Summary
O paradigma do estresse psicossocial crônico (CGS) emprega estressores clinicamente relevantes durante a gravidez em camundongos para modelar transtornos psiquiátricos de mães e bebês. Aqui, fornecemos um procedimento passo-a-passo de aplicação do paradigma CGS e avaliações a jusante para validar esse modelo.
Abstract
O período peripartum é considerado um período sensível onde exposições maternas adversas podem resultar em consequências negativas a longo prazo tanto para a mãe quanto para os filhos, incluindo o desenvolvimento de distúrbios neuropsiquiátricos. Fatores de risco ligados ao surgimento da desregulação afetiva no díade materno-infantil têm sido extensivamente estudados. A exposição ao estresse psicossocial durante a gravidez tem emergido consistentemente como um dos preditores mais fortes. Vários modelos de roedores foram criados para explorar essa associação; no entanto, esses modelos dependem do uso de estressores físicos ou de um número limitado de estressores psicossociais apresentados de forma repetitiva, que não captam com precisão o tipo, intensidade e frequência de estressores experimentados pelas mulheres. Para superar essas limitações, foi gerado um paradigma de estresse psicossocial crônico (CGS) que emprega diversos insultos psicossociais de diferentes intensidades apresentados de forma imprevisível. O manuscrito descreve este novo paradigma CGS onde camundongos gestantes, do dia gestacional 6,5 a 17,5, são expostos a vários estressores durante o dia e durante a noite. Estressores diurnos, dois por dia separados por uma quebra de 2h, variam de exposição a objetos estranhos ou odor predador a mudanças frequentes na roupa de cama, remoção de roupa de cama e inclinação da gaiola. Os estressores durante a noite incluem exposição contínua à luz, troca de companheiros de gaiola ou roupas de cama molhadas. Já mostramos anteriormente que a exposição ao CGS resulta no desenvolvimento de anormalidades neuroendócrinas e comportamentais maternas, incluindo aumento da reatividade do estresse, o surgimento de padrões de cuidados maternos fragmentados, anedonia e comportamentos relacionados à ansiedade, características fundamentais de mulheres que sofrem de humor perinatal e transtornos de ansiedade. Este modelo CGS, portanto, torna-se uma ferramenta única que pode ser usada para elucidar defeitos moleculares subjacentes à desregulação afetiva materna, bem como mecanismos trans-placentários que impactam o neurodesenvolvimento fetal e resultam em consequências comportamentais negativas a longo prazo na prole.
Introduction
Os mecanismos subjacentes ao aumento da suscetibilidade a distúrbios neuropsiquiátricos em mães e bebês após exposições maternas adversas no período peripartum permanecem amplamente desconhecidos. Alterações fisiológicas maternas substanciais ocorrem durante a gravidez e a transição para o período pós-parto, incluindo várias adaptações neuroendócrinas que são hipóteses de serem críticas não apenas para o neurodesenvolvimento saudável da prole, mas também para a preservação da saúde mental materna1,2. Ao nível do eixo adrenal hipotalâmico materno (HPA), observam-se adaptações nos níveis circadianos e induzidos pelo estresse da liberação glicocorticoide, incluindo um ritmo mais achatado da atividade do eixo HPA diurno e a resposta do eixo HPA amortecida aos estressores agudos3,4,5. Dado que a atividade aprimorada do eixo HPA é relatada em um subconjunto de mulheres com desregulação afetiva pós-parto, incluindo aumento dos níveis de glicocorticoides circulantes e feedback negativo inibido6,7,8, exposição a estressores que resultam em aumento da reatividade do estresse pós-parto e prevenção de adaptações maternas do eixo HPA são pensadas para aumentar a suscetibilidade a distúrbios neuropsiquiátricos.
Para elucidar os efeitos do estresse na desregulação afetiva em mães e bebês, vários modelos de rodent de estresse no período peripartum foram gerados. A maioria desses modelos é caracterizada pela aplicação de estressores físicos que resultam em desafios homeostáticos e alterações no estado fisiológico da barragem9, como estresse de contenção crônica10 e estresse na natação durante a gestação11, ou exposição ao choque pós-parto12. Embora esses paradigmas tenham sido demonstrados para resultar no surgimento de comportamentos depressivos pós-parto e alterações no cuidado materno10,11,12, eles têm sido limitados por sua incapacidade de capturar com precisão a natureza psicossocial dos estressores comumente vivenciados pelas mães humanas. Isso se torna particularmente importante ao tentar revelar as consequências neuroendócrinas do estresse crônico no período peripartum, uma vez que o processamento de diferentes tipos de estressores é pensado para ser mediado por diferentes redes neurais orquestrando a ativação do eixo HPA9.
