Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En rask, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyse for et Multiplexed Bead-basert flytanalysesystem

Published: April 6, 2021 doi: 10.3791/62487
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

Et strømningsanalysesystem for perlebaserte multipleksede analyser som gir en to-reporter-avlesning ble brukt til utvikling av multipleks serologiske og antistoffnøytraliseringsanalyser som samtidig kan måle nøytraliserende IgG- og IgM-antistoffer for SARS-CoV-2.

Abstract

COVID-19-pandemien har understreket behovet for raske høygjennomstrømningsmetoder for sensitiv og spesifikk serologisk deteksjon av infeksjon med nye patogener, for eksempel SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testing kan være spesielt nyttig fordi den samtidig kan analysere antistoffer mot flere antigener som optimaliserer patogendekningen, og kontroller for variasjon i organismen og den enkelte vertsresponsen. Her beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende mikrosfærebasert analyse som kan oppdage både IgM- og IgG-antistoffer mot tre store SARS-CoV-2 antigener- spike (S) protein, spike angiotensin-konverterende enzym-2 (ACE2) reseptorbindingsdomene (RBD) og nukleocapsid (Nc). Analysen viste seg å ha sammenlignbar ytelse med en SARS-CoV-2 referanseanalyse for IgG i serum oppnådd ved ≥21 dager fra symptomde begynnelse, men hadde høyere følsomhet med prøver samlet inn ved ≤5 dager fra symptomde begynnelse. Videre, ved hjelp av løselig ACE2 i et nøytraliseringsanalyseformat, ble hemming av antistoffbinding demonstrert for S og RBD.

Introduction

COVID-19-pandemien har understreket viktigheten av å raskt utvikle og implementere raske, høygjennomstrømningstester med høy ytelse som kan brukes til diagnostisering og overvåking av nye patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testing kan være ekstremt nyttig i en pandemi, da den samtidig kan analysere antistoffer mot flere antigener, noe som gir bred patogendekning og kontroller for variasjon i organismen og vertsresponsen på infeksjon. Utviklingen av en multipleks fluorescerende perlebasert analyse, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), som kan oppdage antistoffer mot spike (S) proteinet, spike angiotensin-konverterende enzyme-2 (ACE2) reseptorbindingsdomene (RBD) og nukleocapsid (Nc) av SARS-CoV-2 ble nylig rapportert1. 3Flex ble vist å ha sammenlignbar ytelse med en referanse SARS-CoV-2 IgG-analyse for serum oppnådd ved ≥21 dager fra symptomde begynnelse, men hadde høyere følsomhet med prøver samlet inn ved ≤5 dager fra symptomde begynnelse. I tillegg ble hemming av antistoffbinding demonstrert for S- og RBD-antigener ved bruk av løselig ACE2 i et nøytraliseringsanalyseformat. Multiplex perlebasert teknologi har blitt allment tatt i bruk som en anerkjent teknologi for multiks serologisk testing og har klare fordeler for storskala screening, inkludert korte tid-til-resultater, små utvalgskrav og redusert arbeidskraft2,3,4.

Nylig har et nytt strømningsanalyseinstrument blitt tilgjengelig som gir samme høy-plex, høy gjennomstrømningsevne som systemet demonstrerte i tidligere arbeid1, men med den ekstra fordelen av to reporterkanaler. Evnen til å måle to fluorescerende reportersignaler i en enkelt reaksjon tillater vurdering av to resultater per analytt for hver prøve og er ideell for isotypingsapplikasjoner, som vanligvis må utføres i separate reaksjonsbrønner5. Den doble reporterkapasiteten gir dobbelt så mye data for hvert utvalg i halvparten så mange reaksjonsbrønner med halvparten av kravene til prøvevolum, og har dermed en klar fordel i forhold til enkeltreportersystemer. Denne studien beskriver standard serologisk analyseprotokoll og beskriver tilpasningen til en nøytraliseringsanalyse. I tillegg beskriver denne rapporten konverteringen av enkeltreporteranalysen til en dobbel reporter serologisk analyse, og deretter en dual reporter nøytraliseringsanalyse, for samtidig å måle nøytraliserende antistoffer av både IgG- og IgM-isotyper mot SARS-CoV-2 S, RBD og Nc antigener. Du finner en visuell oversikt over analyseprotokollen i figur 1.

Protocol

Resterende humane serumprøver som tidligere ble testet for SARS-CoV-2 diagnostiske analyser ble brukt i denne studien som ble godkjent av University of Rochester Institutional Review Board.

