Summary
SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。
Abstract
COVID-19パンデミックは、SARS-CoV-2のような新しい病原体による感染の敏感で特異的な血清学的検出のための迅速なハイスループット方法の必要性を強調している。多重血清学的検査は、病原体のカバレッジを最適化する複数の抗原に対する抗体を同時に分析し、生物および個々の宿主応答の変動を制御することができるため、特に有用である可能性があります。ここでは、3つの主要なSARS-CoV-2抗原-スパイク(S)タンパク質、スパイクアンジオテンシン変換酵素-2(RB2)受容体結合ドメイン(RBD)、およびヌクレオキャプシド(Nc)に対するIgM抗体およびIgG抗体の両方を検出できるSARS-CoV-2-Plex蛍光微小球ベースのアッセイについて述べた。このアッセイは、症状発症から ≥21日目に得られた血清中のIgGのSARS-CoV-2基準アッセイに匹敵する性能を有することが示されたが、症状発症から≤5日で採取されたサンプルでより高い感受性を有していた。また、中和アッセイ形式で可溶性ACE2を用い、SおよびRBDに対する抗体結合の阻害が実証された。
Introduction
COVID-19パンデミックは、SARS-CoV-2などの新しい病原体の診断と監視に使用できる高速で高スループットで高性能な血清学的検査を迅速に開発し、実施できることの重要性を強調しています。多重血清学的検査は、複数の抗原に対する抗体を同時に分析できるため、大流行において非常に有用であり、広範な病原体のカバレッジを提供し、生物のばらつきと感染に対する宿主の反応を制御します。多重蛍光ビーズベースアッセイの開発により、スパイク(S)タンパク質に対する抗体を検出できるSARS-CoV-2 IgG 3Flex(3Flex)、スパイクアンジオテンシン変換酵素-2(ACE2)受容体結合ドメイン(RBD)、およびSARS-CoV-2のヌクレオキャプシド(Nc)が最近報告された。3Flexは、症状発症から21日目 ≥に得られた血清に対するSARS-CoV-2 IgGアッセイに匹敵する性能を有することが示されたが、症状発症から≤5日で採取されたサンプルでより高い感度を有していた。さらに、中和アッセイ形式で可溶性ACE2を用いたSおよびRBD抗原に対する抗体結合の阻害が実証された。マルチプレックスビーズベースの技術は、多重血清学的検査のための実証済みの技術として広く採用されており、短時間から結果までの結果、小さなサンプル要件、および削減された労働2、3、4を含む大規模スクリーニングのための明確な利点を有する。
最近では、前作1で示したシステムと同じ高プレックス、ハイスループット能力を提供する新しいフロー分析計測器が利用可能になりましたが、2つのレポーターチャンネルの利点が追加されました。1つの反応で2つの蛍光レポーター信号を測定する能力は、各サンプルの検体当たり2つの結果の評価を可能にし、アイソタイピング用途に理想的であり、通常は別々の反応ウェル5で行う必要がある。デュアルレポーター機能は、サンプル量要件の半分の反応井戸の半分の2倍のデータをサンプルに提供するため、単一のレポーターシステムに対して明確な利点があります。本研究は、標準的な血清学的アッセイプロトコルを詳述し、中和アッセイへの適応について説明する。さらに、このレポートでは、単一レポーターアッセイをデュアルレポーター血清学的アッセイに変換し、その後、デュアルレポーター中和アッセイを使用して、IGGおよびIgMアイソタイプの両方の中和抗体を同時に測定する方法を説明しています。アッセイプロトコルの視覚的概要を 図1に示します。
Protocol
以前にSARS-CoV-2診断分析でテストされた残留ヒト血清サンプルは、ロチェスター大学機関審査委員会によって承認されたこの研究で使用されました。
1. 試薬・装置
- 商業的な供給源からコロナウイルス抗原およびヒトIgGおよびIgMを得る。
- 測定器ベンダーからアッセイ制御(AC)ビーズセット(45および220)を入手します。ACビードセット45は単一のレポーターチャネル(RP1)の器械の中央値蛍光強度(MFI)コレクションを監禁する。AC ビード セット 220 は、2 番目のレポーター チャネル(RP2)で MFI コレクションを監視します。
- 結合確認に用いる検出抗体及び抗原特異的ウサギセラ及び抗体を取得する。
- ストレプトアビジン、R-フィコエリスリンコンジュゲート(SAPE)またはフルオロフォアスーパーブライト436(SASB;405ナノメートル(nm)での励起および436nmの放出のいずれかとビオチン標識抗体で検出を行う。
- ヒトACE2タンパク質(すなわち、SARS受容体)を得る。使用前に、凍結乾燥したACE2タンパク質をヌクレアーゼフリー水(DEPC処理せず、オートクレーブされ、0.2-μm滅菌濾過)に溶解し、4°Cで保存します。
- 96ウェル非結合面(NBS)黒の平底プレートですべての反応を行います。プレートを96ウェルマイクロプレートアルミニウムシールテープでシールし、アッセイインキュベーションステップを行います。アッセイ洗浄工程には磁気プレートセパレータを使用してください。
2. 抗原結合および抗体結合対照ビーズ製剤
