse, sett forsiktig en stump endesonde inn i vaginalåpningen. Identifiser pluggene som ligger lenger tilbake i skjeden ved motstanden av sondeinnsetting.
- Skill de kvinnelige musene med kopulatoriske plugger og gruppehus i standard musebur, 3 til 4 mus per bur.
4. Forberedelse til CGS paradigme
- Tilordne tilfeldig merder som huser kvinnelige mus med kopulatoriske plugger i to grupper på G5.5: Kontroll- og CGS-gruppe. Forsøk å randomisere bur for å ha omtrent like mange mus per gruppe. Overfør musene til å rengjøre standard musebur og etikett med et "ikke forstyrr" -tegn. Utpeke disse burene som "hjemmebur" for mus å plassere dem på slutten av hver stressor.
- Utpeke et eget rom i museanlegget for å utføre CGS-paradigmet. Design et 11-dagers stressorregime, som går fra G6.5 til G17.5, for å bruke hver av de 7 dagers stressorene [eksponering for fremmedlegemer (klinkekuler eller legos), rovdyr lukteksponering (skittent rotte sengetøy), 30 ° burvinkel, hyppige endringer av sengetøy, fjerning av sengetøy, bevegelse på shaker] to ganger per dag, og for å utnytte hver av de 3 nattstressorene (over natten lys på, cage mate endring, eksponering for vått sengetøy) over natten på en tilfeldig måte. Hvis du vil ha en mulig eksempelplan og skjematisk for eksperimenter som er beskrevet nedenfor, kan du se Figur 1.
MERK: Hver dag skal stressoren falle innenfor musenes lyssyklus (lys på 06:00 h-20:00 h), og siste 2 t, med minst 2 timers pause mellom stressorer. Hver natt stressor bør settes opp i begynnelsen av den mørke syklusen (lysene av 20:00 h) og separert ved starten av lyssyklusen (lys på 06:00 h).
5. Utføre CGS-paradigmet
- Sett opp spesifikke stressfaktorer på et standard statisk bur med filtrert topp og vannflaske i rommet som er utpekt for CGS-paradigmet. Forbered antall statiske bur som trengs for eksperimentet, avhengig av antall musebur utpekt til å gjennomgå CGS under randomisering. Før du starter hver stressor, overfør museburene til CGS-gruppen fra boligrommet til CGS-rommet.
MERK: Utfør håndtering/overføring av mus fra hjemmebur til eksperimentelt bur og tilbake i laminære strømningshetter. - Påfør følgende stressfaktorer i henhold til det forhåndsdesignede regimet (se trinn 4.2).
- Eksponering for fremmedlegemer (klinkekuler eller legos): Plasser seks klinkekuler (14 mm i diameter) eller seks legos (forskjellige former, ikke å overstige 4 cm i høyden) tilfeldig fordelt i et rent statisk bur med mus sengetøy, uten å inkludere musen nestlets. Plasser musene sammen med sine hjemmebur kolleger i det statiske buret med fremmedlegemer i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
MERK: Rengjør fremmedlegemer etter bruk. - Predator lukteksponering (skittent rotte sengetøy): Plasser 1 cm i dybden av fersk skittent rotte sengetøy fra kvinnelige rotter i et rent statisk bur uten muse sengetøy, uten å inkludere musens nestlets. Plasser musene sammen med sine hjemmebur kolleger i det statiske buret med skittent rotte sengetøy i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- 30° burvinkel: Plasser musene med hjemmeburets kolleger i et rent statisk bur med mus sengetøy, uten å inkludere musens nestlets. Vipp buret i 30° mot veggen i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Hyppige endringer av sengetøy: Plasser musene med hjemmeburets kolleger i et rent statisk bur med mus sengetøy, uten å inkludere musens nestlets. Erstatt mus sengetøy med ren mus sengetøy hver 10 min for 2 timer. Under muse sengetøy endres, plasser musene forsiktig i et annet rent bur for å unngå direkte kontakt med musene. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Fjerning av sengetøy: Plasser musene sammen med hjemmeburets kolleger i et tomt rent statisk bur (uten muse sengetøy eller nestlets) i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Bevegelse på shaker: Plasser musene med hjemmeburets kolleger i et rent statisk bur med mus sengetøy, uten å inkludere musens nestlets. Plasser det statiske buret på toppen av en gjensidig lab shaker satt til 140 slag per min i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Eksponering over natten for lys: Plasser musene med hjemmeburets kolleger i et rent statisk bur med mus sengetøy, uten å inkludere musens nestlets. Hold lysene på over natten (20:00 h-06:00 h) for å forstyrre mørk syklus. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Cage mate endring: Overfør musen til et rent statisk bur med mus sengetøy som er plassert av en annen gruppe av to kvinnelige mus (intakte kvinner ikke en del av behandling eller kontroll gruppe). Hold musen i det statiske buret med ukjente burkamerater over natten. Returner musen til hjemmeburet med sine spesifikke hjemmebur kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Eksponering for vått sengetøy: Fyll det statiske buret med mus sengetøy med rent vann holdt ved 24 °C til sengetøyet er mettet med vann. Plasser musene sammen med sine hjemmebur kolleger inn i det statiske buret med vått sengetøy over natten. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Eksponering for fremmedlegemer (klinkekuler eller legos): Plasser seks klinkekuler (14 mm i diameter) eller seks legos (forskjellige former, ikke å overstige 4 cm i høyden) tilfeldig fordelt i et rent statisk bur med mus sengetøy, uten å inkludere musen nestlets. Plasser musene sammen med sine hjemmebur kolleger i det statiske buret med fremmedlegemer i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme kolleger ved avslutningen av stressoren.
- Under CGS paradigme, hold kontrollmusene uforstyrret i sine hjemmebur inne i boligrommet.
- Erstatt de brukte hjemmeburene med nye boligbur på G10,5. På G17.5, ved avslutningen av nattstressoren, en-hus alle eksperimentelle mus for å forberede seg på parturition og nedstrøms funksjonelle vurderinger.
6. Overvåking av eksperimentelle mus under CGS-paradigmet
- Overvåk musene hver 1 time under stressorpåføring, unntatt under stressorer over natten.
- Utelat musene som viser nødtegn, inkludert sår, sløvhet eller fysisk abnormitet fra eksperimentet. Kontakt veterinærpersonalet etter behov.
7. Måling av prosentandel kroppsvektøkning under svangerskapet i eksperimentelle mus (valgfritt)
- På G6.5, vei musene individuelt før eksponering for stressorer. På G17.5, ved avslutningen av nattstressoren, veier musene individuelt. Vei kontrollmusene ved tilsvarende svangerskapstidspunkter.
- Mål prosentandelen kroppsvektøkning under svangerskapet ved å angi vekten av den første dagen i CGS-paradigmet (G6,5) som 100%.
8. Måling av postpartum relative binyrene vekter i eksperimentelle mus (valgfritt)
- På postpartum dag 2 (PP2), vei kontrollen og CGS dammer individuelt. Avlivet demningene ved karbondioksidinnånding etterfulgt av cervical dislokasjon i en avtrekkshette.
- Plasser musene på en disseksjonsplate, steriliser bukområdet med 70% etanol, og åpne bukhulen ved hjelp av saks for å lage et vertikalt kutt. Isoler binyrene som ligger ved siden av nyrenes fremre pol med tang, bilateralt. Disseker forsiktig fettvevet rundt binyrene under et dissekeringsmikroskop.
- Vei de bilaterale binyrene individuelt. Beregn de relative binyrene vekter i milligram per gram (totalvekt av høyre og venstre binyrene / kroppsvekt).
9. Måling av postpartum hypothalamus hypofyse binyre (HPA) akseaktivitet i eksperimentelle mus (valgfritt)
- Som forberedelse til HPA-aksemålinger, euthanize kull til 6 valper per søppel på postpartum dag 0 (PP0). Bruk karbondioksidinnånding, etterfulgt av halshugging med kirurgisk saks som en sekundær metode for eutanasi.