Para superar essa limitação, diversos grupos têm desenhado paradigmas de estresse empregando insultos psicossociais ou uma combinação de estressores físicos e psicossociais. O modelo de separação materna, onde as barragens são separadas de seus filhotes por várias horas por dia durante o período pós-parto13,14, e o modelo crônico de estresse social, onde as barragens são expostas a um intruso masculino na presença de suas ninhadas15,16, têm sido capazes de reproduzir o surgimento de anormalidades no cuidado materno e fenótipos depressivos associados a paradigmas de estresse físico. O paradigma crônico de estresse ultramamsário, onde camundongos gestantes são expostos a uma variedade de insultos psicossociais, incluindo inclinação de gaiola e iluminação noturna, bem como insultos fisiológicos substanciais, como estresse de contenção e restrição alimentar, revelou ainda mais exposição a uma natureza mista de estressores resulta em anormalidades no comportamento materno, incluindo prejuízos na agressão materna, bem como a desregulamentação na atividade circadiana do eixo HPA17,18. Consistente com esses resultados, um modelo alternado de restrição e superlotação durante a gestação resulta em elevações nos níveis de corticosterona circadiana materna pós-parto, bem como alterações no cuidado materno, embora não sejam observadas diferenças na re-atividade do eixo HPA após a exposição pós-parto a novos insultos agudos1.
Uma expansão desse trabalho, gerando um paradigma de estresse gestacional que emprega múltiplos insultos psicossociais apresentados de forma imprevisível e minimiza o uso de estressores fisiológicos. Estudos já mostraram anteriormente que esse paradigma de estresse psicossocial crônico (CGS) resulta no desenvolvimento da disfunção do eixo HPA materno, incluindo maior reatividade do estresse no início do pós-parto19. Essas alterações estão associadas a anormalidades no comportamento materno, incluindo alterações na qualidade da assistência materna recebida pelos filhotes, e o surgimento de comportamentos anedônicos e parecidos com ansiedade19, características consistentes com o humor perinatal e transtornos de ansiedade20,21. Além disso, o ganho de peso dos filhos reduz durante o período pós-natal após a exposição no útero ao CGS19,sugerindo que o CGS pode ter efeitos de programação negativa persistentes nas gerações futuras.
O objetivo no desenvolvimento do paradigma CGS foi utilizar principalmente estressores clinicamente relevantes, que capturam com precisão o tipo, intensidade e frequência de insultos frequentemente associados à disregulação neuroendócrina e ao desenvolvimento de transtornos de humor perinatal e ansiedade. Aqui, o estudo fornece um protocolo detalhado de como submeter camundongos gestantes ao CGS, bem como avaliações a jusante que podem ser usadas para testar a validade do modelo.
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Protocol
Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico Infantil de Cincinnati e estavam de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde. O acesso ad libitum à comida de roedor padrão e água era fornecido o tempo todo aos ratos, inclusive durante o paradigma CGS. Os ratos estavam alojados em um ciclo claro-escuro de 14 h/10 h (luzes em 06:00 h) a menos que especificado de outra forma (ou seja, exposição a luzes durante a noite).
1. Preparação para acasalamento cronometrado
- Pelo menos 2 semanas antes de configurar acasalamentos cronometrados, abrigam os camundongos adultos juntos em uma gaiola padrão de rato (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), quatro ratos por gaiola. Rotule cada rato feminino com um número de identificação específico através de uma tag de ouvido.
NOTA: Foram utilizados para este protocolo camundongos fêmeas C57BL6 sem gravidez prévia e entre 3 a 6 meses de idade. - Pelo menos uma semana antes de configurar acasalamentos cronometrados, abriga individualmente os ratos machos adultos para serem usados para acasalamento.