- キャメロン等に記載されているように、磁気、ポリスチレン、および色分けされた微小球セット(直径6.5μm)とS、RBD、およびNc抗原を共有結合する。コロナウイルス抗原は、10 pmol/106 ビーズ(S)および100 pmol/106 ビーズ(RBDおよびNc)で結合される。ヒトIgGまたはIgMと結合したコントロールビーズは、前述の1のように生成される。IgGとIgMは5 μg/106 ビーズで結合されます。
- カップリング後、ビーズ濃度を決定し、記載の手順6を使用して各ストックを1 x 106 ビーズ/mLに希釈します。
- キャメロンら 1 に記載されているようにウサギまたは陽性ヒトセラからの抗原特異的抗体との抗原結合の確認を行う。
- アッセイのビオチン化抗ヒトIgG/SAPE検出試薬とのヒトIgG結合、およびフィコエリスリン(PE)標識ヤギ抗ヒトIgMとのIgM結合を確認します。
注:結合確認は、これらの試薬に使用する最適濃度が不明であるため、タンパク質特異的血清または抗体の滴定を使用して行われます。血清には、シリアルフォールド希釈液が使用され、mg/mLストックとして供給される抗体には、シリアルμg/mL希釈系列が使用されます。
- アッセイのビオチン化抗ヒトIgG/SAPE検出試薬とのヒトIgG結合、およびフィコエリスリン(PE)標識ヤギ抗ヒトIgMとのIgM結合を確認します。
- マルチプレックスビーズミックスで使用する前に、2つのレポーターチャンネルのMFI収集を1 x 106 ビーズ/mLの濃度まで監視する希薄アッセイ制御(AC)ビーズ。
3. フレッシュマルチプレックスビーズミックスの準備
- 個々の結合ビーズから毎日新鮮なマルチプレックスビーズミックスを準備し、1 x 106 ビーズ/mLでビーズストックを制御します。
注:マルチプレックスビーズミックスは、各ビーズ領域に対して2,500個のビーズを50 μLボリュームで供給できるように用意されています。任意の数の反応に対してマルチプレックスビーズミックスを準備する方法の計算は、アンジェニ(2020)6によって公開されたブログに記載されています。
4. サンプル希釈
- 10 μL の血清を、0.05% Tween 20、0.02% アジドナトリウム、1% のウシ血清アルブミン (BSA) (PBS-TBN バッファー) を含む 990 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に混合して、1:100 血清サンプル希釈を調製します。
- 1:100希釈液20μLをPBS-TBNの180 μLに加えて、サンプルを再び10倍に希釈します。
注:血清サンプルは、2019年にCOVID-19パンデミック以前に採取した標本から、低および高抗体価を表すSARS-CoV-2 PCR陽性患者からの陽性血清から構成されています。陽性試料は、症状発症から≈3日から>60日(DFSO)の間で採取した。すべての血清試料およびIgG剥ぎ取り陰性対照血清は、以下に記載されるように1:1000に希釈される。中和アッセイの場合、セラは、以下の中和プロトコル(セクション6および8)に記載されているように1:500希釈される。
5. 単一記者血清学的アッセイプロトコル
- 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。
- ピペット50 μLの1:1000血清またはPBS-TBNを適切なウェルに入れ、ウェル内の血清の最終的な希釈は1:2000です。
- プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1回試料後培養洗浄)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(第2回ポストサンプルインキュベーション洗浄)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石からプレートを取り外します。
- 抗体を0.62 μg/mL、SAPEを1 μg/mLに希釈して、SAPEとビオチン抗ヒトIgGを新たに組み合わせます。各ウェルに100 μLを加えます。
- プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1の検出後抗体インキュベーション洗浄)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(第2の検出後抗体インキュベーション洗浄)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、磁気プレート分離器の上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石からプレートを取り外します。
- 各ウェルにPBS-TBNの100 μLを加えます。
- ホイルシールで覆い、37°Cで2分間振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り外します。その後、ホイルシールを取り外し、ユーザーマニュアルに従ってフローアナライザ上の各ウェルの50 μLを読み取ります。簡単な説明を以下に示します。