- På postpartum dag 2 (PP2), individuelt begrense kontrollen og CGS dammer inne i en godt ventilert 50 ml polypropylen konisk rør i 20 min. Umiddelbart etter selvbeherskelsesstress, fjern musen fra det koniske røret og hold musen med den ikke-dominerende hånden ved å holde den løse huden over skuldrene og bakre til ørene for å ha huden over mandibelen stram.
- Punkter den submandibulære venen med en lansett litt bak mandibelen, men fremre til ørekanalen. Samle opptil 100 μL mors blod i et serumseparatorrør. Etter prøveoppsamling, bruk forsiktig trykk med gasbind på punkteringsstedet for å stoppe blødningen. Returner demningene til hjemmeburet når blødningen stopper.
- Sentrifuger serumseparatorrøret ved 21 130 x g i 6 minutter og fjern serumet forsiktig. Oppbevar serumet ved -20 °C for senere bruk. Mål serum kortikosteronkonsentrasjonen med et ELISA-sett etter produsentens protokoll.
10. Måling av postpartum atferdsendringer i eksperimentelle mus (valgfritt)
- For å forberede seg på atferdsanalysen, kuller cull til 6 valper per søppel på PP0.
- Utfør analyse av mors omsorgsfragmentering fra PP2 til PP5. På hver dag, under lyssyklusen, eksponer demningene til testrommet i en 5 min habituation-periode før du filmer mors oppførsel i en 30 min periode.
- Vurder mors omsorg fragmentering ved å måle gjennomsnittlig lengde på en individuell slikking / grooming bout og totalt antall kamper utført av dammer19.
MERK: Slikking/pelsstell er definert som en oppførsel der demningen tar kontakt med valpens kropp med tungen, eller valpen håndteres av demningen med forpaws. En kamp er definert som en uavbrutt periode der demningen er engasjert i slikking / grooming av valpene hennes.
- Vurder mors omsorg fragmentering ved å måle gjennomsnittlig lengde på en individuell slikking / grooming bout og totalt antall kamper utført av dammer19.
- Utfør analyse av anhedonia via sukrose preferansetest (SPT) fra PP0 til PP6. Utsett demningene for en 100 ml flaske rent vann og en 100 ml flaske 4% sukroseløsning i deres hjemmebur. Mål mengden vann og sukrose som forbrukes (i ml) daglig. Bytt flaskeplasseringen i hjemmeburet. Beregn sukrosepreferansen ved hjelp av gjennomsnittene fra de siste 4 dagene: preferanse % = [(sukroseforbruk / sukrose + vannforbruk) x 100].
- Utfør analyse av angstlignende oppførsel via forhøyet null labyrint (EZM) på PP8. Plasser demningene individuelt på EZM-apparatet som består av to lukkede kvadranter og to åpne kvadranter forhøyet fra gulvet. La demningene utforske labyrinten uforstyrret i 5 min. Kvantifisere tiden som brukes i den åpne kvadranten og antall oppføringer i de åpne kvadrantene.
11. Måling av postnatal avkom vektendringer (valgfritt)
- For å forberede seg på avkomvektsanalysen, kuller cull til 6 valper per søppel på fødselsdagen (postnatal dag 0, PN0).
- Registrer vekten av valper på PN0 og på forskjellige tidspunkter i barselperioden (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å utsette de gravide kvinnelige musene for CGS resulterer i endringer i kroniske stressrelevante parametere, inkludert en reduksjon i kroppsvektøkning under graviditet (figur 2A) og økte binyrene vekter i tidlig postpartum periode (Figur 2B)19. Viktig, eksponering for CGS resulterer i postpartum abnormiteter i mors nevroendokrine funksjon. CGS dammer viser en hyperaktiv HPA-akse som det fremgår av de økte serum kortikosteronnivåene etter anvendelsen av en ny akutt fornærmelse (Figur 3)19.