2. Configuração de acasalamentos cronometrado
- Configure os acasalamentos cronometrado às 18:00 h. Pegue duas fêmeas e coloque-as dentro de uma gaiola que segura um rato macho alojado individualmente. Separe os acasalamentos cronometrados na manhã seguinte às 08:00 h.
3. Verificando o plugue copulatório, designado como dia gestacional 0.5 (G0.5)
- Imediatamente após a separação de acasalamento cronometrado, verifique a presença de um plugue copulatório nos camundongos fêmeas. A presença de um plugue copulatório marcará G0.5. Deixe o mouse segurar a grade de arame dentro da gaiola e levante-a suavemente pela cauda para visualizar a abertura vaginal.
NOTA: A presença de um plugue copulatório indica que a atividade sexual ocorreu, mas não garante uma gravidez. Ao tentar calcular o número de camundongos experimentais necessários, espere que 50% dos camundongos sejam plugados a partir de acasalamentos cronometrados e uma gravidez para cobrir a incidência de 60%-70%. - Use um exame visual simples para identificar a presença de um plugue copulatório (uma massa esbranquiçada opaca dentro ou ligeiramente salientes da abertura vaginal). Se o plugue copulatório não for facilmente identificado por um simples exame visual, insira suavemente uma sonda final cega na abertura vaginal. Identifique os plugues localizados mais atrás na vagina pela resistência da inserção da sonda.
- Separe os camundongos fêmeas com plugues copulatórios e casa de grupo em gaiolas de rato padrão, 3 a 4 ratos por gaiola.
4. Preparação para o paradigma CGS
- Atribua aleatoriamente gaiolas que abrigam camundongos fêmeas com plugues copulatórios em dois grupos no G5.5: Control e CGS group. Tente randomizar gaiolas para ter um número aproximadamente igual de ratos por grupo. Transfira os ratos para limpar gaiolas padrão do mouse e rotule com um sinal de "não perturbe". Designar essas gaiolas como "gaiolas domésticas" para os ratos colocá-las no final de cada estressor.
- Designe uma sala separada na instalação do mouse para executar o paradigma CGS. Projete um regime de estressor de 11 dias, que vai de G6.5 a G17.5, para utilizar cada um dos estressores de 7 dias [exposição a objetos estranhos (mármores ou legos), exposição ao odor predador (roupa de rato suja), inclinação de gaiola de 30°, mudanças frequentes de roupa de cama, remoção de roupa de cama, movimento no shaker] duas vezes por dia, e para utilizar cada um dos 3 estressores noturnos (luzes noturnas acesas, mudança companheiro gaiola, exposição à roupa de cama molhada) durante a noite de uma forma aleatória. Para obter um possível cronograma amostral e um esquema de experimentos descritos abaixo, consulte a Figura 1.
NOTA: Cada dia o estressor deve cair dentro do ciclo de luz dos ratos (luzes em 06:00 h-20:00 h), e durar 2 horas, com pelo menos uma pausa de 2 horas entre os estressores. Cada estressor noturno deve ser configurado no início do ciclo escuro (luzes apagadas 20:00 h) e separado no início do ciclo de luz (luzes acesas às 06:00 h).
5. Executando o paradigma CGS
- Configure estressores específicos em uma gaiola estática padrão com parte superior filtrada e garrafa de água na sala designada para o paradigma CGS. Prepare o número de gaiolas estáticas necessárias para o experimento, dependendo do número de gaiolas de rato designadas para serem submetidas a CGS durante a randomização. Antes de iniciar cada estressor, transfira as gaiolas do mouse do grupo CGS da sala de alojamento para a sala CGS.
NOTA: Realize o manuseio/transferência de ratos da gaiola doméstica para gaiola experimental e de volta em capô de fluxo laminar. - Aplique os seguintes estressores de acordo com o regime pré-projetado (consulte a etapa 4.2).