- 画面の左上隅にあるドロップダウン メニューを選択し、[ プレート設定] に移動します。
- [ プレートの実行] を選択します。
- プレートキャリアを 取り出すには、イジェクト アイコンを選択します。
- プレートキャリアにプレートをロードし、プレートキャリアを 引き込むには、リトラクト アイコンを選択します。
- [ 実行 ]アイコンを選択して、プレートを実行します。
6. 単一記者中和アッセイプロトコル
- 上記のセクション3で説明したように、新鮮なマルチプレックスビーズミックスを準備します。
- 患者を希釈し、次のようにセラ1:500を制御します。
- 10 μLの血清をPBS-TBNの990 μLに混合して、血清1:100を希釈した。
- 1:100血清40μLをPBS-TBNの160 μLに加えて、さらに5倍の希釈液を使用します。
- 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。
- 2μg/mL ACE2希釈液を25μLずつ加えます。
- プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで2分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、ホイルシールを取り外します。
- 割り当てられたウェルに1:500血清またはPBS-TBNの25 μLを加えます。
- プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- アッセイ手順の残りの部分については、上記の手順5.4~5.18.5に従ってください。
7. デュアルレポーターIgGとIgM血清学的アッセイへの転換
- 上述のセクション2に記載されているように、抗原結合ビーズを準備します。
注:人間のIgMと組み合わせた追加のビーズセットは、抗IgM検出試薬の追加を監視するために含まれており、また、RP2用MFIのコレクションを監視するための追加のACビードセット(220)が含まれています。すべてのビーズの在庫は、以下に説明するマルチプレックスビーズミックスに含めるために1 x 106 ビーズ/mLにあります。 - 上記のセクション3で説明したように、新鮮なマルチプレックスビーズミックスを準備します。
- 上記のセクション4に記載されているように、希薄血清サンプルおよびIgG剥離陰性対照血清1:1000。
- 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。
- ピペット50 μLの1:1000血清またはPBS-TBNを適切なウェルにする。ウェル内の血清の最終的な希釈は1:2000です。
- プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1回試料後培養洗浄)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- PBS-TBN(第2のポストサンプルインキュベーション洗浄)で再び反応ウェルを洗浄し、手順7.10.1-7.10.5で前述したとおりに洗います。
- 磁石からプレートを取り外します。
- 必要な試薬の組み合わせで新しい検出試薬ミックスを作成し、各ウェルに50 μLまたは100 μLを加えます。
注:ブリリアントバイオレット421レポーター色素に結合した抗ヒトIgGを含む検出試薬混合物(BV;405nmで励起し、421nmで放出)は、在庫試薬の量が制限されているため、50μL/wellで使用されました。他のすべての検出試薬の混合物は100 μL/wellで使用される。 - プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- PBS-TBN(抗体インキュベーション検出後の最初の洗浄)で、下記のように反応ウェルを洗浄する。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- PBS-TBN(抗体インキュベーションの検出後の第二の洗浄)で再度反応ウェルを洗浄し、手順7.17.1-7.17.5で上述したとおりに洗浄します。
- 磁石からプレートを取り外します。
- 各ウェルにPBS-TBNの100 μLを加えます。
- ホイルシールで覆い、37°Cで2分間振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り外します。次にホイルシールを取り外し、手順5.18.1~5.18-5で説明したように、フローアナライザで各ウェルの50 μLを読み取ります。
8. デュアルレポーター中和アッセイへの転換
- 上記のステップ 7.1 で説明した結合ビーズを使用します。
- ステップ 7.2 で説明したように、新しいマルチプレックスビーズミックスを準備します。
- 血清サンプルおよびIgG剥がされた陰性対照血清は、次のように1:500希釈される。
- 10 μLの血清をPBS-TBNの990 μLに混合して、1:100希釈を準備します。
- 1:100希釈液の40μLをPBS-TBNの160 μLに加えて、さらに5倍に希釈します。
- 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。
