Summary
È ormai riconosciuto che l'ambiente tridimensionale delle cellule può svolgere un ruolo importante nel loro comportamento, maturazione e/o differenziazione. Questo protocollo descrive un modello di coltura cellulare tridimensionale progettato per studiare l'impatto del contenimento fisico e dei vincoli meccanici sui megacariociti.
Abstract
L'ambiente 3D che porta sia al confinamento che ai vincoli meccanici è sempre più riconosciuto come un importante determinante del comportamento cellulare. La cultura 3D è stata così sviluppata per affrontare meglio la situazione in vivo. I megacariociti si differenziano dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel midollo osseo (BM). Il BM è uno dei tessuti più molli del corpo, confinato all'interno dell'osso. Essendo l'osso scarsamente estensibile alla scala cellulare, i megacariociti sono contemporaneamente sottoposti a una debole rigidità e ad un elevato confinamento. Questo protocollo presenta un metodo per il recupero degli HSPC negativi al lignaggio di topo (Lin-) mediante selezione immunomagnetica e la loro differenziazione in megacariociti maturi in un mezzo 3D composto da metilcellulosa. La metilcellulosa non è reattiva nei confronti dei megacariociti e la sua rigidità può essere regolata a quella del midollo osseo normale o aumentata per imitare un midollo fibrotico patologico. Il processo di recupero dei megacariociti per ulteriori analisi cellulari è anche dettagliato nel protocollo. Sebbene l'estensione del proplatelet sia impedita all'interno dell'ambiente 3D, è descritto di seguito come risospendare i megacariociti in mezzo liquido e quantificare la loro capacità di estendere i proplatelet. I megacariociti cresciuti in idrogel 3D hanno una maggiore capacità di formare proplatelet rispetto a quelli coltivati in un ambiente liquido. Questa coltura 3D permette i) di differenziare i progenitori verso i megacariociti che raggiungono uno stato di maturazione più elevato, ii) di ricapitolare fenotipi che possono essere osservati in vivo ma passano inosservati nelle colture liquide classiche, e iii) di studiare le vie di trasduzione indotte dai segnali meccanici forniti da un ambiente 3D.
Introduction
Le cellule del corpo sperimentano un complesso microambiente 3D e sono soggette all'interazione tra segnali chimici e meccanofisici tra cui rigidità dal tessuto e confinamento dovuto alle cellule vicine e alla matrice circostante 1,2,3. L'importanza della rigidità e del confinamento per il comportamento cellulare è stata riconosciuta solo negli ultimi decenni. Nel 2006, il lavoro seminale di Engler et al. 4 ha evidenziato l'importanza dell'ambiente meccanico per la differenziazione cellulare. Gli autori hanno dimostrato che la variazione della rigidità del substrato cellulare ha portato all'orientamento delle cellule staminali verso vari lignaggi di differenziazione. Da allora, l'impatto dei segnali meccanici sul destino e sul comportamento cellulare è diventato sempre più riconosciuto e studiato. Nonostante sia uno dei tessuti più molli dell'organismo, il midollo osseo ha un'organizzazione strutturale 3D che è confinata all'interno dell'osso. La rigidità del midollo, sebbene tecnicamente difficile da misurare con precisione, si stima che si trovi tra 15 e 300 Pa 5,6. All'interno dello stroma, le cellule sono strettamente confinate l'una all'altra. Inoltre, la maggior parte di loro sta migrando verso i vasi sinusoidi per entrare nella circolazione sanguigna. Queste condizioni creano ulteriori vincoli meccanici sulle celle adiacenti, che devono adattarsi a queste forze. I segnali meccanici rappresentano un parametro importante le cui conseguenze sulla differenziazione dei megacariociti e sulla formazione di proplatelet sono state recentemente esplorate. Sebbene i megacariociti possano differenziarsi in vitro in coltura liquida tradizionale, non raggiungono il grado di maturazione osservato in vivo, in parte a causa dell'assenza di segnali meccanici dall'ambiente 3D 7. I progenitori in crescita incorporati nell'idrogel portano segnali meccanici 3D che mancano nell'ambiente liquido.
Gli idrogel sono stati ampiamente utilizzati per diversi decenni in campo ematologico, in particolare per far crescere le cellule in saggi di formazione di colonie per quantificare i progenitori ematopoietici. Tuttavia, tali idrogel sono stati raramente utilizzati per esplorare l'impatto biologico dell'ambiente meccanico 3D sulla maturazione e la differenziazione delle cellule ematopoietiche. Negli ultimi anni il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di coltura 3D utilizzando un idrogel 8a base di metilcellulosa. Questo gel fisico non reattivo è uno strumento utile per imitare i vincoli fisici dell'ambiente nativo dei megacariociti. È derivato dalla cellulosa mediante sostituzione dei residui di idrossile (-OH) con gruppi metossido (-OCH3). Sia il grado di sostituzione metilica che la concentrazione di metilcellulosa determinano la rigidità dell'idrogel una volta che si è gelificato. Durante la fase di sviluppo di questa tecnica, è stato dimostrato che un modulo di Young nell'intervallo da 30 a 60 Pa è la rigidità ottimale del gel per la crescita dei megacariociti 9.