- Exposição a objetos estranhos (mármores ou legos): Coloque seis bolinhas de gude (14 mm de diâmetro) ou seis legos (diferentes formas, não excedendo 4 cm de altura) distribuídos aleatoriamente em uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com objetos estranhos por 2 h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
NOTA: Limpe os objetos estranhos após o uso. - Exposição ao odor predador (roupa suja de rato): Coloque 1 cm em profundidade de cama de rato sujo fresco de ratos fêmeas em uma gaiola estática limpa sem cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com roupa de cama suja de rato por 2h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Inclinação da gaiola de 30°: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola em casa em uma gaiola estática limpa com roupa de cama do mouse, sem incluir os filhotes de rato. Incline a gaiola a 30° contra a parede por 2h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Mudanças frequentes de roupa de cama: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola doméstica em uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Substitua a cama do rato por roupa de cama de rato limpo a cada 10 minutos por 2 h. Durante as trocas de cama do mouse, coloque delicadamente os ratos em uma gaiola limpa diferente para evitar contato direto com os ratos. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Remoção de roupa de cama: Coloque os ratos junto com seus homólogos da gaiola doméstica em uma gaiola estática limpa vazia (sem cama de rato ou nestlets) por 2h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Movimento no shaker: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola em casa em uma gaiola estática limpa com roupa de cama do mouse, sem incluir os filhotes de rato. Coloque a gaiola estática em cima de um agitador de laboratório recíproco definido para 140 tacadas por minuto por 2 h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Exposição noturna às luzes: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola em casa em uma gaiola estática limpa com roupa de cama do rato, sem incluir os filhotes de rato. Mantenha as luzes acesas durante a noite (20:00 h-06:00 h) para interferir com o ciclo escuro. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Mudança do companheiro de gaiola: Transfira o rato para uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato que está sendo alojada por um grupo diferente de duas fêmeas (fêmeas intactas que não fazem parte do tratamento ou grupo controle). Mantenha o rato na gaiola estática com companheiros de gaiola desconhecidos durante a noite. Devolva o mouse para sua gaiola doméstica com suas contrapartes específicas da gaiola doméstica na conclusão do estressor.
- Exposição à roupa de cama molhada: Encha a gaiola estática com cama de rato com água limpa mantida a 24 °C até que a cama esteja saturada de água. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com roupas de cama molhadas durante a noite. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Exposição a objetos estranhos (mármores ou legos): Coloque seis bolinhas de gude (14 mm de diâmetro) ou seis legos (diferentes formas, não excedendo 4 cm de altura) distribuídos aleatoriamente em uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com objetos estranhos por 2 h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
- Durante o paradigma CGS, mantenha os ratos de controle imperturbáveis em suas gaiolas dentro da sala de alojamento.
- Substitua as gaiolas domésticas usadas por novas gaiolas domésticas no G10.5. No G17.5, ao final do estressor noturno, abrigam todos os ratos experimentais para se prepararem para a parturição e avaliações funcionais a jusante.
6. Monitoramento dos camundongos experimentais durante o paradigma CGS
- Monitore os camundongos a cada 1h durante a aplicação do estressor, exceto durante a noite.
- Exclua os camundongos que exibem sinais de socorro, incluindo feridas, letargia ou qualquer anormalidade física do experimento. Entre em contato com a equipe veterinária conforme necessário.
7. Medir o ganho percentual de peso corporal durante a gestação nos camundongos experimentais (opcional)
- No G6.5, pese os camundongos individualmente antes da exposição aos estressores. No G17.5, ao final do estressor noturno, pesam os ratos individualmente. Pesar os camundongos de controle nos pontos de tempo gestacionais equivalentes.
- Meça o ganho percentual de peso corporal durante a gestação, definindo o peso do primeiro dia do paradigma CGS (G6.5) em 100%.
8. Medir os pesos da glândula suprarrenal relativa pós-parto em camundongos experimentais (opcional)
- No pós-parto dia 2 (PP2), pese o controle e as barragens cgs individualmente. Eutanize as barragens por inalação de dióxido de carbono seguida de deslocamento cervical em um capô de fumaça.
- Coloque os camundongos em uma placa de dissecção, esterilize a área abdominal com 70% de etanol e abra a cavidade abdominal usando uma tesoura para fazer um corte vertical. Isole as glândulas suprarrenais localizadas adjacentes ao polo anterior dos rins com fórceps, bilateralmente. Dissecar cuidadosamente o tecido adiposo ao redor das glândulas suprarrenais sob um microscópio dissecando.
- Pesar as glândulas suprarrenais bilaterais individualmente. Calcule os pesos relativos da glândula suprarrenal em miligramas por grama (peso total das glândulas suprarrenais direitas e esquerdas/peso corporal).