1. Reagenser og utstyr

  1. Få coronavirus antigener og menneskelig IgG og IgM fra kommersielle kilder.
  2. Få analysekontroll (AC) perlesett (45 og 220) fra instrumentleverandøren. AC-perlesettet 45 overvåker MFI-samlingen (Median Fluorescence Intensity) på RP1-instrumenter (Single Reporter Channel). AC-perlesettet 220 overvåker MFI-samlingen på den andre reporterkanalen (RP2).
  3. Få deteksjonsantistoffer og antigenspesifikk kanin sera og antistoffer som brukes til koblingsbekreftelse.
  4. Utfør deteksjonen med biotin-merkede antistoffer med enten en streptavidin, R-phycoerythrin conjugate (SAPE) eller en streptavidin konjugat av fluorophore Super Bright 436 (SASB; eksitasjon ved 405 nanometer (nm) og utslipp ved 436 nm).
  5. Oppnå humant ACE2-protein (dvs. SARS-reseptoren). Før bruk rehydreres lyofilisert ACE2-protein ved oppløsning til en konsentrasjon på 1 mg/ml i nukleasefritt vann (ikke DEPC-behandlet, autoklaved og 0,2-μm sterilt filtrert) og oppbevares ved 4 °C.
  6. Utfør alle reaksjoner i 96-brønns ikke-bindende overflate (NBS) svarte flatbunnsplater. Forsegle platene med 96 brønnmikroplate aluminiumsforseglingstape for analyseinkubasjonstrinn. Bruk en magnetisk plateseparator for analysevasktrinnene.

2. Antigen-koblet og antistoff-koblet kontroll perler forberedelse

  1. Kombiner magnetiske, polystyren- og fargekodede mikrosfæresett (6,5-μm diameter) med S-, RBD- og Nc-antigener som beskrevet i Cameron et al.1. Coronavirus antigener er koblet på 10 pmol/106 perler (S) og 100 pmol/106 perler (RBD og Nc). Kontrollperler kombinert med menneskelig IgG eller IgM genereres som tidligere beskrevet1. IgG og IgM er koblet til 5 μg/106 perler.
  2. Etter kobling, bestem perlekonsentrasjonene og fortynn hvert lager til 1 x 106 perler / ml ved hjelp av beskrevne prosedyrer6.
  3. Utfør bekreftelse av antigenkobling med antigenspesifikke antistoffer fra kanin eller med positiv menneskelig sera som beskrevet i Cameron et al.1.
    1. Bekreft menneskelig IgG-kobling med analysens biotinylerte anti-menneskelige IgG/SAPE-deteksjonsreagenser, og IgM-kobling med en fycoerythrin (PE)-merket geit antimenneskelig IgM.
      MERK: Koblingsbekreftelse utføres ved hjelp av en titrering av proteinspesifikk serum eller antistoff, fordi den optimale konsentrasjonen som skal brukes til disse reagensene ikke er kjent. For serum brukes serielle foldfortynning, mens for antistoffer som leveres som mg / ml-lagre, brukes seriell μg / ml fortynningsserie.
  4. Fortynn analysekontroll (AC) perler som overvåker MFI-samlingen i de to reporterkanalene til en konsentrasjon på 1 x 106 perler / ml før bruk i multiplex perleblandinger.

3. Fersk multiplex perle blanding forberedelse

  1. Forbered multiplex perler blander seg fersk hver dag fra den enkelte koblede perle og kontroll perle aksjer på 1 x 106 perler / ml.
    MERK: Multiplex perleblandinger er forberedt på å levere 2500 perler for hver perleregion i et 50 μL volum. Beregninger for hvordan du forbereder multiplex perleblandinger for en rekke reaksjoner er beskrevet i bloggen publisert av Angeloni (2020)6.

4. Prøvefortynning

  1. Forbered en 1:100 serumprøvefortynning ved å blande 10 μL serum i 990 μL fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 0,05% Tween 20, 0,02% natriumazid og 1% bovint serumalbumin (BSA) (PBS-TBN-buffer).
  2. Fortynn prøvene igjen 10 ganger ved å tilsette 20 μL av 1:100 fortynning til 180 μL PBS-TBN.
    MERK: Serumprøver består av negativ sera, fra prøver samlet inn i 2019 før COVID-19-pandemien, og positiv sera fra SARS-CoV-2 PCR-positive pasienter, som representerer lave og høye antistofftitratorer. Positive prøver ble samlet inn mellom ≈3 og >60 dager fra symptomdempet (DFSO). Alle serumprøver og IgG-strippet negativ kontrollserva fortynnes til 1:1000 som beskrevet nedenfor. For nøytraliseringsanalyser fortynnes sera 1:500 som beskrevet i nøytraliseringsprotokollene nedenfor (avsnitt 6 og 8).

5. Enkeltreporter serologisk analyseprotokoll

  1. Tilsett 50 μL multiplex perleblanding til hver tildelt brønn av en 96-brønns ikke-bindende mikrotiterplate.
  2. Pipette 50 μL av 1:1000 serum eller PBS-TBN i de aktuelle brønnene; Den endelige fortynning av serum i brønnen er 1:2000.
  3. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  4. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
  5. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
  6. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  7. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (første inkubasjonsvask etter prøve).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på platemagneten i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  8. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (andre inkubasjonsvask etter prøve).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på platemagneten i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Fjern platen fra magneten.
  9. Lag en ny blanding av biotin-anti-menneskelig IgG med SAPE ved å fortynne antistoffet til 0,62 μg/ml og SAPE til 1 μg/ml. Tilsett 100 μL i hver brønn.
  10. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  11. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
  12. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
  13. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  14. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (første postdeteksjon av antistoffinkubasjonsvask).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på platemagneten i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  15. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (andre post-deteksjon antistoff inkubasjon vask).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 minutter for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Fjern platen fra magneten.
  16. Tilsett 100 μL PBS-TBN i hver brønn.
  17. Dekk med folietetning og rist i 2 min ved 37 °C.
  18. Fjern platen fra plate shaker. Fjern deretter folietetningen og les 50 μL av hver brønn på strømningsanalysatoren i henhold til brukerhåndboken. En kort beskrivelse er gitt nedenfor.
    1. Velg rullegardinmenyen øverst til venstre på skjermen, og naviger til Platekonfigurasjon.
    2. Velg Kjør plate.
    3. Velg Utløs-ikonet for å løse ut plateholderen.
    4. Legg platen på plateholderen, og velg Tilbaketrekk-ikonet for å trekke tilbake plateholderen.
    5. Velg Kjør-ikonet for å kjøre platen.

6. Protokoll for nøytralisering av enkeltreporter

  1. Forbered en frisk multipleksperleblanding som beskrevet i avsnitt 3 ovenfor.
  2. Fortynn pasienten og kontroller sera 1:500 som følger.
    1. Fortynn serum 1:100 ved å blande 10 μL serum i 990 μL PBS-TBN.
    2. Fortynn serumet ytterligere 5 ganger ved å tilsette 40 μL 1:100 serum i 160 μL PBS-TBN.
  3. Tilsett 50 μL multiplex perleblanding til hver tildelt brønn av en 96-brønns ikke-bindende mikrotiterplate.
  4. Tilsett 25 μL 2 μg/ml ACE2 fortynning til hver brønn.
  5. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 2 minutter med risting ved 600 o/min.
  6. Fjern platen fra plate shaker og fjern folietetningen.
  7. Tilsett 25 μL 1:500 serum eller PBS-TBN til de tildelte brønnene.
  8. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  9. For resten av analyseprosedyren følger du trinn 5.4 til 5.18.5 som beskrevet ovenfor.

7. Konvertering til en dobbel reporter IgG og IgM serologisk analyse

  1. Forbered antigenkoblede perler som beskrevet i avsnitt 2 ovenfor.
    MERK: Et ekstra perlesett, kombinert med menneskelig IgM, er inkludert for å overvåke for tilsetning av anti-IgM-deteksjonsreagenser, samt et ekstra AC-perlesett (220) for å overvåke innsamling av MFI for RP2. Alle perlebestander er på 1 x 106 perler / ml for inkludering i multiplex perleblandinger som beskrevet nedenfor.
  2. Forbered ferske multipleksperleblandinger som beskrevet i avsnitt 3 ovenfor.
  3. Fortynn serumprøver og IgG-strippet negativ kontrollserva 1:1000 som beskrevet i avsnitt 4 ovenfor.
  4. Tilsett 50 μL multiplex perleblanding til hver tildelt brønn av en 96-brønns ikke-bindende mikrotiterplate.
  5. Pipette 50 μL 1:1000 serum eller PBS-TBN til de aktuelle brønnene. Den endelige fortynning av serum i brønnen er 1:2000.
  6. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  7. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
  8. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
  9. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  10. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (første inkubasjonsvask etter prøve).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på platemagneten i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  11. Vask reaksjonsbrønnene igjen med PBS-TBN (andre inkubasjonsvask etter prøve), nøyaktig som beskrevet ovenfor i trinn 7.10.1-7.10.5.
  12. Fjern platen fra magneten.
  13. Lag en ny deteksjonsreagensblanding med den nødvendige kombinasjonen av reagenser og tilsett 50 μL eller 100 μL til hver brønn.
    MERK: Deteksjonsreagensblandinger som inneholder antimennesket IgG konjugert til Brilliant Violet 421 reporterfargestoff (BV; eksitasjon ved 405 nm og utslipp ved 421 nm) ble brukt ved 50 μL / brønn på grunn av begrensende mengder av de tilgjengelige lagerreagensene. Alle andre deteksjonsreagensblandinger brukes ved 100 μL/brønn.
  14. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  15. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
  16. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
  17. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  18. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor med PBS-TBN (første vask etter påvisning av antistoffinkubasjon).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Mens du beholder platen på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  19. Vask reaksjonsbrønnene igjen med PBS-TBN (andre vask etter påvisning av antistoffinkubasjon), nøyaktig som beskrevet ovenfor i trinn 7.17.1-7.17.5.
  20. Fjern platen fra magneten.
  21. Tilsett 100 μL PBS-TBN i hver brønn.
  22. Dekk med folietetning og rist i 2 min ved 37 °C.
  23. Fjern platen fra plate shaker. Fjern deretter folietetningen og les 50 μL av hver brønn på strømningsanalysatoren som beskrevet ovenfor i trinn 5.18.1-5.18-5.

8. Konvertering til dual reporter nøytralisering analyse

  1. Bruk de koblede perlene som beskrevet i trinn 7.1 ovenfor.
  2. Forbered en frisk multipleks perleblanding som beskrevet i trinn 7.2.
  3. Serumprøver og IgG-strippet negativ kontrollserva fortynnes 1:500 som følger.
    1. Forbered en 1:100 fortynning ved å blande 10 μL serum i 990 μL PBS-TBN.
    2. Fortynn 1:100-prøvene ytterligere 5 ganger ved å tilsette 40 μL av de 1:100 fortynningene til 160 μL PBS-TBN.
  4. Tilsett 50 μL multiplex perleblanding til hver tildelt brønn av en 96-brønns ikke-bindende mikrotiterplate.
  5. Tilsett 25 μL 2 μg/ml ACE2 fortynning til hver brønn.
  6. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 2 minutter med risting ved 600 o/min.
  7. Fjern platen fra plate shaker og fjern folietetningen.
  8. Tilsett 25 μL 1:500 serum eller PBS-TBN til de tildelte brønnene.
  9. Dekk platen med en folietetning og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  10. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
  11. Når platen er beholdt på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
  12. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  13. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (første postprøve inkubasjonsvask).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Når platen er beholdt på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  14. Vask reaksjonsbrønnene igjen med PBS-TBN (andre inkubasjonsvask etter prøve), nøyaktig som beskrevet ovenfor i trinn 8.13.1-8.13.5.
  15. Fjern platen fra magneten.
  16. Lag en ny deteksjonsreagensblanding med den nødvendige kombinasjonen av reagenser og tilsett 50 μL eller 100 μL til hver brønn.
    MERK: Deteksjonsreagensblandinger som inneholder antimennesket IgG som er konjugert til BV-reporterfargen, ble brukt ved 50 μL/brønn på grunn av begrensende mengder av de tilgjengelige lagerreagensene (se Materialfortegnelse). Alle andre deteksjonsreagensblandinger brukes ved 100 μL/brønn.
  17. Dekk platen med en mikroplatefolieforsegling og inkuber på en oppvarmet plate shaker ved 37 °C i 15 minutter med risting ved 600 o/min.
  18. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
  19. Når platen er beholdt på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
  20. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  21. Vask reaksjonsbrønnene som beskrevet nedenfor (først etter påvisning av antistoffinkubasjon).
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 min for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Når platen er beholdt på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Flekk platen på absorberende papir mens du fortsatt holder platen på magneten.
  22. Vask reaksjonsbrønnene igjen med PBS-TBN (andre vask etter påvisning av antistoffinkubasjon), nøyaktig som beskrevet ovenfor i trinn 8.21.1-8.21.5.
    1. Fjern platen fra platemagneten og tilsett 150 μL PBS-TBN til hver brønn.
    2. Dekk platen med en fersk folietetning og rist ved 37 °C i 2 minutter ved 600 o/min.
    3. Fjern platen fra plate shaker og plasser på den magnetiske plate separatoren i 2 minutter for å skille perlene fra reaksjonsblandingen.
    4. Når platen er beholdt på magneten, fjern folietetningen, snu platen forsiktig over en avfallsbeholder, og flikk forsiktig supernatanten ut av brønnene.
    5. Fjern platen fra magneten.
  23. Tilsett 100 μL PBS-TBN i hver brønn.
  24. Dekk med folietetning og rist i 2 min ved 37 °C.
  25. Fjern platen fra plate shaker. Fjern deretter folietetningen og les 50 μL av hver brønn på strømningsanalysatoren som beskrevet ovenfor i trinn 5.18.1-5.18-5.

Representative Results

Optimalisering av Single Reporter Serological Assay.
Koblingsstrategien for alle SARS-CoV-2 antigener er beskrevet i Cameron, et al., 20201 og i trinn 2.1 ovenfor. Strategien for koblingsbekreftelse er beskrevet i trinn 2.3 ovenfor. For en effektiv kobling bør median fluorescensintensitet (MFI)-verdiene være betydelig høyere enn ingen serum/ingen antistoffnegative kontrollreaksjon(er) og bør demonstrere en doserespons av synkende MFI-signal med avtagende mengder deteksjonsreagens. MFI-er på ca. 1000 MFI-enheter eller mer over bakgrunnen MFI indikerer generelt effektiv proteinkobling og er avhengig av konsentrasjonen og spesifisiteten til deteksjonsreagenset som brukes. Ved hjelp av denne metoden ble bekreftelse av S-, RBD- og nc-antigenkobling testet for to mange perler (figur 2). MFI-signalene for alle antigener var signifikant høyere enn bakgrunnen MFI og viste en doserespons med titrering av deteksjonsreagensene. Dataene viste også god reproduserbarhet av MFI-nivåer mellom de to forskjellige mange koblede perlene.

Optimalisering av enkeltreporteranalysen ble gjort som beskrevet i Cameron, et al., 20201. Hvert antigen ble testet ved forskjellige koblingskonsentrasjoner med forskjellige fortynninger av flere serumprøver som representerer høye, middels, lave og negative prøver. I tillegg, fordi analysen måler IgG-titere, ble et IgG-strippet serum brukt som en ekstra negativ prøve. Resultater av en representativ prøvefortynningsserie med forskjellige antigenkoblingsnivåer er vist i figur 3. Denne første fortynningsserien ble testet med en fast konsentrasjon av deteksjonsreagenser for å få et potensielt utvalg av representative antigenspesifikke og bakgrunns-MFI-nivåer. Fra disse dataene ble ytterligere prøvefortynningsområder og antigenkoblingsnivåer bestemt og testet videre med ytterligere prøver (data ikke vist).

Deretter ble konsentrasjonen av deteksjonsreagenset optimalisert for bruk med de forskjellige serumfortynningene og antigenkoblingsnivåene. Representative data som bruker 6 positive og 2 negative prøver, vises i figur 4. Etter ytterligere testing med flere hundre negative pre-COVID-19 serumprøver ble de endelige optimale antigenkoblingsnivåene og deteksjonsregentkonsentrasjonene valgt ut til den endelige analyseprotokollen, som beskrevet i avsnitt 5.

Konvertering til en enkelt reporternøytraliseringsanalyse
Konvertering av enkeltreporterens serologiske analyse til en nøytraliseringsanalyse ble oppnådd ved å legge til et inkubasjonstrinn ved hjelp av ACE2 (som et konkurrerende reagens) med perlene før du legger til serumprøven. Ved å titrere mengden ACE2 som tilsettes, ble hemming av IgG-binding til S- og RBD-antigener observert, som vist i figur 5. Mens 11 pasientsera hadde forskjellige titere av IgG, viste hver en betydelig nedgang i MFI-signalet med økende ACE2-konsentrasjon. Som forventet påvirker ACE2 bare MFI-signalene til S og RBD, men ikke nc-antigenet.

MFI-signalet i prosent i forhold til 0 μg/ml ACE2 for alle prøver er vist i figur 6. For de fleste prøver ble det observert et signaltap >30% for S og RBD med økende ACE2-konsentrasjon. Som forventet var det ingen effekt av ACE2 på Nc-signalet.

Konvertering til en dobbel reporter IgG og IgM serologisk analyse
For den doble reporteren IgG og IgM-analysen ble standard enkeltreporteranalysetilstander brukt til å teste forskjellige antistoff- og reporterkombinasjoner for de to reporterkanalene. RP1-kanalen ligner på tidligere strømningsanalyseinstrumenter med deteksjon av "oransje" fluorescens for reporterfarger som PE. Den andre kanalen, RP2, bruker en fiolett eksitasjonslaser som kan brukes til å oppdage den "blå" fluorescensen av fargestoffer som er begeistret ved 402 nm med utslippsspektratopper i 421-441 nm-serien.

Flere forskjellige anti-menneskelige IgG- og IgM-antistoffkombinasjoner ble testet ved ulike konsentrasjoner med standard 2000 ganger prøvefortynning og inkubasjonsforhold beskrevet i avsnitt 6. En første test av anti-IgM konjugert til DyLight 405 reporter fargestoff (DL 405; eksitasjon ved 400 nm og utslipp på 420 nm) for RP2-kanalen ble utført ved hjelp av et sett med 11 PCR-positive prøver med DFSO fra 5 til >60 dager, og en IgG-strippet serumprøve. Dette deteksjonsreagenset ga ikke et høyt signal i RP2-kanalen som vist i figur 7A,B,C. For prøver med høy IgM RP2 MFI ble de høyeste signalene sett for RBD og Nc (Figur 7B,C). Mens IgM-titere skulle heves på dette tidspunktet i noen prøver, oversteg de observerte MFI-nivåene ikke 140 MFI-enheter med IgM-deteksjonsreagenset. Videre manglet kontrollperlen for IgM et betydelig dynamisk område for MFI ved bruk av DL 405 konjugert til anti-IgM sammenlignet med en PE-merket anti-IgM RP1-reporter som ble brukt ved de samme konsentrasjonene (Figur 7D).

Fordi et egnet RP2-reportermerket deteksjonsreagens for IgM ikke var tilgjengelig, ble den originale biotin anti-IgG med SASB testet for bruk i RP2-kanalen. Signalet for IgG i RP2-kanalen med SASB hadde ikke samme dynamiske område som med SAPE, men det hadde fortsatt et passende område for måling av IgG-titere for S, RBD og Nc (Figur 8). Disse dataene førte til testing av forskjellige RP1 IgM- og RP2 IgG-deteksjonsreagenskombinasjoner, som beskrevet nedenfor.

Konvertering til dual reporter nøytralisering analyse
Den doble reporter serologiske analysen ble konvertert til en nøytraliseringsanalyse ved å legge til et inkubasjonstrinn med ACE2 og perler, før du legger til serumprøven. En 2 ganger fortynningsserie med ACE2 fra og med 16 μg/ml ble brukt, og deretter testet med sett med 11 prøver og strippet sera som beskrevet ovenfor. I tillegg ble 3 forskjellige kombinasjoner av RP1 IgM og RP2 IgG-deteksjonsantistoffblandinger testet på et sett med 11 prøver og stripete serumkontroller. De endelige kombinasjonene og reagenskonsentrasjonene som er fastslått å være optimale, er beskrevet i tabell 1.

For IgG-deteksjon ble biotinet antimennesket IgG/SASB som ble brukt i den opprinnelige enkeltreporteranalysen testet sammen med en annen anti-IgG som ble konjugert til BV-reporterfargen. Mens BV-konjugaten hadde høye RP2 MFI-signaler, varierte MFI-signalintensiteten for IgG-titer på tvers av ACE2-titreringene (Figur 9A, C, E). Kombinasjonen av biotin anti-human IgG/SASB hadde mer konsistent MFI-signalreduksjon på tvers av ACE2-titreringen sammenlignet med BV-konjugaten, noe som viste en doserespons, selv om MFI-nivåene var lavere. Signalsvingningene fra BV-konjugaten over ACE2-konsentrasjoner forstyrret også bestemmelsen av prosentandelinhibering av ACE2 på tvers av IgG-titere sammenlignet med kombinasjonen biotin anti-human IgG/SASB (Figur 9B,D,F). Prøver med lave MFI-signaler, for eksempel DFSO 3-prøven, har ikke høye nok titere til å evaluere ytelsen til disse reagensene eller måle IgG-nøytraliserende kapasitet.