Il seguente protocollo descrive un metodo per far crescere i progenitori megacariocitici del topo in un idrogel 3D di metilcellulosa. È stato precedentemente dimostrato che rispetto alla coltura liquida standard, questa coltura di idrogel aumenta il grado di poliploidizzazione dei megacariociti, migliora la maturazione e l'organizzazione intracellulare e aumenta la capacità dei megacariociti di estendere i proplati una volta risusciati in un mezzo liquido 9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il protocollo per l'isolamento delle cellule lin− del midollo osseo di topo e il loro incorporamento in un idrogel di metilcellulosa per la coltura 3D, nonché la quantificazione della loro capacità di produrre proplatelet e il recupero delle cellule per ulteriori analisi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti i protocolli visualizzati nel video sono stati eseguiti in stretta conformità con la legge europea e le raccomandazioni del comitato di revisione dell'Etablissement Français du Sang (EFS). Una prima versione di questo protocollo è stata originariamente pubblicata nel 2018 in Methods in Molecular Biology 8.
NOTA: la Figura 1 presenta una vista schematica dell'intero processo. Questo processo include 1) dissezione ossea, recupero del midollo e isolamento meccanico delle cellule del midollo, 2) selezione magnetica delle cellule negative del lignaggio (Lin-), 3) semina in idrogel liquido o metilcellulosa e 4) risospensione dei megacariociti coltivati in gel 3D per l'esame della formazione di proplatelet in mezzo liquido.
1. Raccolta di ossa da topi adulti
NOTA: in questa sezione, è importante ridurre al minimo la contaminazione microbica.
- Preparare un tubo da 15 ml per la raccolta ossea con Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente l'1% del volume totale di miscela antibiotica penicillina-streptomicina-glutamino (PSG) (penicillina 10000 U/mL, streptomicina 100000 μg/mL e L-glutammina 29,2 mg/mL).
NOTA: Se tutti i topi utilizzati hanno lo stesso genotipo, raggruppate tutte le ossa nello stesso tubo contenente 1 mL di DMEM - PSG 1% per numero di topi. Gli antibiotici sono importanti per prevenire la possibile proliferazione batterica durante il periodo di campionamento osseo. - Riempire un tubo da 50 ml con etanolo al 70% per la disinfezione ossea e un altro per gli strumenti di risciacquo durante la procedura. Utilizzare strumenti di dissezione sterilizzati.
- Anestetizzare i topi usando l'inalazione di isoflurano (4%) e procedere rapidamente alla lussazione cervicale per eutanasizzare i topi. Immergere rapidamente il corpo in etanolo al 70% per disinfettare ed evitare la contaminazione microbica.
- Seziona rapidamente le tibie e i femori.
- Usando un bisturi, tagliare via le epifisi dell'estremità laterale della caviglia per la tibia e dell'estremità laterale dell'anca per il femore.
- Immergere le ossa per un secondo in etanolo al 70% prima di immergerle in un mezzo DMEM contenente l'1% di PSG.
2. Dissociazione del midollo e isolamento delle cellule lin
NOTA: questa parte del protocollo viene eseguita sotto una cappa a flusso laminare. Per una coltura, tutti i pozzi fanno parte dello stesso esperimento e non possono essere considerati come repliche biologiche indipendenti. Le cellule di tutti i topi sono raggruppate insieme per garantire l'omogeneità di tutti i pozzeggi e per poterli confrontare tra loro eliminando la possibile variabilità interimmaginale. Per le repliche biologiche indipendenti, la coltura deve essere ripetuta.
- Posizionare le ossa in una capsula di Petri e sollevarle due volte nella soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) per rimuovere potenziali contaminanti.
- Preparare DMEM - 1% PSG in un tubo da 50 ml.
NOTA: Fornire 2 ml di DMEM - 1% PSG per topi utilizzati per l'esperimento. - Riempire una siringa da 5 ml dotata di un ago calibro 21 con DMEM - 1% PSG.
- Tenendo l'osso con una pinca, introdurre solo la smussatura dell'ago all'estremità laterale del ginocchio.
NOTA: L'epifisi lato ginocchio deve rimanere intatta dalla dissezione, lasciando una piccola cavità al centro attraverso la quale inserire l'ago. L'epifisi rimanente manterrà l'osso attaccato all'ago durante il lavaggio. Fare attenzione a non introdurre più della smussatura nell'osso in quanto potrebbe schiacciare e danneggiare il midollo. - Premere rapidamente lo stantuffo della siringa per sciacquare il midollo in un tubo da 50 ml.
NOTA: Per evitare schizzi e facilitare il lavaggio e la liberazione del midollo posizionare l'estremità libera dell'osso sulla parete del tubo, immersa in DMEM - 1% PSG. In pratica, un volume compreso tra 500 μL e 1 mL è generalmente sufficiente per espellere il midollo dall'osso. Quando il midollo è stato completamente espulso, l'osso è diventato bianco. Nel caso in cui il midollo non sia stato totalmente espulso dalla diafisi come giudicato da qualche residuo colore rosso, è possibile ripetere il risciacquo con mezzo fresco. - Ripetere i passaggi 2.4. e 2.5. per tutte le ossa, riempire la siringa da 5 ml con DMEM - 1% PSG se necessario.