Å utsette de gravide kvinnelige musene for CGS resulterer videre i atferdsmessige abnormiteter i den tidlige postpartumperioden som ser ut til å gjenspeile fremveksten av en depressiv-lignende fenotype. CGS dammer viser endringer i mors omsorg som reflektert av en økning i graden av fragmentering av mors signaler mottatt av valpene. Den gjennomsnittlige varigheten av slikking / grooming bouts er redusert og forbundet med en økning i gjennomsnittlig antall kamper etter CGS, noe som indikerer mange korte episoder med pleieatferd (Figur 4A, B)19. Sukrosepreferanse er også deprimert i CGS dammer sammenlignet med kontrolldammer, noe som tyder på tilstedeværelsen av anhedonia (Figur 4C)19. Til slutt viser CGS-demningene også økt angstrelatert atferd målt ved en reduksjon i tiden som brukes i de åpne kvadrantene i EZM sammenlignet med kontrolldammer (Figur 4D)19.
I avkom resulterer eksponering for CGS in-utero i redusert vektøkning i barselperioden, fra barseldag 7 til 21, selv om ingen endringer observeres ved fødselen. Denne reduksjonen i kroppsvektøkning er tilstede hos avkom av begge kjønn (Figur 5)19. Vær oppmerksom på at CGS-paradigmet ikke hadde noen effekt på svangerskapslengde, søppelstørrelse eller kjønnsforhold per søppel (data ikke vist)19.
Figur 1: Skjematisk for CGS paradigme og funksjonelle vurderinger for validering. Denne figuren er endret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Endringer i kroniske stressrelaterte parametere i demningene etter CGS-eksponering. (A) Kroppsvektsendringer fra G6.5-G17.5, Kontroll = 17, CGS = 17. (B) Relative binyrene på morssiden ved PP2, Kontroll = 20, CGS = 15. Data presentert som gjennomsnitt + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Denne figuren er endret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av HPA-akse på morsmelk etter CGS-eksponering. Maternal serum kortikosteron nivåer målt etter 20 min av selvbeherskelse stress på PP2, Kontroll = 8, CGS = 5. Data presentert som gjennomsnitt + SEM. *p < 0,05. Denne figuren er endret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Atferdsendringer i den tidlige postpartumperioden i dammer etter CGS-eksponering. (A) Gjennomsnittlig varighet og (B) antall slikkings-/groomingkamper registrert fra PP2-PP5, Kontroll = 17, CGS = 17. (C) Prosent sukrose preferanse i SPT, Kontroll = 17, CGS = 19. (D) Total tid brukt i åpen kvadrant av EZM i løpet av 5 min perioden, Kontroll = 17, CGS = 19. Data presentert som gjennomsnitt + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Denne figuren er endret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Endringer i avkom kroppsvekt under postnatal utvikling etter in-utero eksponering for CGS. Avkom kroppsvekt målt fra PN0 til PN21, Kontroll = 17 kull, CGS = 17 kull. Data presentert som gjennomsnitt + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Denne figuren er endret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utsette de gravide musene for CGS perturbs postpartum mors nevroendokrine funksjon, inkludert HPA akse respons på nye stressorer, og er forbundet med ulike atferdsmessige abnormiteter som er relevante for perinatal humør og angstlidelser. Gitt at modellen benytter utnyttelse av en miljørisikofaktor, forventes høyere fenotypisk variasjon enn ellers observert i genetiske modeller22. Likevel kan resultater oppnådd ved anvendelse av CGS-paradigmet være konsistente på tvers av forskningslaboratorier hvis det tas hensyn til å minimere variabler som kan forvirre resultatene.