- 2μg/mL ACE2希釈液を25μLずつ加えます。
- プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで2分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、ホイルシールを取り外します。
- 割り当てられたウェルに1:500血清またはPBS-TBNの25 μLを加えます。
- プレートにホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1ポストサンプルインキュベーション洗浄)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- PBS-TBN(第2のポストサンプルインキュベーション洗浄)で再び反応ウェルを洗浄し、手順8.13.1-8.13.5で前述したとおりに洗浄します。
- 磁石からプレートを取り外します。
- 必要な試薬の組み合わせで新しい検出試薬ミックスを作成し、各ウェルに50 μLまたは100 μLを加えます。
注:BVレポーター色素に結合した抗ヒトIgGを含む検出試薬混合物は、利用可能な在庫試薬の量が制限されているため、50 μL/wellで使用されました( 材料表を参照)。他のすべての検出試薬の混合物は100 μL/wellで使用される。 - プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- 反応ウェルを以下のように洗浄する(まず抗体インキュベーション検出後)。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。
- 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。
- 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。
- PBS-TBN(抗体インキュベーションの検出後の2回目の洗浄)で再び反応ウェルを洗浄し、手順8.21.1-8.21.5で上記の詳細に記載されているとおりに洗浄します。
- プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。
- 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り出し、磁気プレート分離器の上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。
- 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。
- 磁石からプレートを取り外します。
- 各ウェルにPBS-TBNの100 μLを加えます。
- ホイルシールで覆い、37°Cで2分間振ります。
- プレートシェーカーからプレートを取り外します。次にホイルシールを取り外し、手順5.18.1~5.18-5で説明したように、フローアナライザで各ウェルの50 μLを読み取ります。
Representative Results
単一レポーター血清学的アッセイの最適化。
すべてのSARS-CoV-2抗原の結合戦略は、キャメロン、ら、20201 および上記のステップ2.1に記載されている。カップリング確認のストラテジーは、上記のステップ2.3で説明します。効率的なカップリングのために、蛍光強度の中央値(MFI)値は、無血清/抗体非陰性対照反応よりも有意に高く、検出試薬量の減少に伴うMFIシグナルの低下の用量応答を示すべきである。約1,000 MFI単位以上のMFI単位のMFIは、一般的に効率的なタンパク質結合を示し、使用される検出試薬の濃度および特異性に依存する。この方法を用いて、S、RBD、Nc抗原結合の確認を2ロットのビーズについて試験した(図2)。全ての抗原に対するMFIシグナルは、バックグラウンドMFIより有意に高く、検出試薬の滴定による用量応答を示した。データはまた、結合ビーズの2つの異なるロット間のMFIレベルの良好な再現性を示した。
単一のレポーターアッセイの最適化は、キャメロン、他、20201.各抗原は、高、中、低、および陰性のサンプルを表すいくつかの血清サンプルの異なる希釈を有する異なる結合濃度で試験した。また、アッセイはIgGの測定用のIgGの測定を行うので、IgG剥がされた血清を追加の陰性試料として用いた。異なる抗原結合レベルを有する代表的なサンプル希釈系列の結果を図3に示す。この初期希釈シリーズは、代表的な抗原特異的およびバックグラウンドMFIレベルの潜在的範囲を得るために、検出試薬の固定濃度で試験された。これらのデータから、追加サンプル希釈範囲および抗原結合レベルを決定し、さらに追加サンプルで試験した(データは示されていない)。
次に、検出試薬の濃度を、異なる血清希釈および抗原結合レベルとの併用に最適化した。6 つの正と 2 つの負のサンプルを使用した代表的なデータを 図 4に示します。数百の陰性前COVID-19血清サンプルを用いた追加の試験の後、最終最適抗原結合レベルおよび検出摂起濃度を最終アッセイプロトコルに選択した。
単一レポーター中和アッセイへの転換