- Utilizzare la stessa siringa da 5 mL con l'ago calibro 21 per trasferire il volume totale del mezzo contenente midollo lavato in tubi da 10 mL a fondo tondo.
NOTA: Non è assolutamente necessario passare a un tubo da 10 ml a fondo tondo, ma rende più facile procedere alle seguenti fasi di dissociazione. Non esitate a cambiare siringa e/o ago se si sospetta un rischio di contaminazione. - Procedere alla dissociazione cellulare aspirando ed espellendo le cellule medie e del midollo successivamente due volte attraverso un ago calibro 21, tre volte attraverso un calibro 23 e una volta attraverso un ago calibro 25.
NOTA: Evitare bolle d'aria in quanto potrebbe essere dannoso per le cellule. - Trasferire la sospensione in tubi da 15 ml.
- Misurare il numero di celle e verificare la vitalità utilizzando un contatore di celle automatizzato o una camera cellulare per il conteggio manuale in presenza di tripano blu per escludere le cellule morte.
- Centrifugare i tubi da 15 mL per 7 min a 300 x g. Utilizzando una pipetta di trasferimento da 1 mL, pipettare con cura e scartare il surnatante.
- Isolare le cellule staminali e progenitrici mediante selezione immunomagnetica negativa utilizzando un kit di isolamento delle cellule ematopoietiche di topo.
NOTA: Lo scopo di questo ordinamento cellulare è quello di recuperare le cellule che sono negative per tutti gli anticorpi di selezione (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) e quindi di eliminare le cellule che sono già impegnate in un lignaggio di differenziazione diverso da quello megacariocitico. - Seguendo le istruzioni del kit, rinsospendare il pellet cellulare in mezzo M appena preparato (PBS con il 2% del volume finale di siero bovino fetale (FBS), EDTA 1 mM) ad una concentrazione di 1 × 108 cellule/mL e distribuire la sospensione in tubi di polistirene da 5 mL a fondo tondo ad un volume massimo di 2 mL.
- Aggiungere ai tubi di polistirene: siero di ratto normale ad una concentrazione di 50 μL/mL e la miscela di anticorpi biotinilati (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) ad una concentrazione di 50 μL di miscela per mL e omogeneizzare facendo scorrere delicatamente i tubi.
NOTA: Questi anticorpi si legheranno alle cellule già impegnate in una via di differenziazione ad eccezione della via megacariocitica. - Incubare i tubi sul ghiaccio per 15 min.
- Aggiungere perle magnetiche rivestite di streptavitina ad una concentrazione di 75 μL/mL e omogeneizzare facendo scorrere delicatamente i tubi.
- Incubare di nuovo sul ghiaccio per 10 minuti.
- Se necessario, regolare su un volume finale di 2,5 ml per tubo con M medio.
- Omogeneizzare la sospensione facendo scorrere delicatamente il tubo poco prima di posizionarli, senza i loro tappi, all'interno di un magnete e attendere tre minuti.
NOTA: Le cellule già impegnate in un percorso di differenziazione e rivestite con perle magnetiche saranno trattenute sulla parete del tubo all'interno del magnete. - Inverti magnete e tubo per trasferire il contenuto del tubo in un nuovo tubo di polistirene da 5 mL a fondo tondo.
NOTA: Non e togliere il tubo dal magnete per il trasferimento; si fa invertendo il magnete con il tubo ancora dentro. Utilizzare un movimento costante e non scuotere il tubo. - Scartare il tubo iniziale contenente celle con etichetta magnetica indesiderata e posizionare quello nuovo, senza il suo cappuccio, nel magnete per altri tre minuti.
- Procedendo come nel passaggio 2.20, trasferire le celle Lin− isolate in un nuovo tubo da 15 ml.
NOTA: se per i passaggi precedenti sono stati utilizzati diversi tubi di polistirene da 5 mL, raggruppate tutte le celle nello stesso tubo da 15 mL. Le cellule recuperate dopo la selezione cellulare sono cellule staminali ematopoietiche e progenitori. La presenza di trombopoietina (TPO), il principale regolatore fisiologico della megacariopoiesi 10,dirigerà la differenziazione cellulare verso la linea cellulare megacariocitica. - Misurare il numero di celle Lin− e la vitalità come nel passaggio 2.10.
- Calcola il volume richiesto di sospensione cellulare a centrifuga per avere 1 x 106 celle vitali x Numero pozzo, il numero di pozzo è il numero di pozzi da seminare per condizione.
- Preparare un tubo per condizione con il volume appropriato di sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 7 minuti.
- Per le colture liquide, scartare il surnatante e risusemere il pellet cellulare in un terreno di coltura completo (DMEM, PSG 1% del volume finale, FBS 10% del volume finale, irudina 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) per raggiungere la concentrazione finale di 2 ×10 6 cellule vitali/mL (pari a 1 × 106 cellule per pozzetti da 500 μL). Incubare le cellule a 37 °C sotto il 5% di CO2. (= giorno 0 della cultura)
NOTA: Vedere il paragrafo successivo per le colture di metilcellulosa Ad esempio, per preparare un terreno di coltura completo per un pozzo, utilizzare 435 μL di DMEM, 50 μL di 100% FBS per il 10% finale, 5 μL di 100% PSG per l'1% finale, 5 μL di 10 000 U/mL per 100 U/mL finale e 5 μL di 5 μg/mL TPO per 50 ng/mL finale. Le piastre di coltura a 4 pozzetti o 24 pozzetti vengono in genere utilizzate poiché il loro diametro del pozzo è adatto per i 500 μL necessari per pozzo.