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer trinn relatert til generell husdyrholdspraksis, inkludert boligkontrollmus atskilt fra CGS-mus og tidsinnstilte parringstrinn. Co-housing kontroll og CGS mus kan i seg selv være en stressende stimulans for kontrollgruppen og derfor forvirre nevroendokrine eller atferdsmessige resultater23,24. På samme måte anbefales det ikke å starte eksperimenter med gravide mus som sendes fra leverandøren. For å maksimere effektiviteten av tidsbelagte parringer, anbefales det å huse voksne kvinnelige mus sammen minst 2 uker før du setter opp tidsbetimede parringer for å synkronisere østrussyklusene. På samme måte, ved hjelp av seksuelt erfarne voksne mannlige mus og hindre menn i å parre minst 1 uke før du setter opp tidsbetimede parringer, vil maksimere fruktbarheten og øke potensialet for vellykkede graviditeter. Tidslinjen til CGS-paradigmet må også følges nøye. Å bruke disse stressorene med varierende intensitet for tidlig i svangerskapet kan påvirke livmordecidualisering og hemme embryoimplantasjon25. Stresseksponering under forskjellige svangerskapstidsvinduer har også vist seg å bære varierende kjønnsspesifikk nevrodevelopmental sykdomsrisiko for avkom, hvor mannlige avkom er betydelig mer sårbare enn kvinnelige avkom til stressfaktorer under tidlig svangerskap26,27. CGS tidsplan må utformes på en slik måte at det sikrer uforutsigbarhet for å forhindre utvikling av tilpasningsmekanismer og akklimatisering ofte forbundet med gjentatt eksponering for forutsigbare stressorer28. Til slutt bør kull kastes til seks valper på fødselsdagen for å sikre sammenlignbare forhold på tvers av alle dammer og forhindre at variasjoner i kullstørrelse forvirrer morshormon eller atferdsanalyse. På samme måte bør forskjellige kohorter brukes til nevroendokrine og atferdsmessige vurderinger for å minimere forvirrende effekter av selvbeherskelsesstress og submandibulære blødninger på atferd. Ulike kohorter bør også brukes til mors omsorgsvurdering og analyse av andre atferdsparametere for å minimere forstyrrelse av mors interaksjon med valpene.
Det er flere begrensninger i gjeldende protokoll. Manglende evne til å forutsi nøyaktig antall gravide mus før starten av CGS-paradigmet kan utgjøre en betydelig økonomisk og dyrebruksbyrde. Modifikasjoner kan gjøres i protokollen for å oppnå mer forutsigbar suksess med tidsbetimede parringer, inkludert evaluering av vaginal cytologi for å identifisere mus i østrusstadium, hvor både parring og eggløsning vanligvis forekommer29. Ultrasonografisk undersøkelse av mus kan også innlemmes i CGS-paradigmet som en alternativ ikke-invasiv teknikk for å nøyaktig identifisere graviditeter fra svært tidlige stadier avsvangerskapet 30. Bruken av spesiell avlssuppe, med økt fettinnhold, har også blitt brukt av andre grupper for å forbedre parringssuksess31. Imidlertid må forsiktighet tas når du innfører endringer i kostholdet, gitt at dette kan påvirke mors stressreaktivitet og oppførsel32. I tillegg har den nåværende protokollen vist seg å være effektiv i wild-type C57BL /6 mus, men modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig for forskjellige stammer eller genetisk bakgrunn samt arter, for de kan ha store variasjoner i stressfølsomhet, mors omsorg og emosjonell regulering.
Sammenlignet med eksisterende peripartum stressmodeller, viser CGS-paradigmet seg å være mer translasjonelt relevant gitt de resulterende sykdomsrelevante endofenotypene som er observert, inkludert forbedret mors stressreaktivitet og postpartumavvik i mors omsorg, anhedonia og angst. Disse endringene ser ut til å rekapitulere kliniske funn forbundet med perinatal humør og angstlidelser. Fremtidige anvendelser av denne modellen inkluderer bruk av CGS-paradigmet for å identifisere kjønnsspesifikke effekter av mors psykososiale stress på avkom hjerneutvikling og sykdomsfølsomhet. Å studere effekten av CGS på placental funksjon bør vurderes, gitt at dysfunksjon i viktige placentalfunksjoner har vist seg å påvirke fosterhjerneutvikling33. Å inkorporere tverrfremmende eksperimenter med CGS-paradigmet vil ytterligere bidra til å forstå de individuelle bidragene i utero CGS-eksponering og tilhørende mors hormonelle miljøendringer versus postpartumavvik i å pleie atferdsspill i å forme avkom emosjonell utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra National Institute of General Medical Sciences T32 GM063483-14 stipend og Cincinnati Children's Research Foundation. For data tilpasset fra Zoubovsky et al., 2019, kan Creative Common License bli funnet på følgende sted: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