9. Medir a atividade do eixo adrenal hipotálamo hipotálamo pós-parto (HPA) nos camundongos experimentais (opcional)
- Em preparação para as medições do eixo HPA, eutanize ninhadas a 6 filhotes por ninhada no pós-parto dia 0 (PP0). Use inalação de dióxido de carbono, seguida de decapitação com tesoura cirúrgica como método secundário de eutanásia.
- No pós-parto dia 2 (PP2), contenha individualmente o controle e as barragens CGS dentro de um tubo cônico de polipropileno bem ventilado de 50 mL por 20 minutos. Imediatamente após o estresse de contenção, remova o rato do tubo cônico e contenha o rato com a mão não dominante segurando a pele solta sobre os ombros e posterior para as orelhas para ter a pele sobre a mandíbula esticada.
- Puna a veia submandibular com uma lanceta ligeiramente atrás da mandíbula, mas anterior ao canal auditivo. Coletar até 100 μL de sangue materno em um tubo separador de soro. Após a coleta da amostra, aplique pressão suave com gaze no local da punção para parar o sangramento. Devolva as barragens para a gaiola quando o sangramento parar.
- Centrifugar o tubo separador de soro a 21.130 x g por 6 min e remover cuidadosamente o soro. Armazene o soro a -20 °C para uso posterior. Meça a concentração de corticosterona sérico por um kit ELISA seguindo o protocolo do fabricante.
10. Medir as mudanças comportamentais pós-parto nos camundongos experimentais (opcional)
- Para se preparar para a análise comportamental, o abate de ninhadas para 6 filhotes por ninhada em PP0.
- Realizar a análise da fragmentação do cuidado materno do PP2 ao PP5. Em cada dia, durante o ciclo de luz, expõe as barragens à sala de testes por um período de 5 minutos de habituação antes de filmar o comportamento materno por um período de 30 minutos.
- Avalie a fragmentação do cuidado materno medindo o comprimento médio de uma luta individual de lambida/preparação e o número total de ataques realizados pelas barragens19.
NOTA: O comportamento de lambida/limpeza é definido como um comportamento onde a represa está fazendo contato com o corpo do filhote com a língua, ou o filhote está sendo manuseado pela represa com suas patas dianteiras. Um ataque é definido como um período ininterrupto de tempo onde a represa está engajada na lambida/preparação de seus filhotes.
- Avalie a fragmentação do cuidado materno medindo o comprimento médio de uma luta individual de lambida/preparação e o número total de ataques realizados pelas barragens19.
- Realizar análise de anedonia via teste de preferência de sacarose (SPT) do PP0 ao PP6. Exponha as barragens a uma garrafa de 100 mL de água limpa e uma garrafa de 100 mL de solução de sacarose de 4% em sua gaiola doméstica. Meça a quantidade de água e sacarose consumidas (em mL) diariamente. Intercambie a colocação da garrafa na gaiola. Calcule a preferência de sacarose utilizando as médias dos últimos 4 dias: preferência % = [(consumo de sacarose / sacarose + consumo de água) x 100].
- Realize a análise do comportamento semelhante à ansiedade através de um labirinto zero elevado (EZM) em PP8. Coloque as barragens individualmente no aparelho EZM composto por dois quadrantes fechados e dois quadrantes abertos elevados do chão. Permita que as barragens explorem o labirinto sem ser incomodado por 5 minutos. Quantifique o tempo gasto no quadrante aberto e o número de entradas nos quadrantes abertos.
11. Medir as alterações do peso da prole pós-natal (opcional)
- Para se preparar para a análise do peso da prole, o abate de ninhadas para 6 filhotes por ninhada no dia do nascimento (pós-natal dia 0, PN0).
- Registo o peso dos filhotes em PN0 e em diferentes pontos de tempo durante o pós-natal (PN2, 7, 15, 21).
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Representative Results
Expor os camundongos gestantes ao CGS resulta em alterações nos parâmetros crônicos de estresse relevantes, incluindo a redução do ganho de peso corporal durante a gravidez (Figura 2A) e o aumento dos pesos da glândula suprarrenal no período pós-parto(Figura 2B)19. É importante ressaltar que a exposição ao CGS resulta em anormalidades pós-parto na função neuroendócrina materna. As barragens CGS exibem um eixo HPA hiperativo, evidenciado pelo aumento dos níveis de corticosterona sérico após a aplicação de um novo insulto agudo(Figura 3)19.