3. Incorporazione di cellule in idrogel di metilcellulosa
NOTA: Si prega di notare che il seguente protocollo descrive il metodo per ottenere un singolo pozzo di coltura cellulare di idrogel, adattarsi al numero di pozzedi necessari.
- Scongelare aliquote di 1 mL di soluzione stock di metilcellulosa al 3% a temperatura ambiente. Preparare un'aliquota extra separata di metilcellulosa per il rivestimento della siringa.
NOTA: Ad una concentrazione del 3%, la metilcellulosa rimane liquida a temperatura ambiente (20-25 °C). - Rivestire una siringa Luer lock da 1 mL dotata di un ago calibro 18 con metilcellulosa prelevando 1 mL di metilcellulosa dall'aliquota extra. Espellere totalmente la metilcellulosa.
NOTA: questa fase di rivestimento garantisce che il volume di metilcellulosa raccolto nel passaggio 3.3 sia esatto. - Con la stessa siringa e ago, ma utilizzando una nuova aliquota di metilcellulosa, prelevare il volume appropriato di metilcellulosa (Figura 2A).
NOTA: Per ottenere una concentrazione finale del 2% di metilcellulosa in un volume finale di 500 μL per pozzedo, sono necessari 333 μL di metilcellulosa al 3%. - Rimuovere con cautela l'ago. Utilizzando pinzetti sterilizzati, avvitare un connettore Luer lock all'estremità della siringa (Figura 2B-C).
- Collegare una seconda siringa Luer lock da 1 mL non rivestita al connettore Luer lock per collegare le due siringhe insieme (Figura 2D).
NOTA: non è necessario rivestire questa seconda siringa. - Distribuire equamente il volume di metilcellulosa tra le due siringhe (Figura 2E) e metterle da parte fino al punto 3.11.
- Preparare il terreno di coltura DMEM concentrato in modo da ottenere nel volume finale di metilcellulosa (fase 3.11) una concentrazione identica a quella del terreno di coltura liquido per ciascun composto (PSG 1% del volume finale, FBS 10% del volume finale, irudina 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
- Preparare 167 μL di terreno di coltura concentrato per pozzo finale di 1 × 106 cellule. Questo volume di mezzo viene calcolato in modo da ottenere una concentrazione finale di metilcellulosa del 2%. Il volume totale nel pozzo sarà di 500 μL (167 μL di sospensione cellulare in terreno di coltura concentrato + 333 μL di metilcellulosa) e tutti i componenti avranno una concentrazione identica a quella nei pozzeli liquidi.
- Ad esempio, per preparare un terreno di coltura completo per un pozzo, utilizzare 102 μL di DMEM, 50 μL di FBS al 100% per il 10% finale, 5 μL di PSG al 100% per l'1% finale, 5 μL di 10 000 U/mL per 100 U/mL finale e 5 μL di 5 μg/mL TPO per 50 ng/mL finale. Dà un volume di 167 μL utilizzato per spese di ripresa delle cellule e con l'aggiunta di 333 μL di metilcellulosa il volume finale sarà di 500 μL.
- Dopo aver completato la fase di centrifugazione 2.26, scartare il surnatante e risospenare il pellet cellulare nel terreno di coltura concentrato con un rapporto di 1 × 106 cellule per 167 μL.
- Riprendere le siringhe e scollegarne una dal connettore.
- Pipetta 167 μL della sospensione cellulare.
- Aggiungere la sospensione cellulare direttamente nel connettore della siringa (Figura 2F), assicurandosi di non introdurre bolle d'aria.
NOTA: durante l'aggiunta della sospensione cellulare, aspirare lentamente lo stantuffo della siringa contemporaneamente per liberare spazio per la sospensione cellulare. - Ricollegare con attenzione le due siringhe (Figura 2G) senza perdere alcuna sospensione nella filettatura della vite.
NOTA: prima della riconnessione, tirare lo stantuffo per lasciare il connettore mezzo vuoto e lasciare spazio sufficiente per il collegamento della seconda siringa senza che la sospensione trabocchi. - Omogeneizzare lentamente il mezzo metilcellulosa con la sospensione cellulare con dieci movimenti dello stantuffo avanti e indietro tra le due siringhe (Figura 2H).
- Aspirare il volume totale in una siringa e scollegare le due siringhe, lasciando il connettore su quello vuoto.
- Svuotare il contenuto della siringa in un pozzettino di una piastra a 4 pozzetti (Figura 2I).
- Incubare le cellule a 37 °C sotto il 5% di CO2 (= giorno 0 di coltura).
NOTA: È possibile preparare due pozzi di metilcellulosa con un paio di siringhe. Aumentare di due il volume di metilcellulosa e il volume di sospensione cellulare per avere 2 x106 cellule. Dopo aver completato il passaggio 3.13. distribuire equamente il volume tra le due siringhe per avere 500 μL in ciascuna di esse. Scollegali e svuota quello senza il connettore in un pozzo di cultura. Ricollegare le siringhe per trasferire il volume da quello che ha mantenuto il connettore all'altro. Scollegare le siringhe, quella con i 500 μL non dovrebbe avere il connettore collegato e seminare le cellule in un secondo pozzo di coltura. La metilcellulosa al 3% viene acquistata come soluzione stock nel modified Dulbecco's Medium (IMDM) di Iscove mentre le cellule concentrate sono sospese nel DMEM. Inizialmente sono stati condotti test comparativi per assicurarsi che questo mezzo misto non avesse alcun impatto sull'esito dell'esperimento, specialmente rispetto alla coltura liquida in DMEM al 100%.
4. Risuspensione cellulare per l'analisi dei proplatati
NOTA: L'analisi della capacità di formare proplatelet deve essere eseguita in condizioni comparabili tra megacariociti liquidi e metilcellulosi coltivati. I vincoli fisici esercitati dall'idrogel di metilcellulosa inibiscono l'estensione del proplatelet. Pertanto, le cellule coltivate con metilcellulosa vengono riconsosciate in mezzo liquido fresco il giorno 3 della coltura per consentire loro di estendere i proplatati. L'idrogel di metilcellulosa è un idrogel fisico che viene facilmente diluito con l'aggiunta di mezzo liquido. È importante sottolineare che, per evitare artefatti da resuspensione e centrifugazione, le cellule nella condizione del mezzo liquido di controllo devono essere trattate contemporaneamente allo stesso modo delle cellule coltivate con metilcellulosa. Fare riferimento alla rappresentazione schematica dell'esperimento (Figura 1).
- Preparare 10 mL di DMEM - 1% PSG preriscaldato a 37 °C in un tubo da 15 ml per ogni pozzetto da riaspensionare.
- Con cautela risusciso le cellule da ciascun pozzo nei 10 ml di DMEM - 1% PSG.
NOTA: Eseguire delicatamente diversi movimenti su e giù per diluire completamente la metilcellulosa. Per i pozzi liquidi assicurarsi di raccogliere tutte le cellule depositate sul fondo del pozzo. - Centrifugare i tubi 5 min a 300 × g.
- Nel frattempo preparare il terreno di coltura completo (DMEM, PSG 1% del volume finale, FBS 10% del volume finale, irudina 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
NOTA: In questa fase ogni pozzo viene recuperato per essere diluito della metà, quindi preparare 1 mL di terreno di coltura completo per pozzo. - Scartare il surnatante e risuscivare il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura per ogni tubo.
- Riseminare 500 μL di sospensione cellulare per pozzetti in una piastra a 4 o 24 pozzetti e incubare a 37 °C sotto il 5% di CO2.
NOTA: Da un pozzo iniziale, ottenere 2 pozzi per la visualizzazione del proplatelet in duplice copia. Si noti che, poiché questi duplicati provengono dallo stesso campione, non possono essere considerati repliche indipendenti. - 24 ore dopo la risemina, il giorno 4 della coltura, acquisire casualmente 10 immagini per pozzo utilizzando la microscopia a campo luminoso e l'obiettivo 20×.
NOTA: Le celle tendono a raggrupparsi al centro del pozzo, assicurarsi di non avere troppe celle sul campo in quanto ciò potrebbe rendere difficile la visualizzazione e la quantificazione del proplatelet. Assicurati di catturare almeno 5 megacariociti per campo. - Contare il numero totale di megacariociti e di megacariociti che estendono le proplatelet in ogni immagine e calcolare la proporzione di megacariociti che estendono le proplatelette.
NOTA: la quantificazione non è automatizzata; eseguire manualmente il conteggio delle celle. Il conteggio può essere facilitato dall'uso del plug-in del contatore di celle di ImageJ per fare clic sulle celle al fine di contrassegnarle mentre vengono contate. 10 campi acquisiti per pozzo e pozzi in duplice copia rappresentano circa 150-300 megacariociti per condizione.
5. Fissazione e recupero cellulare per analisi future
ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza fissativi che devono essere maneggiati sotto una cappa aspirante, indossando dispositivi di protezione.
NOTA: L'obiettivo è quello di mantenere intatti i vincoli di gel applicati sulle cellule fino a quando non sono completamente fissati. Pertanto, e indipendentemente dal fissativo utilizzato, deve essere aggiunto nel pozzo sopra la metilcellulosa, senza disturbare il gel. Lo stesso protocollo viene applicato alle colture liquide.
- Aggiungere un volume di soluzione fissativa pari al volume seminato (500 μL in questo protocollo), sopra la metilcellulosa senza interrompere il gel. Attendere il tempo appropriato in base al fissativo utilizzato (almeno 10 min).
NOTA: La diffusione fissativa in tutto il gel dovrebbe essere molto rapida come rivelato da un rapido cambiamento nel colore del gel (dal rosa a una tonalità giallo-arancio). La paraformaldeide (8% in DPBS, 500 μL per pozzetto) viene solitamente utilizzata per l'immunolabeling, mentre la glutaraldheide (5% nel tampone cacodilato, 500 μL per pozzetto) viene utilizzata per l'analisi al microscopio elettronico. - Utilizzando una pipetta P1000 fare delicatamente diversi pipettaggio su e giù con il fissativo e il gel in modo da diluire omogeneamente la metilcellulosa.
- Utilizzando la stessa pipetta e punta, trasferire tutto il volume dal pozzo in un tubo da 15 ml contenente 10 mL di DPBS e omogeneizzare.
- Centrifugare la miscela a 300 × g per 7 min.
NOTA: potrebbe essere necessaria una seconda fase di lavaggio per eliminare tutta la metilcellulosa - Scartare il surnatante e risusedere il pellet di megacariociti nel mezzo appropriato secondo l'analisi desiderata (immunolabeling, citometria a flusso9, microscopia elettronica ...) (per la microscopia elettronica si veda anche il metodo cartaceo"In situ exploration of the major steps of megakaryopoiesis using transmission electron microscopy" in questo numero di JoVE).
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Representative Results
I dati ottenuti utilizzando questo protocollo sono stati originariamente pubblicati su Blood nel 20169.
Secondo il protocollo, le cellule sono state seminate in mezzo idrogel liquido o metilcellulosa. Le cellule in mezzo liquido sono tutte sedimentate sul fondo del pozzo, a contatto con la superficie plastica rigida e talvolta con altre cellule. Al contrario, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distribuite in modo omogeneo nel gel e sono isolate dalle cellule vicine (Figura 3A). Il gel di metilcellulosa ad una concentrazione finale del 2% aumenta molto leggermente il diametro medio dei megacariociti rispetto alla coltura liquida (Figura 3B), in conformità con la ploidia riportata più alta9. Al contrario, l'aumento della concentrazione di metilcellulosa dello 0,5% compromette la differenziazione dei megacariociti, come dimostrato da un diametro medio inferiore (Figura 3B).
Una notevole differenza nell'ultrastruttura dei megacariociti si osserva tra i megacariociti differenziati in coltura liquida e quelli differenziati in vivo all'interno del midollo osseo. Una caratteristica dei megacariociti maturi è una complessa rete di membrane intracitoplasmatiche, il DMS (Demarcation Membrane System) che funge da serbatoio per la membrana delle future piastrine. Nei megacariociti maturi il DMS si organizza per formare fogli di membrana intrecciati che occupano la maggior parte del citoplasma. Con la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), sembrano essere strettamente appositi e delineare territori citoplasmatici(Figura 3C pannello superiore) (per la procedura TEM, vedere il metodo cartaceo"Esplorazione in situ delle principali fasi della megacariopoiesi usando la microscopia elettronica a trasmissione" in questo stesso numero JOVE). In coltura liquida, le membrane DMS hanno per lo più l'aspetto di piccole vescicole rotonde, ovali o allungate senza delimitazione dei territori citoplasmatici (Figura 3C pannello centrale). Al contrario, la coltura del 2% di metilcellulosa promuove l'organizzazione del DMS nella maggior parte dei megacariociti, con membrane strettamente apposte e delimitanti territori citoplasmatici, simili a quello in situ (Figura 3C pannello inferiore). Questo risultato indica che la coltura di idrogel di metilcellulosa al 2% consente una migliore differenziazione dei megacariociti a causa dei vincoli meccanici del mezzo ambientale.
Dopo il trasferimento cellulare in mezzo liquido al giorno 3, i megacariociti iniziano ad estendere i proplatati dopo 4 h 9. La Figura 4 mostra la quantificazione della proporzione di megacariociti con proplatelet estese 24 ore dopo la ricaspensione in ambiente liquido. Dieci immagini sono state acquisite casualmente per pozzetto, utilizzando la microscopia a campo luminoso e l'obiettivo 20× (Figura 4A). La quantificazione è stata eseguita ciecamente e manualmente utilizzando il plugin del contatore di celle su Fiji (ImageJ) (Figura 4B). Poiché si tratta di colture cellulari primarie, c'è una variabilità inter-esperimento ma il protocollo rimane robusto e offre una buona riproducibilità. Nella condizione di pre-coltura liquida, la proporzione di proplatelet dovrebbe essere compresa tra il 10% e il 20%, mentre questa proporzione è raddoppiata per la precoltura dell'idrogel.
Figura 1. Rappresentazione schematica dell'intero processo. Le ossa vengono sezionate, il midollo viene espulso e le cellule dissociate meccanicamente. Le cellule staminali e progenitrici di interesse (cellule lin) sono isolate mediante una procedura di selezione immunomagnetica negativa e seminate in mezzo liquido o idrogel (giorno 0). Al giorno 3 della coltura (che in totale rappresenta una durata di 4 giorni), entrambe le condizioni vengono riconsepare in un ambiente separato di coltura liquida fresca. Questa seconda fase di coltivazione viene effettuata dal giorno 3 fino al giorno 4 della cultura. La percentuale di PK che estendono i proplatelet viene misurata al giorno 4 della cultura. Per chiarezza visiva, una cella viene schematizzata per pozzo. Il cerchio blu raffigura una singola cellula con il suo nucleo in viola. Nella fase finale, entrambi i PK sono rappresentati con proplatelet. La proporzione di PK che formano proplatelet varia a seconda della precoltura liquida o metilcellulosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Incorporazione di cellule in idrogel di metilcellulosa. Dopo aver pre-rivestimento la parete delle siringhe, (A) prelevare il volume appropriato di metilcellulosa; (B, C) scollegare l'ago e avvitare un connettore sulla siringa; (D) spingere la metilcellulosa a metà del connettore e collegare una seconda siringa; (E) distribuire equamente la metilcellulosa tra le due siringhe e scollegarle; f) aggiungere la sospensione cellulare alla siringa che porta il connettore; (G) ricollegare le due siringhe; (H) omogeneizzare spingendo l'intero volume da una siringa all'altra un paio di volte; (I) seminare le cellule espellendo l'intero volume in un piatto di coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Caratteristiche dei megacariociti in base alle condizioni della coltura. (A) Immagini rappresentative di megacariociti al giorno 3 di coltura in liquido (pannello di sinistra) o 2% di metilcellulosa idrogel (pannello di destra). Scala bar = 50 μm (B) Diametro medio dei megacariociti coltivati in mezzo liquido, o in idrogel di metilcellulosa al 2% o al 2,5%. I risultati sono espressi come la media ± SD in 3 colture indipendenti, con un totale di almeno 100 megacariociti esaminati. *, P<0,05, ***P < 0,0001, utilizzando l'analisi della varianza a 1 via (ANOVA) con il test di confronto multiplo di Bonferroni. (grafico adattato da Aguilar et al. 2016) (C) Vista schematica (a sinistra) e immagini rappresentative al microscopio elettronico (al centro) di megacariociti murini; pannelli di destra, viste ravvicinate dai quadrati bianchi (barra della scala = 5 μm per le immagini al microscopio elettronico centrale e 2 μm per le viste ravvicinate). I pannelli superiori sono megacariociti in situ, il centro rappresenta i megacariociti cresciuti in vitro in coltura liquida e i pannelli inferiori sono megacariociti coltivati in idrogel 3D metilcellulosa. Questi dati sono stati originariamente pubblicati su Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Risultati rappresentativi della quantificazione del proplatelet. (A) immagini rappresentative di megacariociti al giorno 4 della coltura. Le cellule sono state incubate tre giorni in mezzo idrogel liquido(a sinistra)o al 2% di metilcellulosa(a destra)seguito da un giorno di risuspensione in mezzo liquido. Le frecce nere indicano i megacariociti che estendono i proplatelet. (Barra di scala = 50 μm). (B) Dati rappresentativi di quantificazione della formazione di proplatelet. Formazione di proplatelet quantificata al giorno 4 per megacariociti precedentemente pre-coltivati dal giorno 0 al giorno 3 in mezzo idrogel liquido o 2% metilcellulosa. I risultati sono espressi come la percentuale di megacariociti che estendono proplatelet (media ± SD) e provengono da 3 esperimenti indipendenti, con un numero totale di megacariociti esaminati per condizione >750 (t-test, p = 0,0023). La percentuale media di megacariociti che estendono i proplati è del 16% in condizioni liquide e del 39% per la precoltura di idrogel di metilcellulosa. Questo risultato corrisponde all'effetto precedentemente dimostrato e pubblicato della pre-coltura di idrogel che aumenta la formazione di proplatelet rispetto alla condizione liquida. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel decennio precedente, la meccanobiologia ha suscitato sempre più interesse in molte aree della biologia. Ora è comunemente riconosciuto che l'ambiente meccanico che circonda le cellule svolge un ruolo nel loro comportamento, sottolineando l'importanza di studiare come i megacariociti percepiscono e rispondono ai segnali meccanici extracellulari. È difficile misurare con precisione la rigidità del tessuto del midollo osseo in situ11, soprattutto se consideriamo il midollo rosso ematopoietico in quanto si trova all'interno di ossa trabecolari in grandi mammiferi mentre il midollo più facilmente accessibile dalla diafisi è composto essenzialmente da adipociti (midollo giallo)12. Nel caso di un midollo isolato da topi, dove la diafisi contiene essenzialmente midollo rosso, un altro problema è che, una volta estratto dall'osso, il tessuto non rimane coeso. Tuttavia, Shin e collaboratori sono riusciti a misurare la rigidità del midollo di diafisi del topo usando la microscopia a forza atomica e hanno trovato un valore dimidollo E = 0,3 ± 0,1 kPa, che colloca il midollo tra i tessuti più molli6.
L'interesse della procedura qui descritta è quello di confrontare il comportamento dei megacariociti nel mezzo liquido con quello nell'idrogel. Nell'ambiente liquido, le cellule si sono tutte sedimentate sul fondo del pozzo, a contatto con la superficie plastica rigida e talvolta con altre cellule. Al contrario, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distribuite in modo omogeneo nel gel e sono completamente isolate dalle altre cellule (Figura 3A). Quindi sono sottoposti essenzialmente a segnali meccanici forniti dal confinamento, esclusa la comunicazione juxtacrine. La stimolazione paracrina non può essere totalmente esclusa. Tuttavia, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distanti l'una dall'altra contrariamente alla situazione nel midollo osseo e possiamo quindi supporre che se le sostanze secrete raggiungono le cellule vicine, potrebbero essere molto diluite.
Il metodo è facile da configurare e non richiede competenze specifiche. La metilcellulosa è un gel fisico le cui catene polimeriche formano legami incrociati non covalenti. Essendo liquido a bassa temperatura, si gelatina quando aumenta la temperatura (si veda l'articolo di Aguilar et al. 20169 per ulteriori informazioni sulla caratterizzazione delle proprietà meccaniche del gel). Questo stato di gel può essere facilmente invertito dopo la diluizione in soluzione acquosa, che consente un facile recupero delle cellule, sia fissate in gel che come cellule vive.
Un fattore critico qui è la rigidità dell'idrogel. Il volume appropriato di metilcellulosa dovrebbe essere erogato in modo molto preciso in quanto anche un piccolo cambiamento nella concentrazione di idrogel può avere un impatto importante sulla rigidità dell'ambiente e quindi sulla maturazione dei megacariociti. Ad esempio, è stato precedentemente dimostrato che l'aumento della concentrazione di metilcellulosa dal 2 al 2,5% ha aumentato la rigidità del gel (modulo di Young) di 10 volte. Una possibile insidia è che non esiste un facile controllo di qualità per verificare precise proprietà reologiche della metilcellulosa in ogni pozzo sperimentale una volta che è stato seminato con cellule. Tuttavia, un criterio essenziale che rassicurerà su una corretta concentrazione di gel è la corretta maturazione dei megacariociti all'interno dell'idrogel, come riflesso dalle loro grandi dimensioni approssimativamente simili a quelle in mezzo liquido. Una diminuzione del loro diametro medio potrebbe riflettere una differenziazione difettosa simile a quella che si verifica quando si aumenta la rigidità con il 2,5% di metilcellulosa (Figura 3B).
Un altro limite del metodo è che il recupero cellulare dall'idrogel richiede più tempo rispetto alla coltura classica in quanto è necessario prima diluire il gel prima della centrifugazione. Se la metilcellulosa deve essere completamente rimossa, ad esempio per ottenere il lisato cellulare per un'ulteriore procedura di isolamento dell'RNA o del western blot, può essere necessaria un'ulteriore fase di lavaggio, durante la quale possono verificarsi modifiche temporali nelle proteine o nell'RNA (defosforilazione delle proteine, degradazione dell'RNA ...).
Un punto critico da considerare nella procedura è il conteggio delle cellule che deve essere uguale in ogni condizione. Questo non è così banale poiché nella coltura liquida, le cellule tendono a sedimentare sul fondo del pozzo e alcune di esse aderiscono sulla superficie plastica, il che non è il caso delle cellule in sospensione in idrogel. Un'insidia è una raccolta incompleta delle cellule in condizioni liquide, con conseguente diverso contenuto cellulare tra condizione "liquida" e "idrogel" dopo la sospensione in mezzo liquido al giorno 3. Tale differenza può portare a discrepanze nei dati finali. Come checkpoint, una numerazione cellulare può essere eseguita in questa fase prima di riseminare le celle. È preferibile farlo manualmente usando un emocitometro Nageotte in quanto è particolarmente appropriato per le cellule più grandi come i megacariociti.
Come per qualsiasi coltura cellulare primaria, esiste un possibile rischio di contaminazione. La contaminazione è la spiegazione più probabile di una proporzione di proplatelet insolitamente bassa nella condizione di pre-coltura della metilcellulosa, poiché una piccola contaminazione sembra più difficile da rilevare rispetto al mezzo liquido. Pertanto, può passare inosservato fino alla quantificazione del proplatelet, portando a risultati fuorvianti. Le buone pratiche di laboratorio devono essere rigorosamente osservate soprattutto durante l'incapsulamento delle cellule di metilcellulosa che richiede numerose e precise manipolazioni di siringhe e connettori. La vitalità dei megacariociti deve anche essere controllata con il blu di Trypan utilizzando una camera cellulare nageotte per il conteggio manuale prima della risemina al giorno 3.
Nel complesso, il protocollo qui fornito descrive un modello in vitro per il confronto tra la coltura liquida classica e una coltura 3D che utilizza idrogel di metilcellulosa. Da notare, questo protocollo di coltura è descritto perle cellule lin primarie di topo e non è stato ancora adattato alle cellule umane. Questo modello 3D è uno strumento utile per studiare l'impatto dell'ambiente meccanico sul comportamento e sulla maturazione dei megacariociti9. È anche possibile aggiungere composti in coltura (anche sul gel) per studiare l'influenza dei farmaci sul comportamento/maturazione dei megacariociti e sulla formazione di proplatelet. Infine, riproducendo i vincoli meccanici che le cellule possono incontrare nel midollo osseo, questo sistema di coltura consente lo studio di fenotipi anomali che non potevano essere osservati nelle colture liquide classiche come precedentemente dimostrato per i megacariociti knockout di Myh9 9,13,14.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Fabien Pertuy e Alicia Aguilar che inizialmente hanno sviluppato questa tecnica in laboratorio, così come Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasburgo) che ha caratterizzato le proprietà viscoelastiche dell'idrogel di metilcellulosa. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e da una sovvenzione ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher è una destinataria della Fondation pour la Recherche Médicale (numero di sovvenzione FRM FDT202012010422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