For å bestemme IgM-titere i RP1-kanalen ble en PE-konjugert anti-IgM sammenlignet med en antimenneskelig IgM som ble konjugert til DyLight 549 reporterfargestoff (DL 549; eksitasjon ved 562 nm og utslipp ved 576 nm) ved konsentrasjonene som er oppført i tabell 1. Av disse to reagensene viste PE anti-IgM høyere MFIer enn de som ble generert av DL 549 antimenneskelig IgM for prøvene som ble testet (Figur 9A, C, E). IgM-kontrollperlen som målte tilsetningen av disse reagensene hadde forskjellige gjennomsnittlige MFIer på ≈ 17 000 for PE anti-IgM og 2723 for DL 549-konjugaten. Selv med disse forskjellene var virkningen av de forskjellige ACE2-konsentrasjonene på MFI målbar med DL 549-konjugaten. For å bestemme ACE2 prosent hemming av IgM binding, var det en liten, men ubetydelig forskjell mellom de to IgM deteksjon reagenser (Figur 9B,D, F).

Kombinasjon Reporter Endelig konsentrasjon i brønn (μg/ml)
RP1 RP2
1 PE anti-IgM 2 -
Biotin-Ig - 0.62
SASB - 4
2 DyLight 549 Antimenneskelig IgM 1 -
Strålende Fiolett 421 Antimenneskelig IgG - 1
3 DyLight 549 Antimenneskelig IgM 1 -
Biotin-Ig - 0.62
SASB - 4

Tabell 1: Liste over fargekombinasjoner for RP1 og RP2-reportere som er testet. Flere forskjellige RP1- og RP2-reporterfarger ble evaluert for måling av IgG- og IgM-titere. De tre kombinasjonene vist ovenfor ble testet i forskjellige RP1-deteksjonsmoduser og for optimalisering av nøytraliseringsanalysen. For RP2-kombinasjoner som bruker SASB, er konsentrasjoner for biotinylert deteksjonsantistoff og SASB vist. *Endelig konsentrasjon representerer den endelige konsentrasjonen i reaksjonsbrønnen.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema som uthever hovedtrinnene i analyseprotokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bekreftelse av antigenkobling. Antigener ble koblet til ved 100, 10 og 1 pmol/106 perler. For S- og RBD-antigener ble kanin anti-S sera brukt og påvist med PE anti-kanin IgG. For Nc ble det brukt en Protein G-renset kaninpolyklonal anti-Nc. Titreringskurvene for perler kombinert med 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) og 100 pmol Nc (C) vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Optimalisering av serumfortynning med forskjellige antigenkoblingsnivåer. Serumprøver som representerer høye, mellomstore, lave og negative prøver ble testet med de forskjellige pmolantigen/106 perlekoblingene. En 4 ganger serumtitrering ble testet med en multipleksblanding av antigenkoblede perler ved hjelp av analyseprotokollen beskrevet i avsnitt 5. MFI-verdiene for titreringskurvene for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bestemmelse av optimal serumfortynning og deteksjonsreagenskonsentrasjon. Åtte serumprøver, inkludert negative pasienter (2 prøver) og lav- til høypositive (6 prøver), ble testet ved ytterligere serumfortynning med tre forskjellige deteksjonsreagenskonsentrasjoner. MFI-resultatene vises for S (A), RBD (B) og Nc (C). Basert på disse og andre data (ikke vist), ble det valgt en prøvefortynning på 1:2000 og en biotindeteksjonsantistoffkonsentrasjon på 0,62 μg/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Optimalisering av enkeltreporternøytraliseringsanalyse. Modifikasjon av enkeltreporterens serologiske analyse til en nøytraliserende antistoffdeteksjonsanalyse ble utført ved å legge til et inkubasjonstrinn med ACE2 som konkurrent, som beskrevet i avsnitt 6. Et sett med 11 prøver, alt fra lav- til høypositiv titer sera, og en IgG-stripet serumprøve ble testet med en todelt fortynningsserie av ACE2 som starter på 4 μg / ml, ved hjelp av standard analyseforhold. På tvers av dette området med ACE2-konsentrasjoner kan en reduksjon i MFI ses med økt ACE2 for S (A) og RBD (B), men ikke for Nc (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Prosentinhibering av signal med ACE2. Restsignalene for prosent for settet med 11 prøver (fra figur 4) vises. For hver prøve, uavhengig av IgG-titeren, ble det oppnådd en maksimal reduksjon på ≥30% MFI-signal for S (A) og RBD (B) ved den høyeste ACE2-konsentrasjonen. For nc antigen (C) var det ingen signifikant hemming av signal med noen mengde ACE2 testet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Test av DyLight 405 anti-IgM som RP2 IgM deteksjonsreagens. Et sett med 11 prøver og IgG-strippet sera ble brukt til å teste DL 405-konjugert anti-IgM som et RP2-deteksjonsreagens. RP2 IgM MFI-signalene for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Det høyeste MFI-signalet for ethvert antigen med en prøve var ca. 140 MFI-enheter for RBD med prøve H (B). Selv signalet på IgM-kontrollperlesettet var mindre enn 1000 MFI i RP2-kanalen over hele antistofftitlerområdet og viste ikke det økte dynamiske området som ble observert med PE anti-IgM-deteksjonsantistoffet i RP1-kanalen (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Optimalisering av SASB som RP2-reporter med Biotin anti-IgG. Et sett med 11 prøver og IgG-strippet sera ble brukt til å teste en fortynningsserie av SASB med standard 0,62 μg/ml biotin anti-IgG. De resulterende IgG MFIene i RP2-kanalen for S (A), RBD (B) og Nc (C) vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Sammenligning av tre forskjellige kombinasjoner av RP1 IgM- og RP1 IgG-deteksjonsblandinger. Tre forskjellige påvisningsantistoffblandinger ble testet på 11 prøver og IgG strippet sera. Kombinasjonene og de endelige konsentrasjonene som brukes er beskrevet i tabell 1. Alle prøver ble testet med en 2 ganger ACE2 fortynning, fra 16 μg/ml. Data for prøver ved DFSO på 3, 12 og 30 dager vises. MFI-signalene for RP1 IgM (oransje) og RP2 IgG (blå) vises i A (DFSO 3), C (DFSO 12) og E (DFSO 30). ACE2 prosent gjenværende MFIer vises i B (DFSO 3), D (DFSO 12) og F (DFSO 30). Signaler som representerer en reduksjon på >30 % sammenlignet med ingen ACE2-kontroller, er uthevet lysegrønne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Denne studien utvidet funksjonaliteten til en multipleks fluorescerende mikrosfæreanalyse, 3Flex, som kvalitativt vurderer IgG-responsen på infeksjon av SARS-CoV-21. Mens mange serologiske analyser for COVID-19 oppdager et enkelt antigen, evaluerer denne analysen samtidig S-, RBD- og Nc-antigener, og inkluderer en intern antistoffisotypekontroll7. I tillegg brukes ACE2 som en indikator for å oppdage nøytraliserende antistofftitratorer til SARS-CoV-2.

Multiantigenanalyser kan være spesielt nyttige i fremtiden for å diskriminere immunresponser mellom smittede og vaksinerte personer. Med SARS-CoV-2, hvis bare S- og RBD-antistoffer evalueres, ville det være umulig å skjelne om dette skyldtes en tidligere infeksjon eller en vaksinasjonsantistoffrespons. Ingen av vaksinene som for tiden er i bruk retter seg mot nc-antigenet, så ved å evaluere S/RBD- og Nc-antigener er det mulig å skille tidligere virusinfeksjon (nc- og S/RBD-positiv) fra en vaksinasjonsrespons (kun S/RBD-positiv; Nc-negativ).

I den nåværende studien ble 3Flex serologiske og nøytraliseringsanalyser (avsnitt 5 og 6) overført til et nytt dobbelt reporterstrømningsanalyseinstrument (avsnitt 7 og 8). Typiske immunoassayprotokoller for perlebaserte multipleksanalyser ligner på standard ELISA-protokoller, etter sammenlignbare trinn for prøveinkubasjon, deteksjonsantistoff/reporterinkubasjon og analyse av resultatene8. Tidligere studier har også vist hvordan standard ELISA-analyser kan overføres til en perlebasert multipleksingsplattform9.

Analyseprotokollene kan overføres sømløst fra forgjengerens enkeltreporterinstrument til det nye dobbeltreportersystemet, som vist i resultatene som er oppnådd for testprøvene og kontrollene (figur 4 og figur 5). I den serologiske analysen viste alle positive serumprøver en karakteristisk doseresponsiv reduksjon i signalet som tilsvarer både en høyere prøvefortynning og en lavere deteksjonsantistoffkonsentrasjon, mens signalene for de negative prøvene forble på bakgrunnsnivå. Tilsvarende, for nøytraliseringsanalysen, bemerket synkende signaler for S og RBD, men ikke Nc, økende konsentrasjoner av ACE2-konkurrenten, mens IgG-strippet serum var mye mindre påvirket av tillegg av ACE2. Pre-inkubering av perler med ACE2 i 2 min før tilsetning av serumprøven (som beskrevet i avsnitt 6 og 8), ble også sammenlignet med å kombinere perlene med ACE2 og serum samtidig og ga liten forskjell i resultatene (data ikke vist). Men fordi resultatene oppnådd med perlene pluss ACE2 pre-inkubasjonstrinn var mer konsistente, var det den endelige prosedyren som ble vedtatt for nøytraliseringsanalyseprotokollen (avsnitt 6 og 8).

Fordi det doble reportersystemet inkorporerer en annen fluorescerende reporterkanal, ble begge analysene konvertert til isotypinganalyser for samtidig å måle både IgG- og IgM-svar. Den doble reporterfunksjonaliteten til strømningsanalysatoren gjør det mulig å samle fluorescerende signaler fra to reporterdeteksjonsreagenser for hver analytt i multipleksen for hver prøve, og effektivt doble dataene som genereres per prøve i en analyse. For utvikling og optimalisering av de doble reporteranalyseprotokollene ble flere kommersielt tilgjengelige reporterfarger og deteksjonsantistoffer evaluert for den nye RP2-kanalen (figur 7 og figur 8) for å finne de beste alternativene som er tilgjengelige. Anti-IgM-antistoffet som ble konjugert med DL 405-reporterfargen, fungerte ikke bra i RP2-kanalen (figur 7), så biotin anti-IgG med SASB ble senere evaluert for deteksjon i RP2-kanalen (figur 8). Tre kombinasjoner av RP1- og RP2-deteksjonsreagenser ble sammenlignet i dual reporternøytraliseringsanalysen (tabell 1 og figur 9) for å finne de beste kombinasjonene for samtidig påvisning av IgG- og IgM-nøytraliserende antistoffer. Mens det var signifikante forskjeller i signalintensiteten mellom RP1-kanalen ved hjelp av PE-anti IgM og RP2-kanalen ved hjelp av DL 549 anti-IgM, var det ingen signifikant forskjell i målingen av prosentandelbindingshemmingen av ACE2.

Flere begrensninger i dagens metode og denne studien er anerkjent. Først ble prøvene testet og brukt i metodeutvikling og optimalisering begrenset til sett med 8-11 prøver. Flere prøver vil bli testet i utvidede studier for å bekrefte at metoden er fullt optimalisert. For det andre ble et begrenset antall reporterfluoreoriforer og reporterpar testet. Videre testing av alle tilgjengelige reportere i alle mulige kombinasjoner vil avgjøre hvilke reagenser som kan brukes med hell i denne metoden. Anti-IgG-antistoffet som ble konjugert til biotin var forskjellig fra anti-IgG-antistoffet som ble konjugert til BV 421-reporteren. Så selv om variasjon i signalintensiteten for BV 421 anti-IgG eksisterte, kan det skyldes antistoffets spesifisitet og ikke relatert til reporterfargen. Testing av andre tilgjengelige BV 421-konjugiserte antistoffer kan identifisere et annet antistoff som vil fungere godt i RP2-kanalen. Fremtidige studier vil også evaluere kombinasjonen av PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG for deteksjon i henholdsvis RP1 og RP2. Til slutt, selv med instrumentets doble reporterkapasitet, er analysene begrenset til to isotyper (to parametere) per reaksjon. Hvis ytterligere isotyper skal måles eller full isotyping ønskes, må ytterligere reaksjoner ved hjelp av de samme to reporterkanalene kjøres i separate brønner.

Perlebasert multipleksingsteknologi gir rask og fleksibel analysedesign med enkel implementering i rutinemessige laboratoriearbeidsflyter3,4,10. Denne studien viste hvor enkelt det var å overføre de tidligere beskrevne 3Flex serologiske og nøytraliseringsanalysene for SARS-CoV-2 til et strømningsanalysesystem for måling av IgG med en enkelt reporter, eller med liten modifikasjon, samtidig som både IgG- og IgM-svarene ble målt ved hjelp av to reportere. Alternativet for dobbel reporter har klare fordeler i forhold til enkeltreporterplattformer fordi det kan gi dobbelt så mye data per prøve, ved hjelp av halvparten av prøvevolumet, og i halvparten av antall reaksjonsbrønner. Med de riktige reporterfargene og deteksjonsantistoffene kan isotypingsanalyser enkelt utvikles og utføres på det doble reporterstrømningsanalyseinstrumentet.

Disclosures

Stephen Angeloni og Sherry Dunbar er ansatte i Luminex Corporation som produserer noen av reagensene og instrumentene som ble brukt i denne studien. Open Access-publisering av denne artikkelen ble sponset av Luminex Corporation

Acknowledgments

Denne rapporten ble finansiert av Luminex Corporation (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) for vitenskapelig redigeringshjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACE2 (human) (rec.) AdipoGen Life Sciences AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-065-098
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A7888 Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3650
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile Corning 6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-506-129 Discontinued but available from multiple vendors
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate ThermoFisher Scientific 62-4317-82
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker ThermoFisher Scientific 02-217-757 Fisher Scientific
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE ThermoFisher Scientific P-2771MP
Luminex Magnetic Plate Separator Luminex Corporation CN-0269-01
MagPlex beads Luminex Corporation MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-116-129
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma P3813 Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56683 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56049 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified
SARS Spike Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56047 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Spike Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56048 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb SinoBiological 40150-R007
Sodium Azide MilliporeSigma S2002 Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) ThermoFisher Scientific S21388 premium grade
Tube Revolver/ Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
TWEEN 20 MilliporeSigma P9416 Sigma-Aldrich
xMAP Antibody Couplng Kit Luminex Corporation 40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE Luminex Corporation INTELLIFLEX-DRSE-RUO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
  2. Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
  3. Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 170 multipleks mikrosfære perle SARS-CoV-2 serologisk analyse nøytraliseringsanalyse
En rask, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyse for et Multiplexed Bead-basert flytanalysesystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Angeloni, S., Cameron, A., Pecora,… More

Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System. J. Vis. Exp. (170), e62487, doi:10.3791/62487 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter