Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

वीवो में माउस खोपड़ी बोन मैरो में मेगाकैरियोसाइट्स और प्रोपलेट्स की दो फोटॉन इमेजिंग

Published: July 28, 2021 doi: 10.3791/62515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

Summary

हम यहां दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जीवित चूहों की खोपड़ी की हड्डी के मज्जा में मेगाकारियोसाइट्स और प्रोपलेट्स इमेजिंग के लिए विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

प्लेटलेट्स मेगाकारियोसाइट्स, अस्थि मज्जा में स्थित विशेष कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किए जाते हैं। वास्तविक समय में मेगाकारियोसाइट्स की छवि और उनके मूल वातावरण को 10 साल पहले वर्णित किया गया था और प्लेटलेट गठन की प्रक्रिया पर नई रोशनी डालता है। मेगाकारियोसाइट्स साइनसॉयड जहाजों की एंडोथेलियल अस्तर के माध्यम से विस्तारित फलाव का विस्तार करते हैं, जिन्हें प्रोपलेटलेट्स कहा जाता है। यह पेपर वास्तविक समय फ्लोरोसेंटी में एक साथ छवि के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो खोपड़ी बोन मैरो और साइनसॉइड जहाजों में मेगाकैरियोसाइट्स लेबल करता है। यह तकनीक एक छोटी सी सर्जरी पर निर्भर करती है जो भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए खोपड़ी को बरकरार रखती है। माउस सिर को सांस लेने से आंदोलनों को रोकने के लिए खोपड़ी से चिपकी अंगूठी के साथ स्थिर किया जाता है।

दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, मेगाकारियोसाइट्स को कुछ घंटों तक कल्पना की जा सकती है, जिससे साइनसॉयड जहाजों के अंदर विस्तार की प्रक्रिया में सेल फलाव और प्रोपलेटलेट के अवलोकन को सक्षम किया जा सकता है। यह फलाव (चौड़ाई, लंबाई, संकीर्तन क्षेत्रों की उपस्थिति) और उनके विस्तार व्यवहार (वेग, नियमितता, या ठहराव या पीछे हटने चरणों की उपस्थिति) की आकृति विज्ञान से संबंधित कई मापदंडों के मात्राकरण की अनुमति देता है। यह तकनीक प्लेटलेट वेग और रक्त प्रवाह की दिशा निर्धारित करने के लिए साइनसॉयड वाहिकाओं में परिसंचारी प्लेटलेट्स की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है। यह विधि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करके प्लेटलेट गठन में रुचि के जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और औषधीय परीक्षण (तंत्र का अध्ययन, प्लेटलेट उत्पादन विकारों के उपचार में दवाओं का मूल्यांकन) के लिए भी उत्तरदायी है। यह एक अमूल्य उपकरण बन गया है, विशेष रूप से इन विट्रो अध्ययनों के पूरक के रूप में अब यह ज्ञात है कि वीवो और इन विट्रो प्रॉपलेट गठन में विभिन्न तंत्रों पर भरोसा करते हैं। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि प्रति से प्रोपलेट विस्तार के लिए इन विट्रो माइक्रोट्यूबुल्स की आवश्यकता होती है। हालांकि, वीवो में,वे बल्कि एक पाड़ के रूप में काम करते हैं, मुख्य रूप से रक्त प्रवाह बलों द्वारा प्रचारित किया जा रहा है।

Introduction

प्लेटलेट्स बोन मैरो में स्थित मेगाकारियोसाइट्स-विशेष कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किए जाते हैं। सटीक तरीका है megakaryocytes संचलन में प्लेटलेट्स जारी लंबे समय हड्डी के माध्यम से वास्तविक समय की घटनाओं को देख में तकनीकी चुनौती के कारण अस्पष्ट बना हुआ है । दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी ने इस चुनौती से उबरने में मदद की है और प्लेटलेट गठन प्रक्रिया को समझने में बड़ी प्रगति हुई है । वीवो मेगाकार्योसाइट टिप्पणियों में पहला 2007 में वॉन एंड्रियन और सहयोगियों द्वारा किया गया था, जिसमें खोपड़ी1के माध्यम से फ्लोरोसेंट मेगाकैरियोसाइट्स का दृश्य था। यह इसलिए संभव हुआ क्योंकि युवा वयस्क चूहों की अग्रेतर खोपड़ी में हड्डी की परत में कुछ दसियों माइक्रोन की मोटाई होती है और यह अंतर्निहित अस्थि मज्जा2में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देने के लिए पर्याप्त पारदर्शी है ।

आगामी अध्ययनों ने विभिन्न परिस्थितियों में प्रोपलेट गठन का मूल्यांकन करने और अंतर्निहित तंत्र 3 , 4,5,6को समझने के लिए इस प्रक्रिया को लागू किया । इन अध्ययनों ने निश्चित सबूत प्रदान किए कि मेगाकारियोसाइट्स गतिशील रूप से साइनसॉयड जहाजों(चित्र 1)के एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से प्रोलेटलेट्स नामक प्रोट्रूस का विस्तार करते हैं। इन प्रोपलेटलेट्स को तब लंबे टुकड़ों के रूप में जारी किया जाता है जो मात्रा में कई सौ प्लेटलेट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्लेटलेट्स डाउनस्ट्रीम अंगों के माइक्रोसर्कुलेशन में प्रोपलेट्स के रीमॉडलिंग के बाद बनाए जाएंगे, खासकर फेफड़ों में7। लेकिन आज तक सटीक प्रक्रिया और आणविक तंत्र बहस के अधीन रहते हैं । उदाहरण के लिए, प्रोप्लेलेट्स के विस्तार में साइटोस्केलेटल प्रोटीन की प्रस्तावित भूमिका इन विट्रो और वीवो स्थितियों के बीच भिन्न होती है3, और प्रोलेटलेट गठन में अंतर भड़काऊ परिस्थितियों में प्रदर्शित किया गया है6. चीजों को और उलझी हुई, हाल ही में एक अध्ययन ने प्रोपलेट-चालित अवधारणा को विवादित किया और प्रस्ताव किया कि वीवो में,प्लेटलेट्स अनिवार्य रूप से मेगाकारियोसाइट स्तर8पर झिल्ली-नवोदित तंत्र के माध्यम से बनते हैं।

यह पेपर एक न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया का उपयोग करके जीवित चूहों में खोपड़ी की हड्डी से बोन मैरो में मेगाकैरियोसाइट्स और प्रोपलेटलेट्स के अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसी तरह के दृष्टिकोण पहले अन्य मज्जा कोशिकाओं, विशेष रूप से हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं9की कल्पना करने के लिए वर्णित किया गया है । यहां ध्यान मेगाकारियोसाइट्स और प्लेटलेट्स के अवलोकन पर है कि कुछ मापदंडों का विस्तार करने के लिए मापा जा सकता है, विशेष रूप से प्रोपलेट मॉर्फोलोजी और प्लेटलेट वेग । यह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कि फ्लोरोसेंट ट्रेसर और दवाओं को इंजेक्ट करने और खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से निरीक्षण करने के लिए जुगुलर नस में कैथेटर कैसे डालें। मामूली सर्जरी का उपयोग करके कैल्वरियल बोन सामने आ जाता है ताकि एक अंगूठी हड्डी से चिपकी हो। यह अंगूठी सिर को स्थिर करने और सांस लेने के कारण आंदोलनों को रोकने और लेंस के विसर्जन माध्यम के रूप में खारा से भरा एक कप बनाने के लिए कार्य करता है । यह तकनीक आई के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है) वास्तविक समय में साइनसॉइड ज्यामिति और मेगाकारियोसाइट्स पोत दीवार के साथ बातचीत करते हैं; ii) प्रोपलेटेलेट गठन, विस्तार और रिलीज की प्रक्रिया में मेगाकारियोसाइट्स का पालन करें; और iii) जटिल साइनसॉयड रक्त प्रवाह की निगरानी के लिए प्लेटलेट आंदोलनों को मापें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त आंकड़े हाल ही में प्रकाशित किए गए हैं3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय मानकों के अनुसार प्रदर्शन किया गया 2010/63/यूरोपीय संघ और स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर CREMEAS समिति (Comité Régional d' Ethique en Matière d' Expérimentation Animale स्ट्रासबर्ग, पशु सुविधा समझौते N: ° G67-482-10, परियोजना समझौते 2018061211274514 N°

1. चूहों की तैयारी और जुगुलर नस में कैथेटर का सम्मिलन

नोट: यहां, पुरुष या महिला, 5-7 सप्ताह पुराने mTmG रिपोर्टर चूहों का इस्तेमाल किया गया (B6.129 (सीजी)-जीटी(रोजा) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP) Luo10)Pf4-cre चूहों11के साथ पार, मेगाकारियोसाइट्स और प्लेटलेट्स12में तीव्र हरे फ्लोरेसेंस लेबलिंग की अनुमति । प्रयोग शुरू करने से पहले, माइक्रोस्कोप के हीटिंग चैंबर को कुछ घंटों के लिए पहले से गरम करें।

  1. माउस को इमेजिंग रूम में ले जाएं और संज्ञाहरण के लिए आगे बढ़ें।
    1. केटामाइन (केटामाइन (100 माइक्रोग्राम/जी) और जाइलाज़ीन (10 माइक्रोग्राम/जी) (5 माइक्रोन/जी) के समाधान के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें।
      नोट: केटामाइन/जाइलाज़ीन के दोहराया प्रशासन यहां प्रयोग किया जाता है और अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन नियमित रूप से पुनर्जेक्शन के लिए रिकॉर्डिंग के व्यवधान की आवश्यकता है । वैकल्पिक रूप से, यदि एक संज्ञाहरण मशीन उपलब्ध है, तो संज्ञाहरण का प्रेरण केटामाइन/जाइलाज़ीन के साथ किया जा सकता है और बाद में गैसों के साँस लेना (आइसोफ्लुन, हवा और ऑक्सीजन का मिश्रण) के तहत बनाए रखा जा सकता है।
    2. जानवर को उसके पिंजरे में तब तक बदलें जब तक कि वह गहरे संज्ञाहरण तक न पहुंच जाए। बाद के सभी जोड़तोड़ के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर माउस रखें।
      नोट: जबकि जानवर गहरे संज्ञाहरण तक पहुंचता है, माइक्रोस्कोप और सभी उपकरणों पर स्विच करें (धारा 4.1 देखें) और सर्जरी किए जाने के बाद प्रयोग शुरू करने के लिए आवश्यक विभिन्न मापदंडों (धारा 4.2 देखें) को सेट करें। यहां, प्रक्रिया केवल 3 घंटे तक रहता है और टर्मिनल है। प्रयोग के बाद माउस को जागने के बिना इच्छामृत्यु दी जाती है। इसलिए, त्वचा और उपकरणों के लिए इथेनॉल कीटाणुशोधन पर्याप्त है। हालांकि, संस्थागत दिशा निर्देशों के आधार पर, या यदि प्रक्रिया लंबे समय तक चलेगा, और अधिक पूर्ण कीटाणुशोधन विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए जैसे कि बीटाडीन/पोविडोन और अल्कोहल के साथ तीन बारी-बारी से स्क्रब्स ।
  2. जुगुलर नस में कैथेटर स्थापित करें।
    नोट: जहां तक संभव हो सर्जरी के दौरान माइक्रोबियल संदूषण से बचना महत्वपूर्ण है। सर्जरी के साथ आगे बढ़ने से पहले 70% इथेनॉल (EtOH) के साथ त्वचा को सावधानी से कीटाणुरहित करने का ध्यान रखें। हमेशा निष्फल कैंची और चिमटी का उपयोग करें, और नियमित रूप से उन्हें 70% एटोह में कुल्ला करें। साफ-सुथरी जगह पर काम करें, और फेस मास्क पहनें। एक 22 जी "पर सुई" कैथेटर, एक प्लास्टिक ट्यूब के अंदर एक सुई से मिलकर, नसों में इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है (सामग्री की मेजदेखें) ।
    1. माउस को अपनी पीठ पर रखें, और गले को फैलाने के लिए सर्जिकल टेप के साथ पूर्वकाल के पैरों को ठीक करें(चित्रा 2A)। 70% इथेनॉल के साथ गले को कीटाणुरहित करें।
      नोट: सुविधा के लिए, गले सर्जरी से पहले मुंडा जा सकता है । यदि प्रक्रिया लंबे समय तक रहता है, तो उचित एसेप्टिक तकनीक के लिए सावधानीपूर्वक शेविंग की जानी चाहिए।
    2. बाँझ कैंची का उपयोग कर दाएं या बाएं जुगुलर नस पर 0.7-1 सेमी चीरा बनाएं। बाहरी जुगलबंदी नस और छाता 2A के शीर्ष को बेनकाब करने के लिए आसन्न कनेक्टिव ऊतकको फैलाएं।
    3. कैथेटर को गर्म, बाँझ शारीरिक नमकीन के साथ भरें। छाती की मांसपेशी(चित्रा 2B)के माध्यम से मर्मज्ञ के बाद नस में कैथेटर डालें ।
      नोट: कैथेटर के अंदर हवा के बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखें। रक्तस्राव को रोकने के लिए मांसपेशियों के माध्यम से कैथेटर डालने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि मांसपेशियों में संपीड़न बिंदु बनेगी। यहां तक कि Hemostasis दोषों के साथ चूहों, जैसे Itgb3-/-चूहों, इस दृष्टिकोण के साथ कैथेटर प्रविष्टि पर खून नहीं है ।
    4. धीरे-धीरे सुई निकालें, और यदि आवश्यक हो, तो कैथेटर को नस में गहराई से ले जाएं। सिरिंज को कनेक्ट करें और सर्जिकल गोंद(सामग्रीकी तालिका) की एक बूंद जोड़कर कैथेटर को स्थिर करें।
      नोट: पूंछ नस के अंदर कैथेटर डालना संभव है, हालांकि इसके लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है क्योंकि नस में एक छोटी क्षमता होती है। काले बालों के साथ चूहों का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से मुश्किल है, जिनकी पूंछ नस शायद ही दिखाई देती है। इसकी बड़ी क्षमता के कारण, जुगुलर नस के अंदर कैथेटर स्थिति बड़ी मात्रा या दोहराया उपचार अधिक मज़बूती से इंजेक्शन के लिए अनुमति दे सकता है । कृपया ध्यान दें कि सिरिंज गर्म नमकीन के साथ पहली बार में भरा जाता है, और दवा समाधान इंजेक्शन से पहले मृत मात्रा इंजेक्ट करने के लिए मत भूलना।
    5. माउस को एक प्रवण स्थिति(चित्रा 2C)पर सावधानीपूर्वक वापस करें। सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर जेल(सामग्रीकी मेज) लगाएं।

2. सर्जरी और कपाल की अंगूठी की स्थापना

नोट: माउस स्थापना के लिए पूर्ण समर्थन 4 टुकड़े, एक ब्लॉक और एक थाली, माउस सिर पकड़ अंगूठी, और ब्लॉक करने के लिए अंगूठी को ठीक करने के लिए एक पेंच(चित्रा 3A)शामिल हैं । समर्थन के सभी तत्वों को 3 डी प्रिंटिंग द्वारा i.materialise.com से प्राप्त किया गया है। प्लेट एक्रिलोनिट्रिल ब्यूटाडीन स्टाइरीन (एबीएस) बहुलक, स्टेनलेस स्टील के ब्लॉक और स्क्रू, और उच्च ग्रेड स्टेनलेस स्टील (उच्च विस्तृत स्टेनलेस स्टील) की अंगूठी (3 डी प्रिंटिंग फ़ाइलों के लिए आयामों और पूरक सामग्री के लिए पूरक चित्रा S1 देखें) से बना है। ब्लॉक को स्थायी रूप से समर्थन के लिए तय किया जाता है, या तो खराब या चिपकाया जाता है। एक बार अंगूठी माउस खोपड़ी पर तय हो गया है, यह ब्लॉक धारक(चित्रा 3A)के लिए खराब किया जाना चाहिए ।

  1. कीटाणुशोधन के लिए 70% इथेनॉल के साथ गीले कागज तौलिया के साथ खोपड़ी पर बालों को गीला करें। गीले कागज के तौलिये से सभी ढीले बालों को हटा दें।
    नोट: सुविधा के लिए, खोपड़ी सर्जरी से पहले मुंडा जा सकता है ।
  2. बाँझ ठीक कैंची और चिमटी का उपयोग कर calvarium बेनकाब करने के लिए 1 सेमी तक और कानों के बीच मिडलाइन पर एक टी बनाने के द्वारा खोपड़ी incise।
    नोट: अंगूठी ललाट और पार्श्व हड्डियों(चित्रा 3B)ओवरलैप करने के लिए तैनात किया जाएगा ।
  3. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें। कैंची और चिमटी के साथ पेरिओस्टियम को सावधानी से हटा दें। सभी पेरिओस्टियम और किसी भी मलबे या बालों को हटाने के लिए शारीरिक नमकीन से लथपथ एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें, जो इमेजिंग को बदल सकता है।
    नोट: भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए, हड्डी को नुकसान न पहुंचाने के लिए बहुत ध्यान रखें।
  4. खारा के साथ कुल्ला करके किसी भी रक्त के निशान निकालें, और तेजी से एक सूखी कपास झाड़ू के साथ हड्डी सूखी । ग्लू जेल को रिंग पर लगाएं, इसे उजागर हड्डी पर रखें, और इसे कुछ सेकंड के लिए बनाए रखें ताकि अंगूठी खोपड़ी से मजबूती से जुड़ी हो।
    नोट: कोई गोंद अवलोकन क्षेत्र में प्रवेश करना चाहिए क्योंकि इससे अवांछनीय ऑटोफ्लोरेसेंस हो सकता है।
  5. शारीरिक नमकीन में डूबे कपास के झाड़ू के साथ खोपड़ी को हल्के से गीला करें।
  6. 1:1 नीले और पीले घटकों को ध्यान से मिलाकर सिलिकॉन डेंटल पेस्ट तैयार करें। इमेजिंग के दौरान रिसाव को रोकने के लिए सीलिंग के लिए रिंग के चारों ओर डेंटल पेस्ट लगाएं। किसी भी दंत पेस्ट या गोंद को ध्यान से हटा दें जो अंगूठी में प्रवेश कर सकता है।
  7. खारा के साथ अंगूठी भरें और रिसाव के लिए जांच करें।
    नोट: खारा माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए विसर्जन माध्यम के रूप में कार्य करता है । हेमोस्तासिस से संबंधित दोषों वाले चूहों का उपयोग करते समय रक्तस्राव अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है। रक्त को अंगूठी में प्रवेश करने से रोकना आवश्यक है क्योंकि यह आगे इमेजिंग को धुंधला कर सकता है।
  8. माउस को समर्थन पर रखें, और ब्लॉक धारक(चित्रा 3 सी)पर अंगूठी को स्क्रू करें। सिर उठाने और खोपड़ी से अंगूठी की टुकड़ी को रोकने के लिए जानवर के सिर के नीचे मुड़ा हुआ संपीड़न रखें।
    नोट: सिर सीधे तय किया जाता है ताकि यह सांस लेने के कारण छवि आंदोलनों को रोकता है।
  9. गर्म माइक्रोस्कोप कक्ष(चित्रा 3 डी)में समर्थन और माउस असेंबली की स्थिति।
    नोट: किसी भी समय डाला कैथेटर उखाड़ फेंकना नहीं सावधान रहना ।