Expor os camundongos gestantes ao CGS resulta ainda em anormalidades comportamentais no período pós-parto inicial que parecem refletir o surgimento de um fenótipo depressivo. As barragens CGS apresentam alterações no cuidado materno, refletidas pelo aumento do grau de fragmentação dos sinais maternos recebidos pelos filhotes. A duração média das lutas de lambida/preparação é reduzida e associada a um aumento no número médio de ataques após o CGS, indicando numerosos episódios curtos de comportamento de nutrição (Figura 4A,B)19. A preferência por sacarose também é deprimida nas barragens CGS quando comparadas com as barragens de controle, sugerindo a presença de anedonia (Figura 4C)19. Por fim, as barragens CGS também apresentam comportamentos relacionados à ansiedade aumentados, medidos pela redução do tempo gasto nos quadrantes abertos do EZM quando comparados às barragens de controle (Figura 4D)19.
Na prole, a exposição ao CGS no útero resulta em diminuição do ganho de peso durante o pós-natal, do pós-natal de 7 a 21 anos, embora não sejam observadas alterações ao nascer. Essa redução do ganho de peso corporal está presente na prole de ambos os sexos (Figura 5)19. Note-se que o paradigma CGS não teve qualquer efeito sobre o comprimento gestacional, tamanho do lixo ou razão sexual por ninhada (dados não apresentados)19.
Figura 1: Esquema de paradigma CGS e avaliações funcionais para validação. Este número foi modificado de Zoubovsky, S.P. et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações nos parâmetros crônicos relacionados ao estresse nas barragens após a exposição ao CGS. (A) Variação do peso corporal de G6.5-G17,5, Controle = 17, CGS = 17. (B) Pesos relativos da glândula suprarrenal materna em PP2, Controle = 20, CGS = 15. Dados apresentados como média + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Este número foi modificado de Zoubovsky, S.P. et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medições do eixo HPA materno após a exposição ao CGS. Níveis de corticosterona sérico materno medidos após 20 min de estresse de contenção em PP2, Controle = 8, CGS = 5. Dados apresentados como média + SEM. *p < 0,05. Este número foi modificado de Zoubovsky, S.P. et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações comportamentais no período pós-parto inicial nas barragens após a exposição cgs. (A) Duração média e (B) número de lutas de lambida/limpeza registradas a partir de PP2-PP5, Controle = 17, CGS = 17. (C) Preferência por sacarose percentual em SPT, Controle = 17, CGS = 19. (D) Quantidade total de tempo gasto no quadrante aberto da EZM durante o período de 5 min, Controle = 17, CGS = 19. Dados apresentados como média + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Este número foi modificado de Zoubovsky, S.P. et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Alterações no peso corporal da prole durante o desenvolvimento pós-natal após a exposição no útero ao CGS. O peso corporal da prole medido de PN0 a PN21, Control = 17 ninhadas, CGS = 17 ninhadas. Dados apresentados como média + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Este número foi modificado de Zoubovsky, S.P. et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Expor os camundongos gestantes à CGS perturba a função neuroendócrina materna pós-parto, incluindo a resposta do eixo HPA a novos estressores, e está associada a várias anormalidades comportamentais relevantes para o humor perinatal e transtornos de ansiedade. Dado que o modelo emprega a utilização de um fator de risco ambiental, espera-se maior variação fenotípica do que observada de outra forma nos modelos genéticos22. No entanto, os resultados obtidos a partir da aplicação do paradigma CGS podem ser consistentes entre os laboratórios de pesquisa se for tomado cuidado para minimizar variáveis que possam confundir resultados.
As etapas críticas do protocolo incluem etapas relacionadas às práticas gerais de pecuária, incluindo ratos de controle de habitação separados dos ratos CGS e etapas de acasalamento cronometrado. O controle de co-habitação e os camundongos CGS poderiam, por si só, ser um estímulo estressante para o grupo controle e, portanto, confundir resultados neuroendócrinos ou comportamentais23,24. Da mesma forma, não é recomendado iniciar experimentos com camundongos gestantes enviados do fornecedor. Para maximizar a eficiência dos acasalamentos cronometrados, recomenda-se abrigar camundongos adultos juntos pelo menos 2 semanas antes de configurar acasalamentos cronometrados para sincronizar seus ciclos de estrus. Da mesma forma, o uso de camundongos adultos sexualmente experientes e a prevenção de machos de acasalar pelo menos uma semana antes da criação de acasalamentos cronometrado maximizarão sua fertilidade e aumentarão o potencial para gravidezes bem sucedidas. O cronograma do paradigma CGS também deve ser cuidadosamente seguido. A aplicação desses estressores de intensidade variada muito cedo na gestação pode afetar a decidualização uterina e inibir a implantação de embriões25. A exposição ao estresse durante diferentes janelas do tempo gestacional também tem sido encontrada para transportar risco variado de doença neurodesenvolvimentar específica para a prole, onde os descendentes masculinos são significativamente mais vulneráveis do que os descendentes femininos a estressores durante a gestação precoce26,27. O cronograma do CGS deve ser desenhado de tal forma que garanta imprevisibilidade para impedir o desenvolvimento de mecanismos de adaptação e aclimatação frequentemente associados à exposição repetida a estressores previsíveis28. Por fim, as ninhadas devem ser abatidas para seis filhotes no dia do nascimento para garantir condições comparáveis em todas as barragens e evitar que as variabilidades do tamanho do lixo envergonhem o hormônio materno ou a análise comportamental. Da mesma forma, diferentes coortes devem ser empregadas para avaliações neuroendócrinas e comportamentais para minimizar os efeitos confusos do estresse de contenção e sangramentos submandibulares no comportamento. Diferentes coortes também devem ser utilizadas para avaliação do cuidado materno e análise de outros parâmetros comportamentais para minimizar a interrupção da interação materna com os filhotes.
Existem várias limitações ao protocolo atual. A incapacidade de prever com precisão o número de camundongos gestantes antes do início do paradigma CGS pode representar um considerável fardo financeiro e de uso animal. Modificações poderiam ser feitas no protocolo para alcançar um sucesso mais previsível com acasalamento cronometrado, incluindo a avaliação da citologia vaginal para identificar camundongos em estágio estrus, onde tanto o acasalamento quanto a ovulação normalmente ocorrem29. O exame ultrasonográfico dos camundongos também pode ser incorporado ao paradigma CGS como uma técnica alternativa não invasiva para identificar com precisão as gestações a partir dos estágios muito iniciais da gestação30. O uso de alimentos especiais de reprodução, com maior teor de gordura, também tem sido empregado por outros grupos para melhorar o sucesso do acasalamento31. No entanto, deve-se ter cuidado ao instituir mudanças na dieta, uma vez que isso pode afetar a reatividade e o comportamento do estresse materno32. Além disso, o protocolo atual tem se mostrado eficaz em camundongos do tipo selvagem C57BL/6, mas modificações do protocolo podem ser necessárias para diferentes cepas ou origens genéticas, bem como espécies, pois podem ter grandes variações na sensibilidade ao estresse, cuidados maternos e regulação emocional.
Em comparação com os modelos de estresse periparto existentes atualmente, o paradigma CGS revela-se mais relevante traduzicamente, dado os endofenótipos relevantes para a doença observados, incluindo aumento da reatividade do estresse materno e anormalidades pós-parto no cuidado materno, anedonia e ansiedade. Essas alterações parecem recapitular os achados clínicos associados ao humor perinatal e transtornos de ansiedade. Aplicações futuras deste modelo incluem a utilização do paradigma CGS para identificar efeitos específicos do sexo do estresse psicossocial materno no desenvolvimento cerebral da prole e na suscetibilidade da doença. O estudo dos efeitos do CGS na função placentária deve ser considerado, uma vez que a disfunção nas principais funções placentárias tem sido demonstrada para impactar o desenvolvimento cerebral fetal33. A incorporação de experimentos de fomento cruzado com o paradigma CGS ajudaria ainda mais a entender as contribuições individuais na exposição do uterório CGS e as alterações hormonais maternas associadas versus anormalidades pós-parto na formação do comportamento na formação do desenvolvimento emocional dos filhos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o apoio do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais T32 GM063483-14 e da Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati. Para dados adaptados de Zoubovsky et al., 2019, a Licença Comum Criativa pode ser encontrada no seguinte local: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
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