血清サンプルを添加する前に、ACE2(競合試薬として)を用いたインキュベーションステップを添加することにより、単一レポーター血清学的アッセイを中和アッセイに変換した。ACE2添加量を計数することにより、 図5に示すようにS抗原およびRBD抗原へのIgG結合の阻害が認められた。11人の患者セラはIgGの異なる力素を有していたが、それぞれACE2濃度の増加に伴ってMFIシグナルの有意な減少を示した。予想通り、ACE2はSおよびRBDのMFI信号にのみ影響を与えますが、Nc抗原には影響しません。
全サンプルの0 μg/mL ACE2 に対する MFI 残存率のパーセントを 図6に示します。ほとんどのサンプルでは、ACE2濃度の上昇に伴い、SおよびRBDに対してシグナル損失>30%が認められた。予想通り、NC信号にACE2の影響はなかった。
デュアルレポーターIgGとIgM血清学的アッセイへの転換
デュアルレポーターIgGおよびIgMアッセイでは、2つのレポーターチャネルの異なる抗体とレポーターの組み合わせをテストするために、標準的な単一のレポーターアッセイ条件を使用しました。RP1チャネルは、PEなどのレポーター色素の「オレンジ色」蛍光を検出した以前のフロー分析機器に似ています。第2チャネルRP2は、421-441 nm範囲の発光スペクトルピークを有する402nmで励起された色素の「青」蛍光を検出するために使用できる紫色励起レーザーを採用しています。
いくつかの異なる抗ヒトIgGおよびIgM抗体の組み合わせは、セクション6で詳述された標準的な2,000倍のサンプル希釈およびインキュベーション条件で様々な濃度で試験された。RP2チャネルに対するDyLight 405レポーター色素(DL 405;400nmでの励起および420nmでの放出)に結合した抗IgMの初期試験を、5〜>60日のDFSOを有する11個のPCR陽性サンプルとIgG-剥離血清サンプルを用いて実施した。この検出試薬は、図7A、B、Cに示すように、RP2チャネルに高い信号を生成しなかった。高いIgM RP2 MFIを有するサンプルでは、RBDおよびNc(図7B,C)に対して最も高い信号が見られた。IgMの気座は、この時点で一部のサンプルでは上昇する必要がありますが、観察されたMFIレベルはIgM検出試薬で140 MFI単位を超えませんでした。さらに、IgM用のコントロールビーズは、同じ濃度で使用されるPE標識アンチIgM RP1レポーターと比較して、反IgMに結合したDL 405を使用する場合のMFIに対する有意なダイナミックレンジを欠いていた(図7D)。
IgM用の適切なRP2レポーター標識検出試薬が利用できなかったため、SASBを用いた元のビオチン抗IgGをRP2チャネルで使用するための試験を行った。SASB を使用した RP2 チャネルの IgG の信号は、SAPE と同じダイナミック レンジを持っていませんが、S、RBD、Nc の IgG 力価を測定するのに適した範囲を持っていました (図 8)。これらのデータは、以下に説明するように、異なるRP1 IgMおよびRP2 IgG検出試薬の組み合わせをテストすることにつながりました。
デュアルレポーター中和アッセイへの転換
二重レポーター血清学的アッセイは、血清サンプルを添加する前に、ACE2およびビーズでインキュベーションステップを添加することによって中和アッセイに変換された。16 μg/mlから始まるACE2の2倍希釈シリーズを使用し、上記のように11サンプルのセットとセラを剥ぎ取った。さらに、RP1 IgMとRP2 IgG検出抗体ミックスの3つの異なる組み合わせが11サンプルのセットでテストされ、血清制御が除去されました。最適と判断された最終的な組み合わせと試薬濃度を 表1に詳述する。
IgG検出では、元の単一レポーターアッセイで使用されたビオチン抗ヒトIgG/SASBを、BVレポーター色素に結合した別の反IgGと共に試験した。BVコンジュゲートは高いRP2 MFI信号を持っていましたが、IgG滴定のMFI信号強度はACE2滴定にまたがって変化しました(図9A、C、E)。ビオチン抗ヒトIgG/SASBの組み合わせは、BVコンジュゲートと比較してACE2滴定全体でより一貫したMFIシグナル減少を示し、MFIレベルは低かったが用量応答を示した。ACE2濃度にわたるBVコンジュゲートによる信号変動はまた、ビオチン抗ヒトIgG/SASBの組み合わせと比較してIgG価の範囲にわたるACE2による阻害率を決定することを妨げた(図9B、D、F)。DFSO 3 サンプルのような低い MFI 信号を持つサンプルは、これらの試薬の性能を評価したり、IgG 中和能力を測定するのに十分な高力価を持っていません。
RP1チャネルにおけるIgMの測定のために、PE共役型反IgMをDyLight 549レポーター色素に結合した抗ヒトIgM(DL 549;562nmで励起し、576nmで放出する)と比較した。これら2つの試薬のうち、PE抗IgMは、テストしたサンプルに対してDL 549抗ヒトIgMによって生成されたものよりも高いMFIを表示した(図9A、C、E)。これらの試薬の添加を測定するIgMコントロールビーズは、PE抗IgMに対して≈17,000、DL 549コンジュゲートに対して2,723の異なる平均MFIを有していた。これらの違いがあっても、MFIに対する様々なACE2濃度の影響は、DL 549コンジュゲートで測定可能であった。IgM結合のACE2%阻害を決定するために、2つのIgM検出試薬の間にわずかな有意な差があった(図9B、D、F)。
| コンビネーション | 記者 | ウェルでの最終濃度(μg/mL) | |
| RP1 | RP2 | ||
| 1 | PEアンチIgM | 2 | - |
| ビオチン-Ig | - | 0.62 | |
| サスブ | - | 4 | |
| 2 | ダイライト 549 抗ヒト IgM | 1 | - |
| ブリリアントバイオレット421抗ヒトIgG | - | 1 | |
| 3 | ダイライト 549 抗ヒト IgM | 1 | - |
| ビオチン-Ig | - | 0.62 | |
| サスブ | - | 4 | |
表1:RP1とRP2レポーターの色素の組み合わせがテストされたリスト。IgGおよびIgMの測定用に、いくつかの異なるRP1およびRP2レポーター色素を評価した。上記の3つの組み合わせは、異なるRP1検出モードで、および中和アッセイの最適化のために試験した。SASBを用いたRP2の組み合わせについて、ビオチン化検出抗体およびSASBの濃度が示されている。*最終濃度は、反応ウェルの最終濃度を表します。
図1:主要なアッセイプロトコルステップを強調するフローチャート この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:抗原結合の確認 抗原は100、10および1 pmol/106 ビーズで結合した。SおよびRBD抗原については、ウサギの抗Sセラを使用し、PE抗ウサギIgGで検出した。Ncの場合、プロテインG精製ウサギポリクローナル抗Ncが使用された。10 pmol S(A)、100pmol RBD(B)、および 100 pmol Nc (C) と結合したビーズの滴定曲線を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:異なる抗原結合レベルでの血清希釈の最適化 高、中、低、および陰性のサンプルを表す血清サンプルを、異なるpmol抗原/106 ビーズカップリングで試験した。4倍の血清滴定を、セクション5に記載されたアッセイプロトコルを用いて、抗原結合ビーズのマルチプレックスミックスで試験した。S (A)、RBD(B)、Nc(C) の滴定曲線の MFI 値を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 最適な血清希釈および検出試薬濃度の測定 陰性患者(2サンプル)および低陽性から高陽性(6サンプル)を含む8つの血清サンプルを、3つの異なる検出試薬濃度を有する追加の血清希釈液で試験した。MFI の結果は、S (A) 、 RBD (B) および Nc (C) に対して表示されます。これらおよび他のデータ(図示せず)に基づいて、1:2,000のサンプル希釈と0.62μg/mLのビオチン検出抗体濃度を選択した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:単一レポーター中和アッセイの最適化中和抗体検出アッセイに対する単一レポーター血清学的アッセイの改変は、セクション6に記載されているように、競合者としてACE2とのインキュベーションステップを加えることによって行った。低陽性から高陽性の価数のサイターseraに至るまでの11サンプルのセットとIgGストライプの血清サンプルを、標準的なアッセイ条件を使用して、4 μg/mLから始まるACE2の2倍希釈シリーズで試験しました。ACE2濃度のこの範囲にわたって、MFIの減少は、S(A)およびRBD(B)の増加したACE2で見ることができますが、Nc(C)については見られません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ACE2によるシグナルの阻害率11個のサンプルのセットに対するパーセント残差信号(図4)を示します。各サンプルについて、IgGの測定器に関係なく、最高ACE2濃度のS(A)およびRBD(B)に対して≥30%MFIシグナルの最大減少が達成された。Nc抗原(C)については、ACE2の任意の量をテストしたシグナルの有意な阻害はなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: RP2 IgM検出試薬としてのDyLight 405抗IgMの試験11サンプルとIgGストリップセラのセットを使用して、DL 405結合抗IgMをRP2検出試薬として試験しました。S (A)、RBD(B)、Nc(C)のRP2 IgM MFI信号を示します。任意のサンプルを有する任意の抗原の最高のMFI信号は、サンプルH(B)を有するRBDのための約140 MFI単位であった。IgMコントロールビーズセット上のシグナルも、抗体価範囲全体にわたってRP2チャネル中の1,000MFI未満であり、RP1チャネル(D)においてPE抗IgM検出抗体で観察されたダイナミックレンジの増加を示さなかった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: ビオチン反IgGによるRP2レポーターとしてのSASBの最適化11個のサンプルとIgGストリップセラのセットを使用して、標準の0.62 μg/mLビオチン抗IgGを用いた希釈系のSASBを試験しました。結果として得られた IgG MFI は、S(A)、RBD(B)、Nc(C) の RP2 チャネルに表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:RP1 IgMとRP1 IgG検出ミックスの3つの異なる組み合わせの比較3つの異なる検出抗体ミックスを11個のサンプルとIgG剥離セラで試験した。使用される組み合わせと最終濃度は、表1に記載されています。すべてのサンプルは、16 μg/mLから始まる2倍のACE2希釈液で試験しました。3、12、および 30 日の DFSO でのサンプルのデータが示されています。RP1 IgM(オレンジ)およびRP2 IgG(青)のMFI信号は、A(DFSO 3)、C(DFSO 12)、およびE(DFSO 30)で示されています。 ACE2 パーセント残余 MFI は、B (DFSO 3)、D (DFSO 12)、およびF (DFSO 30) に示されています。 ACE2 コントロールなしと比較して>30%減少を表す信号は、ライトグリーンでハイライト表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
本研究は、SARS-CoV-21による感染に対するIgG応答を定性的に評価する多重蛍光微小球アッセイ3Flexの機能を拡張した。COVID-19に関する多くの血清学的アッセイは単一の抗原を検出するが、このアッセイは同時にS、RBD、Nc抗原を評価し、内部抗体アイソタイプコントロール7を含む。さらに、ACE2はSARS-CoV-2に対する中和抗体力素を検出する指標として使用されています。
多抗原アッセイは、感染者とワクチン接種者の免疫応答を識別するために、将来的に特に有用である可能性があります。SARS-CoV-2では、S抗体とRBD抗体のみが評価されれば、これが過去の感染によるものなのか、ワクチン接種抗体反応によるものなのかを見分けることは不可能です。現在使用されているワクチンはいずれもNc抗原を標的としませんので、S/RBDおよびNc抗原を評価することで、過去のウイルス感染(Nc-およびS/RBD陽性)とワクチン接種応答(S/RBD陽性のみ)を区別することが可能です。nc-負)。
現在の研究では、3Flex血清学的および中和アッセイ(セクション5および6)を新しいデュアルレポーターフロー分析装置(セクション7および8)に移した。ビーズベースの多重アッセイに対する典型的な免疫アッセイプロトコルは、標準的なELISAプロトコルに類似しており、サンプルインキュベーション、検出抗体/レポーターインキュベーション、および結果8の分析に対する同等のステップに従う。これまでの研究では、標準的なELISAアッセイをビーズベースの多重化プラットフォーム9に転送する方法も実証されています。
テストサンプルとコントロールの結果が示すように、アッセイプロトコルは、前身の単一レポーター装置から新しいデュアルレポーターシステムにシームレスに転送できます(図4 および 図5)。血清学的アッセイでは、すべての陽性血清サンプルは、より高いサンプル希釈と低い検出抗体濃度の両方に対応するシグナルの特徴的な用量応答性低下を示したが、陰性サンプルのシグナルはバックグラウンドレベルにとどまった。同様に、中和アッセイについては、SおよびRBDのシグナルを減少させるが、Ncではないが、ACE2競合の濃度の増加に対応したのに対し、IgGストリップ血清はACE2の添加による影響をはるかに少なかった。血清サンプルの添加前に2分間ACE2でビーズをプレインキュベート(セクション6および8に記載)も、ACE2と血清とビーズを同時に組み合わせたものと比較し、結果にほとんど差を生じなかった(データは示さない)。しかし、ビーズ+ACE2プレインキュベーションステップで得られた結果はより一貫していたため、中和アッセイプロトコル(セクション6および8)に採用された最終手順であった。
デュアルレポーターシステムは2つ目の蛍光レポーターチャンネルを組み込むため、両方のアッセイをアイソタイピングアッセイに変換してIgG応答とIgM応答の両方を同時に測定しました。フローアナライザのデュアルレポーター機能により、各サンプルのマルチプレックス内の各分析物に対して2つのレポーター検出試薬から蛍光シグナルを収集することができ、アッセイでサンプルごとに生成されるデータを効果的に倍増させることができます。デュアルレポーターアッセイプロトコルの開発と最適化のために、いくつかの市販のレポーター色素と検出抗体を新しいRP2チャネルについて評価し、利用可能な最良の選択肢を決定しました。DL 405レポーター色素と共役した抗IgM抗体は、RP2チャネル(図7)では良好に機能しなかったので、SASBを有するビオチン抗IgGは、その後RP2チャネルで検出について評価された(図8)。RP1とRP2検出試薬の3つの組み合わせを、デュアルレポーター中和アッセイ(表1および図9)で比較し、IgGおよびIgM中和抗体の同時検出に最適な組み合わせを決定しました。PE-anti IgMを用いたRP1チャネルとDL549反IgMを用いたRP2チャネルの間の信号強度には大きな差があったが、ACE2による結合阻害率の測定には有意差はなかった。
現在の方法とこの研究にいくつかの制限が認められています。まず、試験し、メソッド開発と最適化で使用したサンプルは、8-11サンプルのセットに限定されました。より多くのサンプルは、メソッドが完全に最適化されていることを確認するために、拡張された研究でテストされます。第二に、限られた数のレポーターフルオロフォアとレポーターペアをテストした。すべての可能な組み合わせで利用可能なすべてのレポーターのさらなるテストは、この方法で正常に使用できる試薬を決定します。ビオチンにコンジュゲートされた抗IgG抗体は、BV421レポーターにコンジュゲートされた抗IgG抗体とは異なっていた。したがって、BV 421抗IgGのシグナル強度にはばらつきが存在していたが、抗体の特異性に起因する可能性があり、レポーター色素とは関係ない。他の利用可能なBV 421結合抗体を試験すると、RP2チャネルで良好に作用する別の抗体を同定する可能性があります。今後の研究では、RP1とRP2で検出するためのBV 421抗ヒトIgGとのPE抗IgMの組み合わせをそれぞれ評価します。最後に、装置のデュアルレポーター機能を有しても、アッセイは反応ごとに2つのアイソタイプ(2つのパラメータ)に制限される。追加のアイソタイプを測定するか、完全なアイソタイピングが望ましい場合は、同じ2つのレポーターチャンネルを使用して追加の反応を別々のウェルで実行する必要があります。
ビーズベースの多重化技術は、ルーチンの実験室のワークフロー3、4、10に簡単に実装して迅速かつ柔軟なアッセイ設計を可能にします。本研究では、SARS-CoV-2に関する前述の3Flex血清学的および中和アッセイを、単一のレポーターでIgGを測定するフロー分析システムに、またはわずかな修正を行って、2人のレポーターを用いてIgG応答とIgM応答の両方を同時に測定する容易性を実証した。デュアルレポーターオプションは、サンプルあたりの2倍のデータをサンプルボリュームの半分、反応ウェルの半分の数で提供できるため、単一のレポータープラットフォームよりも明確な利点があります。適切なレポーター色素と検出抗体を使用すると、アイソタイピングアッセイを簡単に開発し、デュアルレポーターフロー解析装置で実行できます。
Disclosures
スティーブン・アンジェロニとシェリー・ダンバーは、この研究で使用された試薬や器具の一部を生産するLuminex Corporationの従業員です。この記事のオープンアクセス出版物は、ルミネックス株式会社が主催しました
Acknowledgments
このレポートは、ルミネックス株式会社(テキサス州オースティン)が資金を提供しました。著者らは、マシュー・シルバーマン博士(バイオメディカル・パブリッシング・ソリューションズ、デルレイ・ビーチ、フロリダ州)に科学的編集支援を感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
| Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
| Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
| Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
| DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
| DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
| eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
| Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
| Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
| MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
| PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
| Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
| Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
| xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
| xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |
References
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- Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
- Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
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