3. प्रयोग के अंत तक एनेस्थेटाइज्ड चूहों का अनुवर्ती

नोट: संज्ञाहरण को हर 35 मिनट में 5 माइक्रोन/जी शरीर के वजन.c की मात्रा में केटामाइन (25 माइक्रोग्राम/जी) के इंजेक्शन और केटामाइन (50 माइक्रोग्राम/जी) और जाइलाज़ीन (5 μg/g) (1.2 μl/gμ) का मिश्रण बदलकर हर 35 मिनट में फिर से प्रेरित किया जाता है। चूंकि अधिग्रहण के दौरान गर्म माइक्रोस्कोप कक्ष खोलना संभव नहीं है, इसलिए एनेस्थेटिक मॉनिटरिंग से पहले और बाद में एनेस्थेटिक के पुनः प्रशासन द्वारा टो में चुटकी लेने से किया जाता है। इसी तरह, प्रत्येक नई वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले अंगुली चुटकी की जाती है।

  1. यदि आवश्यक हो, तो अधिग्रहण बंद करें और एस.c इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण को फिर से प्रेरित करें।
    1. सावधान रहें कि माउस सिर को न ले जाएं, बाएं हाथ के अंगूठे और तर्जनी के बीच पीठ की त्वचा को चुटकी लें। दाएं हाथ (या बाएं हाथ के लोगों के लिए इसके विपरीत) का उपयोग करके पीछे की त्वचा के गुना में संवेदनाहारी को सुतादक रूप से इंजेक्ट करें।
  2. अंगूठी में खारा की उपस्थिति के लिए जाँच करें, और यदि आवश्यक हो, ताजा नमकीन के साथ भरें। अगले 35 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग पर जाएं, और रिकॉर्डिंग अवधि के लिए इसी तरह आगे बढ़ें।
  3. प्रयोग के अंत में, उठने से पहले गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: स्थानीय नैतिक और पशु कल्याण समिति के साथ समझौते में माउस को अधिकतम 3 घंटे की अवधि के लिए एनेस्थेटाइज्ड रखा जाता है।

4. दो फोटॉन इमेजिंग

नोट: माइक्रोस्कोप और संबंधित उपकरणों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें। छवियों को एक सुनाई देने वाली स्कैनर (12 या 8 किलोहर्ट्ज) के साथ रिकॉर्ड किया गया था। गति अधिग्रहण को बढ़ाने के लिए द्विदिशात्मक मोड स्थापित किया गया था क्योंकि पिक्सल दोनों दिशाओं में दर्ज किए जाते हैं; इसलिए, चरण में किसी भी बेमेल को नियंत्रण कक्ष "चरण सुधार" के साथ ठीक किया जाना चाहिए। अंत में, अधिग्रहण की गति और सिग्नल-टू-शोर अनुपात के बीच समझौते के रूप में एक अनुकूलित औसत स्थापित किया गया था।

  1. लेजर और सुनाई देने वाली स्कैनर (आउटपुट लेजर पावर आमतौर पर लेजर के आधार पर ~ 1.8-2.5 डब्ल्यू) सहित दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप पर स्विच करें।
  2. चुने हुए फ्लोरोफोर के लिए उपयुक्त लेजर तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें। उत्सर्जित रोशनी की वसूली के लिए उपयुक्त तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें।
    नोट: यहां, क्रमशः 913 एनएम और हाइब्रिड डिटेक्टरों (500-550 एनएम और 575-625 एनएम) की एक तरंगदैर्ध्य का उपयोग क्रमशः एलेक्साफ्लूर-488 और क्यूट्रैकर-655 को उत्तेजित करने और उनका पता लगाने के लिए किया गया था।
  3. इंस्टाजुगुलर कैथेटर का उपयोग करके, वेक्यूलेचर (क्यूट्रैकर-655) को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट ट्रेसर इंजेक्ट करें; सामग्री की तालिका)। 0.2 माइक्रोन पर एक समाधान के 50 μL/माउस इंजेक्ट, अधिकतम १५० μL/प्रयोग के लिए हर घंटे एक बार नए सिरे से ।
    नोट: अन्य ट्रेसर्स का उपयोग उच्च आणविक वजन डेक्सट्रान1जैसे किया जा सकता है। उस मामले में, विचार करें कि रक्त चिपचिपाहट को डेक्सट्रान द्वारा बदला जा सकता है और कुछ रक्तस्रावी मापदंडों को संशोधित किया जा सकता है।
  4. माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के तहत समर्थन और माउस के साथ माइक्रोस्कोप चरण रखें। जांच करें कि अंगूठी हमेशा खारा से भर जाती है और उद्देश्य को विसर्जित कर देता है। बोन मैरो जहाजों (लाल) और साइनसॉइड जहाजों के साथ गठबंधन मेगाकारियोसाइट्स (हरे) की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एपिफ्लोरेसेंस का उपयोग करें।
    नोट: खोपड़ी की हड्डी की मोटाई 100 माइक्रोन2से कम है। मज्जा हड्डी के नीचे स्थित है और आसानी से फ्लोरोसेंट ग्रीन मेगाकारियोसाइट्स और क्यूट्रैकर-655 द्वारा लेबल किए गए घने लाल एनास्टोमोस्ड साइनसॉइड जहाजों द्वारा पहचाना जाता है।
  5. लंबे अधिग्रहण (मेगाकारियोसाइट्स, प्रोपलेट्स)
    1. रुचि के क्षेत्र के लिए खोजें। ऊपर बताए गए इमेज अधिग्रहण पैरामीटर लागू करें।
    2. लंबे अधिग्रहण (उदाहरण के लिए, प्रोपलेट गठन या विस्तार का दृश्य), 8 किलोहर्ट्ज सुनाई देने वाली स्कैनर का उपयोग करके अनुकूलित अंतराल (आमतौर पर 0.85 से 1.34 माइक्रोन के बीच) के साथ जेड-स्टैक छवियों का अधिग्रहण करें।
      नोट: एक 12 kHz सुनाई देती स्कैनर अधिग्रहण की गति को बढ़ा सकते हैं ।
    3. पूरे मेगाकार्योसाइट और पोत की कल्पना करने के लिए 384 x 384 पिक्सेल छवियों का अधिग्रहण करें। अच्छे संकल्प के साथ तेजी से अधिग्रहण के लिए, वांछित के रूप में औसत लाइन का उपयोग करें। इमेज स्टैक अधिग्रहण के समय अंतराल का निर्धारण करें, आमतौर पर प्रोपलेट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 10 एस या 30 एस।
      नोट: यहां, 8 के औसत एक लाइन के लिए एक उच्च संकेत से शोर अनुपात है, जो एक 8 kHz सुनाई देती स्कैनर के साथ 1 छवि/10 एस के अधिग्रहण की अनुमति प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सुनिश्चित करें कि लाइव अधिग्रहण के दौरान औसत लाइन की अनुमति है।
  6. लघु और तेजी से अधिग्रहण (प्लेटलेट्स)
    नोट: प्लेटलेट वेग जैसी तेजी से घटनाओं के कम अधिग्रहण के लिए, फ्रेम अधिग्रहण दर को अधिकतम करना आवश्यक है। उचित अधिग्रहण प्रकार का चयन फ्रेम अधिग्रहण दर (यानी एक अंतरिक्ष समय अधिग्रहण प्रकार "जाइट") को अनुकूलित करेगा।
    1. यदि आवश्यक हो तो इमेजिंग फ़ील्ड को घुमाकर (उदाहरण के लिए, 256 x 90 पिक्सल) को कम करें और इमेजिंग फ़ील्ड को घुमाकर पोत में छवि आकार को समायोजित करें।
    2. उच्चतम उपलब्ध स्कैनिंग गति का उपयोग करें।
    3. द्विदिशात्मक स्कैनिंग का प्रयोग करें।
      नोट: द्विदिशात्मक स्कैनिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि चरण अच्छी तरह से समायोजित है।
    4. छवि परिभाषा और अधिग्रहण की तेजी के बीच इष्टतम समझौता खोजने के लिए औसत लाइन को कम करें।
      नोट: प्लेटलेट वेग माप के लिए, एक पिक्सेल छवि पर्याप्त हो सकती है यदि यह अधिग्रहण की तेजी को बढ़ाने में मदद करती है।
    5. अधिग्रहण तेजी बढ़ाने के लिए जेड-स्टैक को कम करें। प्लेटलेट वेग की मात्रा निर्धारित करने के लिए केवल 1 जेड-स्टैक प्राप्त करना पर्याप्त है। प्लेटलेट वेग को मापने के लिए 10-20 एस के लिए अधिग्रहण करें।
      नोट: 12 किलोहर्ट्ज गूंजता स्कैनर के साथ इन शर्तों का उपयोग कर अधिकतम १३३ फ्रेम/एस प्राप्त किया जा सकता है । मापदंडों को शर्तों के अनुकूल होना चाहिए । कुछ जहाजों में, प्लेटलेट वेग फिर भी इन सेटिंग्स के साथ प्लेटलेट वेग को मज़बूती से निर्धारित करने के लिए बहुत अधिक है।
  7. प्रोपलेटलेट चौड़ाई और लंबाई माप
    नोट: इमेजजे के साथ लीका सॉफ्टवेयर पर प्राप्त एलआईएफ-फाइल्स को लोड करने के लिए, पहले बायो-फॉर्मेट आयातक का उपयोग करने के लिए ImageJ पर LOCI प्लग-इन डाउनलोड और इंस्टॉल करें।
    1. प्रोपलेटलेट चौड़ाई
      1. इमेजजे के साथ फिल्म खोलें। चौड़ाई माप करने के लिए, पोत के बिना केवल प्रोपलेट्स की फिल्म का उपयोग करें। अलग-अलग चैनलों को अलग करने के लिए इमेज पर क्लिक करें| रंग और विभाजन चैनलोंका चयन करें ।
      2. जेड-स्टैक फिल्म के लिए, इमेज पर क्लिक करके हर बार पॉइंट के लिए औसत जेड-प्रोजेक्शन करें| ढेर और जेड परियोजनाका चयन करें । प्रक्षेपण प्रकारके लिए , औसत तीव्रता दर्ज करें।
      3. शोर को हटाने के लिए छवि का इलाज करें। प्रक्रिया पर क्लिक करके पृष्ठभूमि को घटाएं| बैकग्राउंड को घटाएं और रोलिंग बॉल रेडियस लागू करें: 50.0 पिक्सल।  प्रक्रिया औरचिकनी पर क्लिक करके छवि चिकनी ।
      4. प्रॉपलेट के आधार के करीब एक लाइन का पता लगाएं (मेगाकार्योसाइट के पास, किसी अन्य वस्तु से परहेज करें)।
        नोट: विश्लेषण और सेट स्केल पर क्लिक करके वांछित इकाई में मूल्य प्राप्त करने के लिए छवि का पैमाना निर्धारित करना न भूलें। डिफ़ॉल्ट रूप से, छवि की इकाई पिक्सल में है।
      5. तीव्रता प्रोफ़ाइल प्लॉट, एक गॉसियन वक्र फिट, और आधा अधिकतम (FWHM) पर पूर्ण चौड़ाई की गणना । इसके लिए प्लगइन्स पर क्लिक करके मैक्रो में निम्नलिखित स्क्रिप्ट लिखें| नया और मैक्रो का चयन करें और मैक्रो पर क्लिक करके इसे चलाएं| रन मैक्रो:y=getProfile (); x=Array.getSequence (y.लंबाई); Fit.doFit ("गॉसियन", एक्स, वाई); फिट.प्लॉट (); सिग्मा = Fit.p (3); FWHM = (2 * sqrt (2* लॉग (2) * सिग्मा; प्रिंट (FWHM) ।
        नोट: सुनिश्चित करें कि लाइन स्कैन में केवल एक ही चोटी है, जो प्रॉप्लेटलेट तीव्रता के अनुरूप है।
      6. प्रोपलेट की औसत चौड़ाई प्राप्त करने के लिए 1 स्लाइस पर चरण 4.7.5 में वर्णित या समय के साथ दोहराया गया कार्य करें
    2. प्रोपलेटलेट लंबाई
      1. प्रोपलेट के साथ एक लाइन ट्रेस करें, बेस से मेगाकार्योसाइट के करीब शीर्ष पर। प्रोपलेट आकार का पालन करने के लिए एक खंडित रेखा का उपयोग करें। इसे हर बार पॉइंट के लिए दोहराएं।
      2. आरओआई मैनेजर का उपयोग करके प्रत्येक पंक्ति को सहेजना याद रखें: विश्लेषण | पर क्लिक करें टूल्स और आरओआई मैनेजर का चयन करें। ROI प्रबंधक विंडो में ऐड पर क्लिक करें प्रबंधक के लिए प्रत्येक पंक्ति को जोड़ने के लिए जैसा कि यह चुना गया है। एक फ़ोल्डर में सभी लाइनों को बचाने के लिए, डेसेलेक्ट | पर आरओआई प्रबंधक में क्लिक करें अधिक और सेवपर क्लिक करें । आरओआई प्रबंधक से, परिणाम तालिका से प्रत्येक पंक्ति(माप)की लंबाई मूल्य निकालें।
        नोट: विश्लेषण और सेट स्केल पर क्लिक करके वांछित इकाइयों में मूल्य प्राप्त करने के लिए छवि का पैमाना निर्धारित करना न भूलें। डिफ़ॉल्ट रूप से, छवि की इकाई पिक्सल में है।
  8. प्लेटलेट वेग माप
    नोट: प्लेटलेट वेग की गणना 10-20 एस से अधिक पोत के अंदर बहने वाले फ्लोरोसेंट प्लेटलेट्स की वीडियो रिकॉर्डिंग से की जाती है । चक्रीय रूप से दोहराए गए लाइन-स्कैन डेटा प्राप्त करने के लिए पहली छवि उपचार किया जाता है। गति धारियाँ जिसका कोण वेग पर निर्भर करता है, इसकी गणना की अनुमति की ओर जाता है । यहां, वेग की गणना एक विधि के साथ की गई थी जो राडोण ट्रांसफॉर्म का उपयोग करती है, जो शास्त्रीय एकवचन मूल्य अपघटन (एसवीडी) विधि15की तुलना में अधिक मजबूत है।
    1. इमेजजे के साथ छवि उपचार
      1. इमेजजे के साथ फिल्म खोलें। प्रोसेस | पर क्लिक करके गॉसियन ब्लर फिल्टर लगाएं फ़िल्टर, गॉसियन ब्लरका चयन करें, और सिग्मा (त्रिज्या) लागू करें: 2.00। प्रवाह को मापने के लिए एक छोटा सा क्षेत्र चुनें, और प्रवाह दिशा के बाद 3 आसन्न लाइनों का पता लगाएं।
        नोट: विश्लेषण | पर क्लिक करके आरओआई प्रबंधक का उपयोग करके प्रत्येक पंक्ति को सहेजना न भूलें उपकरण | आरओआई प्रबंधक। प्रत्येक लाइन जोड़ने और उन्हें बचाने के लिए आरओआई प्रबंधक विंडो में ऐड पर क्लिक करें; डेसेलेक्ट | पर पहले क्लिक करें अधिक और फिर सेवपर क्लिक करें ।
      2. इमेजजे लाइन-स्कैन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, इमेज | पर क्लिक करके प्रत्येक लाइन के लिए एक कायनोग्राफ बनाएं ढेर; रिसाल का चयन करें और निम्नलिखित मापदंडों को लागू करें: आउटपुट स्पेसिंग (माइक्रोन): 1.000 / स्लाइस काउंट: 1 / इंटरपोलेशन से बचें। परिणामस्वरूप अंतरिक्ष समय छवियों को बचाओ।
        नोट: परिणामस्वरूप छवि समय के साथ रक्त प्रवाह में प्लेटलेट्स की रैखिक गति के अनुरूप धारियाँ दिखाती है। लकीर का कोण वेग का कार्य है।
    2. मैटलैब या जीएनयू ऑक्टेव सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वेग माप
      नोट: रक्त प्रवाह में प्लेटलेट्स के वेग का अनुमान अंतरिक्ष-समय छवियों से एक कम्प्यूटेशनल विश्लेषण विधि का उपयोग करके आकर्षित और सहयोगियों द्वारा वर्णित15सहयोगियों द्वारा वर्णित एक कम्प्यूटेशनल विश्लेषण विधि से लगाया गया है । इस गणितीय विधि का वर्णन इस समीक्षा के दायरे से बाहर है, और पाठक को गणना15के बारे में विवरण के लिए आकर्षित एट अल द्वारा प्रकाशन के लिए संदर्भित किया जाता है। मतलैब कोड और अधिक जानकारी दोनों ही https://www.drew-lab.org/code अपनी वेबसाइट पर उपलब्ध हैं।
      1. मैटलैब या जीएनयू ऑक्टेव सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कोड खोलें।
        नोट: कोड वांछित अध्ययन के अनुसार अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
      2. एक ही पोत भाग में खींची गई आसन्न रेखाओं के अनुरूप 3 अंतरिक्ष-समय छवियों से मूल्य निकालें। पोत के इस हिस्से के लिए मतलब प्लेटलेट प्रवाह वेग मूल्य की गणना करें।
        नोट: उपाय की सही इकाई (जैसे, μm/s) में परिणाम को परिवर्तित करने के लिए मत भूलना ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, फ्लोरोसेंट ट्रेसर, क्यूट्रैकर-655 को नसों के साथ खोपड़ी बोन मैरो में इमेज एनास्टोमोस्ड मैरो साइनसॉइड जहाजों और तीर(चित्रा 4 ए, बाएं)द्वारा चित्रित प्रवाह दिशा को प्रशासित किया गया था। MTmG चूहों का उपयोग करना, eGFP-फ्लोरोसेंट प्लेटलेट्स प्रत्येक पोत शाखा में 20 एस से अधिक दर्ज किए गए थे, और उनके वेग ImageJ और GNU सप्तक सॉफ्टवेयर(चित्रा 4A,सही) का उपयोग कर मापा गया था । प्रवाह वेग और दिशा में विषमता पर ध्यान दें। साइनसॉयड जहाजों ने एनास्टोमोस के कारण जटिल प्रवाह प्रस्तुत किए, प्रवाह-रिफ्लो और यहां तक कि स्टेसिस की उपस्थिति के साथ, जैसा कि वीडियो 1में दर्ज विभाजन में दिखाया गया है। एक ही विभाजन चित्रा 4B (बाएं) में दिखाया गया है, लाल और नीले तीर विपरीत प्रवाह पर प्रकाश डाला के साथ । इस विभाजन में प्लेटलेट वेग को मापा गया है और ग्राफ में रिपोर्ट किया गया है(चित्रा 4B,सही)। लाल ट्रेसिंग बाएं पोत शाखा में वेग और सही पोत शाखा में नीले रंग का पता लगाने से मेल खाती है। यह प्रत्येक पोत शाखा में समय के साथ अनियमितता को दर्शाता है, जिसमें त्वरण, स्टेसिस और मंदी के चरण होते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कुछ जहाजों में, वर्तमान अधिग्रहण शर्तों के तहत विश्वसनीय विश्लेषण के लिए रक्त प्रवाह बहुत तेजी से था ।

प्रोपलेटेलेट विस्तार रिकॉर्डिंग समय के साथ उनके विभिन्न मॉर्फोलोजी के दृश्य की अनुमतिदेता है (चित्र 5)। कुछ प्रोपलेट्स अनियमित मॉर्फोलोजी(चित्रा 5Ai और वीडियो 2)के साथ बढ़ जाते हैं। दूसरों, आमतौर पर पतले लोगों, अधिग्रहण खिड़की के आंदोलन की आवश्यकता के लिए अपने विस्तार का पालन करें(चित्रा 5Aii और पूरक वीडियो 1)लंबी दूरी पर विस्तार कर सकते हैं । अन्य छोटे और मोटे होते हैं और आमतौर पर धीरे-धीरे बढ़ते हैं(चित्रा 5Aiii और पूरक वीडियो 2)। जब मेगाकारियोसाइट्स जटिल प्रवाहों के क्षेत्रों में प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करते हैं, जैसे कि चित्रा 4 बीमें दिखाया गया विभाजन, तो फ्लोप्लेट को प्रवाह दिशा(चित्रा 5 बी और वीडियो 3)के अनुसार एक पोत शाखा से दूसरे में फेंक दिया जाता है। प्रवाह दिशा में प्रोपलेट विस्तार के लिए हीमोडायनामिक बलों के महत्व का सबूत तब था जब माउस अप्रत्याशित रूप से हृदय गति से हुई। रक्त प्रवाह को रोकने से मेगाकार्योसाइट(चित्रा 5C और वीडियो 4)द्वारा विस्तारित प्रोपलेटलेट्स को आराम मिला।

जब अधिग्रहण की गुणवत्ता/संकल्प उपयुक्त होता है, तो रूपात्मक मापदंडों को मापा जा सकता है, जैसे कि टुकड़ी तक प्रोपलेट की लंबाई, प्रोपलेटलेट या किसी अन्य परिभाषित स्थान के आधार पर उनकी चौड़ाई, या कलियों का आकार(चित्रा 6A)। ~ 185 माइक्रोन (रेंज 41.5-518.5 माइक्रोन) की एक मतलब अधिकतम प्रोपलेट लंबाई और 5.2 माइक्रोन (रेंज 2.8-8 माइक्रोन) की एक मतलब प्रोपलेट चौड़ाई(चित्रा 6A)की गणना की गई थी। समय के एक समारोह के रूप में प्रोपलेट लंबाई की साजिश रचने विस्तार, स्टेसिस, या यहां तक कि पीछेहटने (चित्रा 6B)के चरणों के दौरान प्रोपलेटलेट के व्यवहार के दृश्य की अनुमति देता है। प्रोपलेटेलेट विस्तार वेग का मापन एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, जो सीधे प्रोपलेटलेट्स3के विस्तार, स्टेसिस या रिऐक्शन व्यवहार को दर्शाता है।

प्रोपलेटलेट विस्तार वेग को मापा जा सकता है यदि प्रोपलेट अपनी मातृ कोशिका से जुड़ा रहता है; एक बार अलग होने के बाद, इसे तुरंत प्रवाह से दूर किया जाएगा और दृश्य खिड़की से गायब हो जाएगा। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों में, मतलब प्रोपलेट विस्तार वेग ~ 10 μm/मिनट(चित्रा 6C),पिछले प्रकाशनों के साथ समझौते में1था । अंत में, जुगुलर नस में डाले गए कैथेटर के माध्यम से दवाओं को इंजेक्ट करना संभव है। उदाहरण के लिए, यह देखा गया है कि माइक्रोट्यूबुल्स को विकृत करने वाली दवा विनक्रिस्टिन के नसों में प्रशासन ने डब्ल्यूटी चूहों से प्रोपलेट्स का पीछे हटना पड़ा, लेकिन मायोसिन आईए-कमी वाले चूहों(Myh9-/-)(वीडियो 5 और वीडियो 6)3से प्रोपलेटलेट्स पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा ।

Figure 1
चित्रा 1:अस्थि मज्जा में प्रोपलेट गठन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से भेदभाव के बाद, बड़े मेगाकारियोसाइट्स साइनसॉयड जहाजों के साथ संरेखित होते हैं और एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से प्रोप्लेलेट्स नामक साइटोप्लाज्मिक अनुमानों का विस्तार करते हैं। डाउनस्ट्रीम माइक्रोसर्कुलेशन में प्लेटलेट्स में आगे फिर से तैयार करने के लिए हीमोडायनामिक बलों के प्रभाव में प्रोपलेटलेट्स विस्तार और अलग हो जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:कैथेटर का सम्मिलन। (क)जुगुलर नस और छाती की मांसपेशी के शीर्ष को बेनकाब करने के लिए एक चीरा लगाया जाता है। (ख)खारे से भरा कैथेटर मांसपेशियों से गुजरकर जुगुलर नस में डाला जाता है, जिससे संपीड़न बिंदु बनता है। (ग)माउस को सावधानीपूर्वक बदल दिया जाता है ताकि यह कैथेटर के साथ नीचे की ओर वेंट्रल सतह पर स्थित हो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से दो फोटॉन इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रायोगिक सेटअप। (A)3डी मुद्रित स्टेनलेस स्टील ब्लॉक एबीएस पॉलिमर समर्थन पर तय किया जाता है (3 डी डिजाइन के लिए पूरक चित्रा S1 और पूरक सामग्री देखें)। ब्लॉक और खोपड़ी की अंगूठी को डिजाइन किया गया है ताकि अंगूठी को ब्लॉक तक खराब किया जा सके। ध्यान दें कि, उपयोग में आसानी के लिए, स्क्रू हेड को एपोन में एम्बेडेड किया गया है। (ख)योजनाबद्ध उजागर खोपड़ी की हड्डी पर अंगूठी की स्थिति दिखा । (ग)खोपड़ी से चिपकी अंगूठी के साथ माउस को दर्शाती तस्वीरें, एक ऊतक पैड पर सिर, और(घ)माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत स्थिति । संक्षिप्त रूप: 3डी = त्रि-आयामी; एबीएस = एक्रिलोनिट्रिल बुटाडीन स्टाइलीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4-खोपड़ी के बोन मैरो एनेस्टोमोसेड साइनसॉयड जहाजों में प्लेटलेट वेग का माप।(क)क्यू-डॉट इंजेक्शन द्वारा लेबल किए गए साइनसॉयड जहाजों की बाईं, दो फोटॉन इमेजिंग। जेड-प्रोजेक्शन खोपड़ी बोन मैरो में साइनसॉयड जहाजों के एनास्टोमोसिस को दिखाता है। तीर प्रवाह की दिशा को इंगित करते हैं, जो साइनसॉइड में प्रवाह की जटिलता को दर्शाते हैं। प्रत्येक पोत शाखा में प्लेटलेट वेग की माप से अनुमानित औसत प्रवाह वेग। एक्स-एक्सिस पर नंबर बाईं ओर छवि में तीर संख्या के अनुरूप हैं। (ख)लेफ्ट, साइनसॉयड बाइफ्यूरेशन को बिंदीदार लाइनों द्वारा चित्रित किया गया, जिसमें विपरीत दिशाओं (लाल और नीले तीर) (वीडियो 1के अनुरूप) में बहने वाले प्लेटलेट्स दिखाई दे रहे हैं । दो फोटॉन सिंगल प्लेन इमेज । सही, एक ग्राफ जो समय के एक समारोह के रूप में पोत के प्रत्येक भाग में प्रवाह वेग दिखाता है (लाल रेखा, बाईं ओर; नीली रेखा, दाईं ओर), स्टेसिस, त्वरण और मंदी के चरणों को दिखाता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5:खोपड़ी मज्जा में दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाए गए विभिन्न प्रोपलेट मोरफोलोजी। (क) वीवो प्रोपलेटलेट्स में तीन प्रतिनिधि: समय-चूक प्रयोगों से जेड-प्रोजेक्शन छवियां (वीडियो 2में दिखाया गया है, पूरक वीडियो 1,और पूरक वीडियो 2)बोन मैरो साइनसॉइड के भीतर विस्तारित प्रॉप्लेलेट्स (तीर) के विभिन्न मोर्फोलोजी दिखाते हैं। प्रोपलेटलेट्स और मेगाकारियोसाइट्स हरे रंग में हैं; साइनसॉयड वाहिकाएं लाल रंग में होती हैं। (ख) चित्रा 4 बीमें एक ही विभाजन में एक प्रोपलेट की समय-चूक छवियां, प्रवाह की दिशा के अनुसार दोलन (वीडियो 3में भी दिखाया गया है) । (ग)जेड-प्रोजेक्शन समय-चूक माउस की हृदय गति रुकने के कारण रक्त प्रवाह की समाप्ति के बाद 3 प्रोपलेटर की छूट दिखाने वाली छवियां (वीडियो 4में दिखाया गया है), पहले एक ही प्रवाह रेखा में गठबंधन (सफेद, पीले और नीले तीर द्वारा इंगित)। स्केल बार = 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6:प्रोपलेटलेट रूपात्मक विश्लेषण। (ए)ऊपरी, जेड-प्रक्षेपण छवि साइट को दर्शाती है जहां प्रॉपरलेट चौड़ाई को अधिकतम लंबाई के साथ मापा गया था; नीचे 25 व्यक्तिगत प्रोपलेटलेट की अधिकतम लंबाई और विस्तार के दौरान एक ही प्रोपलेटलेट (एक ही ग्रे कोड) की औसत प्रोपलेटलेट चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करने वाले रेखांकन हैं। i) प्रोपलेटलेट की चौड़ाई को प्रोपलेट के आधार के करीब एक निश्चित स्थिति पर लंबवत रेखा खींचकर मापा गया था, और प्रोफाइल तीव्रता हर मिनट इस स्थिति में दर्ज की गई थी। इस प्रोफ़ाइल में एक गॉसियन वक्र फिट किया गया था, और एफडब्ल्यूएचएम को प्रोपलेट की चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता था। मतलब चौड़ाई तो तय स्थिति पर हर समय बिंदु पर मापा प्रोपलेट की चौड़ाई औसत से गणना की गई थी। सलाखों के अधिग्रहण के दौरान हर मिनट मापा चौड़ाई के ± सेम मतलब कर रहे हैं; ii) अधिकतम प्रोप्लेलेट लंबाई भी निर्धारित की गई थी, प्रोपलेट के आधार से इसकी टिप तक। (ख)डब्ल्यूटी प्रोपलेट्स के विस्तार व्यवहार को दिखाने वाले व्यक्तिगत ट्रेसिंग, उनमें से कुछ ठहराव और पीछे हटने के चरण पेश करते हैं । प्रोपलेटेलेट विकास की प्रक्रिया पर ठहराव और रिऐक्शन को बेहतर तरह से उजागर करने के लिए, प्रत्येक 10 एस मापा लंबाई प्रत्येक प्रोपलेट की अधिकतम लंबाई के प्रतिशत के रूप में दर्शाया गया था। (ग)प्रॉप्लेलेट विस्तार गति का प्रतिनिधित्व करने वाला स्कैटर प्लॉट। नेट का मतलब प्रोपलेटेलेट विस्तार गति (ठहराव और रिऐक्शन सहित) की गणना 1 मिनट के अंतराल पर प्रोपलेट लंबाई में परिवर्तन के रूप में की गई थी, जो पूरे समय अनुक्रम पर औसत थी। व्यक्तिगत मूल्यों और मतलब ± सेम। संक्षिप्त रूप: FWHM = आधी अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई; एसईएम = मतलब के मानक त्रुटि; WT = जंगली प्रकार।

वीडियो 1: साइनसॉयड जहाजों के भीतर रिवर्स प्रवाह। साइनसॉयड जहाजों (लाल, क्यूट्रैकर) (एकल कॉन्फोकल जेड-प्लेन) के भीतर परिसंचारी प्लेटलेट्स (हरा)। एक एनास्टोमोसेड साइनसॉइड पोत को विभाजन पेश करते हुए दिखाया गया है जहां प्रवाह अस्थिर है और स्टेसिस, त्वरण और मंदी के चरणों को प्रदर्शित करता है। एक Leica SP5 माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत एक 12 kHz सुनाई देती है स्कैनर और ०.९५ (Leica), एक विमान, २५६ x ९० पिक्सल, द्विदिशात्मक अधिग्रहण, लाइन औसत 2, १३३ फ्रेम/एस के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 25x पानी उद्देश्य के साथ यहां क्लिक करें इस वीडियो डाउनलोड करने के लिए ।

वीडियो 2: प्रोपलेट्स को बढ़ाने के लिए विभिन्न मॉर्फोलोजी प्रदर्शित करते हैं। एक डब्ल्यूटी माउस में प्रतिनिधि समय-चूक वीडियो रिकॉर्डिंग (जेड-प्रोजेक्शन) मेगाकारियोसाइट्स के साथ बोन मैरो साइनसॉइड (लाल, क्यूट्रैकर) के भीतर विभिन्न मॉर्फोलॉजी (हरे) के साथ प्रोपलेट्स का विस्तार करते हैं। एक Leica SP5 माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत एक 12 kHz सुनाई देती स्कैनर और ०.९५ (Leica) के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 25x पानी उद्देश्य के साथ, जेड-स्टैक अधिग्रहण 10 एस अंतराल पर, जेड-गहराई 4 माइक्रोन, एक्स-वाई संकल्प ३८४ x ३८४ पिक्सेल, लाइन औसत 8 । जब भी आवश्यक हो, प्रोफाइल को औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त करने के लिए इमेजजे टेम्पलेट मिलान प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था। छवि की गुणवत्ता के आधार पर, पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 3: प्रोप्लेलेट्स प्रवाह दिशा में परिवर्तन से उछाले जाते हैं। समय-चूक वीडियो वीडियो 1में दिखाए गए साइनसॉयड विभाजन में एक जंगली प्रकार के मेगाकार्योसाइट को दिखाया गया है, जो प्रवाह (जेड-प्रक्षेपण) की दिशा के आधार पर एक पोत शाखा में दोलन करता है। एक Leica SP5 माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत एक 12 kHz सुनाई देती स्कैनर और ०.९५ (Leica) के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 25x पानी उद्देश्य के साथ, जेड-स्टैक अधिग्रहण 10 एस अंतराल पर, जेड-गहराई 4 माइक्रोन, एक्स-वाई संकल्प ३८४ x ३८४ पिक्सेल, लाइन औसत 8 । प्रोफाइल को इमेजजे टेम्पलेट मैचिंग प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था, और एक औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त किया गया था। पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 4: प्रोपलेट संरेखण और तनाव पर प्रवाह का प्रभाव। कार्डियक अरेस्ट से पहले और बाद में प्रॉपरलेट की टाइम-लैप्स वीडियो रिकॉर्डिंग। वीडियो में कार्डियक अरेस्ट से पहले एक ही फ्लो लाइन में तीन प्रोपलेट्स (ग्रीन, एएफ-४८८ एंटी-जीपीएक्स एंटीबॉडी डेरिवेटिव के साथ लेबल) दिखाया गया है, इस प्रकार दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के संकल्प पर खराब व्यक्ति । हृदय की गिरफ्तारी के बाद, तीनों प्रोपलेटर अलग हो जाते हैं और रक्त प्रवाह के अभाव में आराम हो जाते हैं। एक Leica SP8 कंफोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत वीडियो एक 8 kHz सुनाई देती स्कैनर, ०.९५ (Leica) के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 25x पानी उद्देश्य के साथ छवि से लैस । प्रोफाइल को इमेजजे टेम्पलेट मैचिंग प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था, और एक औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त किया गया था। पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 5: डब्ल्यूटी चूहों के प्रोपलेट व्यवहार पर विनक्रिस्टाइन दवा इंजेक्शन का प्रभाव। विनक्रिस्टाइन (1 मिलीग्राम/किलो) (जेड-प्रोजेक्शन) के प्रशासन से पहले और बाद में एक प्रोपलेट की समय-चूक वीडियो रिकॉर्डिंग । साइनसॉयड जहाजों (लाल) के भीतर विस्तारित प्रोपलेट (हरा) विनक्रिस्टीन के नसों में प्रशासन के बाद वापस लेना शुरू कर देता है। वीडियो को 8 किलोहर्ट्ज सुनाई देने वाले स्कैनर से लैस एक Leica SP8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था, 0.95 (Leica) के संख्यात्मक एपर्चर के साथ 25x पानी के उद्देश्य के साथ छवि। प्रोफ़ाइल को इमेजजे टेम्पलेट मिलान प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था, और एक औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त किया गया था। पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 6: मायोसिन की कमी वाले चूहों के प्रोपलेट व्यवहार पर विनक्रिस्टिन दवा इंजेक्शन का प्रभाव। विनक्रिस्टाइन (1 मिलीग्राम/किलो) (जेड-प्रोजेक्शन) के प्रशासन से पहले और बाद में एक प्रोपलेट की समय-चूक वीडियो रिकॉर्डिंग । साइनसॉयड जहाजों (लाल) के भीतर विस्तारित प्रोपलेट (हरा) Myh9-/-चूहों में विस्तारित करने के लिए जारी है । वीडियो को 8 किलोहर्ट्ज सुनाई देने वाले स्कैनर से लैस एक Leica SP8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था, 0.95 (Leica) के संख्यात्मक एपर्चर के साथ 25x पानी के उद्देश्य के साथ छवि। प्रोफ़ाइल को इमेजजे टेम्पलेट मिलान प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था, और एक औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त किया गया था। पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S1: खोपड़ी की अंगूठी और समर्थन के 3 डी प्रिंटिंग के लिए डिजाइन करें। इस डिजाइन का उपयोग उच्चगुणवत्ता वाले स्टेनलेस स्टील में खोपड़ी की अंगूठी,(बी)स्क्रू,(सी)स्टेनलेस स्टील में ब्लॉक, औरएबीएसबहुलक में समर्थन के लिए किया गया था। संक्षिप्त रूप: 3डी = त्रि-आयामी; एबीएस = एबीएस = एक्रिलोनिट्रिल ब्यूटाडीन स्टाइलीन। कृपया इस चित्र को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक वीडियो:

पूरक वीडियो 1: एक जंगली प्रकार के माउस में प्रतिनिधि समय-चूक वीडियो रिकॉर्डिंग (जेड-प्रोजेक्शन) जिसमें मेगाकारियोसाइट्स बोन मैरो साइनसॉइड (लाल, क्यूट्रैकर) के भीतर प्रोपलेट (ग्रीन) का विस्तार करते हैं। एक Leica SP5 माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत एक 12 kHz सुनाई देती स्कैनर और 0.95 (Leica) के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 25x पानी उद्देश्य के साथ, जेड-स्टैक अधिग्रहण 10 एस अंतराल पर, जेड-गहराई 1.34 माइक्रोन, एक्स-वाई संकल्प 384 x 384 पिक्सेल, लाइन औसत 8 के साथ। जब भी आवश्यक हो, प्रोफाइल को औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त करने के लिए इमेजजे टेम्पलेट मिलान प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था। छवि की गुणवत्ता के आधार पर, पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक वीडियो 2: एक जंगली प्रकार के माउस में प्रतिनिधि समय-चूक वीडियो रिकॉर्डिंग (जेड-प्रोजेक्शन) जिसमें मेगाकारियोसाइट्स बोन मैरो साइनसॉइड (लाल, क्यूट्रैकर) के भीतर प्रोपलेट (ग्रीन) का विस्तार करते हैं। एक Leica SP5 माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत एक 12 kHz सुनाई देती स्कैनर और 0.95 (Leica) के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 25x पानी उद्देश्य के साथ, जेड-स्टैक अधिग्रहण 10 एस अंतराल पर, जेड-गहराई 1.34 माइक्रोन, एक्स-वाई संकल्प 384 x 384 पिक्सेल, लाइन औसत 8 के साथ। जब भी आवश्यक हो, प्रोफाइल को औसत जेड-प्रोजेक्शन प्राप्त करने के लिए इमेजजे टेम्पलेट मिलान प्लग-इन का उपयोग करके गठबंधन किया गया था। छवि की गुणवत्ता के आधार पर, पृष्ठभूमि को घटाया गया था, छवि को चिकना किया गया था, और चमक और विपरीत समायोजित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक सामग्री:

कोडिंग फाइल 1: 3डी प्रिंटिंग-ब्लॉक। ब्लॉक की छपाई के लिए 3डी ऑब्जेक्ट फाइल। इस कोडिंग फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

कोडिंग फाइल 2: 3डी प्रिंटिंग-खोपड़ी की अंगूठी। खोपड़ी की अंगूठी की छपाई के लिए 3डी ऑब्जेक्ट फाइल। इस कोडिंग फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

कोडिंग फाइल 3: 3डी प्रिंटिंग-सपोर्ट। समर्थन की छपाई के लिए 3D ऑब्जेक्ट फ़ाइल। इस कोडिंग फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

कोडिंग फाइल 4: 3डी प्रिंटिंग-स्क्रू रिंग। पेंच की छपाई के लिए 3डी ऑब्जेक्ट फाइल। इस कोडिंग फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्लेटलेट बनने के तंत्र बोन मैरो पर्यावरण पर अत्यधिक निर्भर हैं। इसलिए, वास्तविक समय में प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए क्षेत्र में इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है। फ्लोरोसेंट मेगाकारियोसाइट्स वाले चूहों को सशर्त फ्लोरोसेंट जीन अभिव्यक्ति कैसेट वाले किसी भी फ्लैक्सेड रिपोर्टर चूहों के साथ मेगाकारियोसाइट्स में क्रे रिकॉम्बेन्नेस व्यक्त करने वाले चूहों को पार करके प्राप्त किया जा सकता है। यहां, mTmG रिपोर्टर चूहों का इस्तेमाल किया गया (B6.129 (सीजी)-जीटी(रोजा) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP) Luo10)Pf4-cre चूहों11के साथ पार कर, मेगाकारियोसाइट्स और प्लेटलेट्स12में तीव्र हरे रंग की फ्लोरेसेंस लेबलिंग की अनुमति । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ल्यूकोसाइट्स में पीएफ 4-क्रे चूहों के साथ कुछ रिसाव की सूचना दी गई है, जिसमें मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट12, 13शामिल हैं।

हालांकि, मेगाकारियोसाइट्स आसानी से अपने बड़े आकार और नाभिक से पहचाने जाते हैं। क्षेत्र में नए प्रयोगकर्ता [एमटीएमजी में टिप्पणियों की तुलना कर सकते हैं; Pf4-cre] मेगाकार्योसाइट-विशिष्ट लेबलिंग के बाद प्राप्त चूहों के साथ चूहों। यह प्लेटलेट-विशिष्ट प्रोटीन, जीपीआईएक्स (सीडी 42ए)3,14के खिलाफ निर्देशित एलेक्सा-फ्लोर-लेबल एंटीबॉडी के नसों में प्रशासन के माध्यम से संभव है। यह उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के साथ थकाऊ और समय लेने वाले माउस क्रॉसिंग के प्रदर्शन के बिना किसी भी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस से फ्लोरोसेंट मेगाकार्योसाइट्स इमेजिंग के लिए भी फायदेमंद है। यहां, 5-7 सप्ताह पुराने चूहों को एक पतली हड्डी के साथ मौजूद छोटे चूहों के रूप में इस्तेमाल किया गया था जो अधिक पारदर्शी है और पुराने चूहों की तुलना में इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, चूहों कि बहुत युवा हैं रिसाव के बिना कपाल अंगूठी की स्थापना में कठिनाइयों को पेश कर सकते हैं।

इस अध्ययन में, इंट्राविटल इमेजिंग 0.95(सामग्री की तालिका)के संख्यात्मक अपर्चर के साथ 25x पानी के उद्देश्य से लैस एक लीका माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। उद्देश्य शंकु होना चाहिए ताकि यह एक इष्टतम काम दूरी के साथ कपाल की अंगूठी द्वारा गठित कप में प्रवेश कर सके। छवियों को एक सुनाई देने वाली स्कैनर (12 या 8 किलोहर्ट्ज) के साथ रिकॉर्ड किया गया था। समग्र सेटिंग्स वैज्ञानिक प्रश्न के प्रकार पर निर्भर करेगा जवाब दिया जाएगा और आवर्धन, संकल्प, और अधिग्रहण की जरूरत की गति के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, 12 किलोहर्ट्ज सुनाई देने वाला स्कैनर के साथ, प्लेटलेट वेग को मापने के लिए 25x उद्देश्य बेहतर होगा, जबकि 8 किलोहर्ट्ज स्कैनर और कम आवर्धन प्रोपलेट विस्तार को रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त हो सकता है।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम खोपड़ी की हड्डी के लिए अंगूठी का सही लगाव है ताकि कोई रिसाव न हो, और ताकि रिकॉर्डिंग के दौरान यह अलग न हो। इसके लिए जरूरी है कि अंगूठी लगाने से ठीक पहले खोपड़ी की हड्डी सूखी हो। एक बार जब अंगूठी चिपकी हो जाती है, तो हड्डी को तेजी से फिर से ह्यूमिडिफाई करें। इसके अलावा, अंगूठी पर सिर के वजन से लगाए गए बल के कारण, अंगूठी को तनाव का शिकार होना पड़ता है जो रिकॉर्डिंग के दौरान आंशिक रूप से अलग हो सकता है। यह रिसाव का कारण बन सकता है और इस प्रकार, हड्डी का सूखापन, जिससे खराब गुणवत्ता वाली छवियां और अवांछनीय भड़काऊ प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। सिर(चित्रा 3सी)का समर्थन करने के लिए माउस की नाक के नीचे एक जोड़ संपीड़न जोड़कर इस समस्या से आसानी से बचा जा सकता है। एक और महत्वपूर्ण बिंदु रक्तस्राव और अंगूठी के अंदर रक्त की उपस्थिति को कम करना है क्योंकि इससे धुंधली छवियां हो सकती हैं। चूहों का अध्ययन करते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए जो दोषपूर्ण हेमोसिस पेश करते हैं और रक्तस्राव का खतरा होता है। डेक्सट्रान जैसे कुछ ट्रेसर, बोन मैरो गुहा में रिसाव पेश कर सकते हैं, अगर एक केंद्रित रूप में इंजेक्शन दिया जाता है, जो पोत इमेजिंग को खराब करता है, हालांकि मेगाकारियोसाइट्स का हरा फ्लोरेसेंस नहीं है। Qtracker-६५५ ज्यादा लीक नहीं करता है, लेकिन 30 मिनट के भीतर संचलन से मंजूरी दे दी है ताकि ट्रेसर के नए इंजेक्शन लंबी अवधि में जहाजों की कल्पना करने के लिए आवश्यक हैं ।

इस विधि की एक सीमा यहां वर्णित एनेस्थेटिक्स को फिर से इंजेक्ट करने के लिए हर 35 मिनट में अधिग्रहण को रोकने की आवश्यकता है। यदि एनेस्थीसिया मशीन उपलब्ध है तो इस सीमा को दूर किया जा सकता है। उस मामले में, संज्ञाहरण को केटामाइन और जाइलाज़ीन के मिश्रण के आईपी इंजेक्शन द्वारा इसी तरह प्रेरित किया जा सकता है, जो कैथेटर और माइनर सर्जरी के सम्मिलन को करने का सबसे आसान तरीका है। एक बार माइक्रोस्कोप उद्देश्य के नीचे तैनात होने के बाद, संज्ञाहरण को गैसों (ऑक्सीजन का मिश्रण, एनेस्थेटिक्स जैसे आइसोफ्लाणे और परिवेशी हवा) का साँस लेना द्वारा बनाए रखा जाता है। इस तरह, बिना किसी रुकावट के कई घंटों में टिप्पणियां की जा सकती हैं। हालांकि, नैतिक कारणों से, टिप्पणियों को इस अध्ययन में 3 घंटे तक सीमित किया गया था। केटामाइन/जाइलाज़ीन मिश्रण का उपयोग करने में एक और सीमा प्लेटलेट कार्यों पर इसका संभावित हानिकारक प्रभाव हो सकता है16 कि वैकल्पिक संज्ञाहरण योजनाओं की आवश्यकता हो सकती है ।

कुल मिलाकर, इस अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल की प्रमुख योग्यता केवल न्यूनतम सर्जरी के साथ इसका गैर-विकासात्मक पहलू है। लंबी हड्डियों में टाइम-लैप्स इंट्राविटल इमेजिंग करने के लिए अन्य प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। ये या तो आक्रामक सर्जरी पर निर्भर करते हैं , जिसके लिए मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने और हड्डी के घर्षण की आवश्यकता होती है17,18, प्रत्यारोपित एंडोस्कोपिक जांच फीमर हेड19,20 के करीब होती है या फीमर21में एक खिड़की कक्षस्थापितकरती है। इन सभी प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप प्रमुख आघात और सूजन की डिग्री अलग-अलग होती है। सूजन न केवल माउस के लिए हानिकारक है, बल्कि प्लेटलेटगठन 6 की प्रक्रिया को संशोधित करने के लिए भी सूचित किया गया है ताकि अनियंत्रित भड़काऊ स्थितियों से विसंगतियां पैदा हो सकें और डेटा की गलत व्याख्या हो सके। यही कारण है कि भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए इस प्रक्रिया को चुना गया था। हालांकि, वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर, प्रयोगकर्ता एक गहरे अवलोकन क्षेत्र और उच्च संकल्प (कम बिखरने) को पसंद कर सकते हैं, जो कम मात्रा में भड़काऊ प्रतिक्रिया की कीमत पर खोपड़ी-पतले-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके संभव है।

इसकी अवृक्ष प्रकृति के कारण, इस विधि की प्रमुख सीमा अधिकतम गहराई है जिसे पहुंचा जा सकता है। हड्डी के घनत्व और उसके बिखरने वाले गुणों के कारण, पूरे कैल्वेरल मैरो की टिप्पणियों को रोकने, केवल कुछ सौ माइक्रोमीटर की गहराई के भीतर क्षेत्रों को छवि देना संभव है। तीन फोटॉन माइक्रोस्कोपी का विकास, जो और भी उच्च अवरक्त उत्तेजन तरंगदैर्ध्य पर निर्भर करता है, बेहतर गहरे ऊतक संकल्प के साथ एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रतीत होता है। यह पहले से ही सफलतापूर्वक हड्डी22, 23के माध्यम से भी मस्तिष्क में गहरी छवि के लिए इस्तेमाल किया गया है, हड्डी पतली या एक शल्य खिड़की प्रत्यारोपण के बिना लंबी हड्डियों के भीतर अस्थि मज्जा छवि के लिए रोमांचक संभावना को खोलने ।

संक्षेप में, इस विधि का उपयोग बोन मैरो में मेगाकारियोसाइट्स के व्यवहार का अध्ययन करने और प्रोपलेटर्स के विस्तार की कल्पना करने के लिए तेजी से किया जाता है। इसके अलावा, बाहरी कैल्वरियल कॉम्पैक्ट हड्डी के दृश्य के साथ-साथ अंतर्निहित मज्जा के हिस्से की अनुमति देकर, इस विधि का उपयोग पहले से ही प्लेटलेट क्षेत्र के बाहर कई अनुप्रयोगों में किया जा चुका है। इसका उपयोग उनके पर्यावरण में हड्डी और मैरो सेल गतिशीलता दोनों के अध्ययन के लिए किया गया है, जिसमें ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोक्लास्ट, ल्यूकोसिटे ट्रैफिकिंग और मैरो निकास, एंडोथेलियल कोशिकाएं और माइक्रोवसकुलेचर आर्किटेक्चर, मैरो माइक्रोवेसेल्स में रक्त प्रवाह गतिशीलता, या सेल होमिंग24शामिल हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को फ्लोरियन Gaertner (विज्ञान और प्रौद्योगिकी संस्थान ऑस्ट्रिया, Klosterneuburg, ऑस्ट्रिया) समय पर दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगों पर अपनी विशेषज्ञ सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते है जब हम प्रयोगशाला में तकनीक की स्थापना की, और इमेजिंग सेंटर IGBMC में Yves Lutz/ हम जीन-येव्स रिंकल को उनकी तकनीकी मदद और आईएनएस गिनीर्ड को चित्र 1 में स्कीमा की ड्राइंग के लिए भी धन्यवाद देते हैं। हम दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण में इसके समर्थन के लिए एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक) को धन्यवाद देते हैं। एबी को एटब्लिसमेंट फ्रैंकैस डु सांग (APR2016) से और एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे (एएनआर-18-सीई14-0037-01) से पोस्ट-डॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GNU Octave software GNU Project https://www.gnu.org/software/octave/
 Histoacryl 5 x 0, 5 mL Braun 1050052 injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes Leica Microsystems
ImageJ GNU project Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL Boehring 03661103003199 eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 Leica Microsystems simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab MathWorks https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g Laboratoires T.V.M. 03700454505621 Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed Rotec 13001002
Qtracker 655 vascular label Invitrogen Q21021MP injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL Bayer 04007221032311
Superglue gel to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G Terumo SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  2. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
  3. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
  4. Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
  5. Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
  6. Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
  7. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  8. Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
  9. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  11. Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
  12. Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
  13. Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
  14. Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
  15. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  16. Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
  17. Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
  18. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
  19. Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
  20. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
  21. Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
  22. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
  23. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  24. Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 173 दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी इंट्राविटल ऑब्जर्वेशन खोपड़ी बोन मैरो मेगाकारियोसाइट्स प्रोपलेटलेट्स
<em>वीवो में</em> माउस खोपड़ी बोन मैरो में मेगाकैरियोसाइट्स और प्रोपलेट्स की दो फोटॉन इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F.,… More

Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F., Gachet, C., Léon, C. In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow. J. Vis. Exp. (173), e62515, doi:10.3791/62515 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter