Fabrikation af en krystallinsk nanocellulose Indlejret Agarose Biomaterial Ink til knoglemarvs-afledt mast cellekultur

Denne protokol tilbyder en nem og hurtig tilgang til at screene kandidat biomateriale blæk for potentielle cytotoksiske virkninger mod følsomme primære og immunceller forud for komplekse 3D bioprinting eksperimenter. Efter inkubation af immuncellerne på biomateriale blækkonstruktionerne kan cellerne let hentes fra konstruktionerne ved blid vask for at udføre downstream cytotoksicitet eller biomarkøranalyser. Denne protokol er direkte relevant for vævsteknik, hvor bioprintet væv, der er bestemt til transplantation, skal konstrueres af primære celler og biokompatiible biomaterialetrykfarver.

Til at begynde med skal du forberede en bioblækpatron til installation på INKREDIBLE+3D bioprinteren. Fjern først de blå endehætter fra den tre milliliter biomaterialeblækpatron og anbringe en steril 22 gauge føisk bioprinting dyse til Luer-låsenden af bioblækpatronen. Tilslut lufttryksforsyningsslangen til printhoved en eller PH1 til den modsatte ende af patronen, og sæt patronen med den tilhørende koniske bioprintdyse i PH1’s lodrette slot.

Sæt derefter patronen fast i PH1 med en konisk bioprintdyse, der strækker sig under printhovedet. Stram skruen på PH1 med uret, indtil fingeren er stram for at låse bioblækpatronen på plads. Bemærk, at 3D bioprint kan udføres med PH2 venstre tom.

Tænd for bioprinteren, og start bioprintersoftwaren på en pc, der er tilsluttet 3D-bioprinteren via et USB 2.0-kabel. Klik på knappen Opret forbindelse i softwaren for at synkronisere den med 3D-bioprinteren. Overhold tre muligheder i hovedkontrolmenuen på 3D-bioprinteren.

Først skal du forberede bioprint. For det andet, hjælpeprogrammer menu. Og for det tredje status skærm.

Vælg indstillingen Forbered bioprint, og rul derefter ned til , og vælg indstillingen for hjemmeakser. Efter en vellykket kalibrering af XYZ-akserne sænkes højden på udskriftssengen en smule, og printhovederne flyttes til over skrivesengens midtpunkt. For at fortsætte med udgangspunktskalibreringen til bioprint i 24-brøndsplader skal du fjerne en steril 24-brønds kulturplade fra sin forseglede plastindpakning og markere en prik på midten af brønden D1 på undersiden af pladen med en permanent markør.

Fjern pladedækslet og læg 24-brøndskulturpladen på printsengen med brønd D1 placeret i det forreste venstre hjørne af printsengen. Vælg menuen Hjælpeprogrammer i hovedkontrolmenuen, og flyt derefter aksen. Flyt printhovederne i en millimeter trin langs X og Y akser, indtil den koniske bioprinting dyse af PH1 er direkte over pryden markeret under godt D1. Hvis det er nødvendigt, skal du finjustere placeringen af den koniske bioprintdyse over pryden ved at flytte printhovederne i intervaller på 0,1 millimeter.

Optag X- og Y-koordinaterne for den koniske bioprintdyse, når den er direkte over midten af brønden D1 som angivet i kontrolpanelskærmen på 3D-bioprinteren, og markér koordinaterne. Løft derefter udskriftslejet i en millimeter trin, indtil bunden af brønden D1 næsten rører den koniske bioprinting dyse installeret i printhead en. Finjuster om nødvendigt trykbundens bevægelse i intervaller på 0,1 millimeter.

Vælg Z-aksekalibreringsindstillingen i hjælpemenuen, og vælg og bekræft kalibreringsindstillingen for butik Z yderligere. Gå tilbage til hovedmenuen, og vælg indstillingen Forbered bioprint. Rul ned til , og vælg indstillingen kalibrer Z.

Opdater geometrisk kode eller G-kode med 24 brønde med de korrekte udgangspunktskoordinater. Åbn den medfølgende 24-brønd G-kodefil på bioprint-softwaren. Opdater X- og Y-koordinaterne på linje et med de værdier, der er opnået i tidligere trin, og gem filen under et nyt navn.

Sørg for, at den pneumatiske pumpe er tæt forbundet med den bageste luftindtagsport på INKREDIBLE+3D bioprinteren, og tænd den. Træk den forreste betjeningsknap frem, der er placeret i højre side af INKREDIBLE+3D bioprinteren. Sørg for, at de digitale trykmålere til PH1 og PH2 placeret på forsiden af bioprinteren hver læser tæt på nul kilopascal.

Drej langsomt den forreste kontrolknap med uret, indtil trykket angivet på venstre måler for PH1 når 12 kilopascals. Placer et foldet silkepapir eller et stykke vandtæt forseglingsfilm under den installerede patrons printdyse, idet du skal passe på ikke at røre ved printdysen. Vælg forbered bioprint i hovedkontrolmenuen på 3D-bioprinteren.

Gå til og vælg slå PH1 til. Bemærk, at bioblæk begynder at ekstrudere fra printdysen. Hvis det er nødvendigt, øge ekstrudering trykket ved at dreje kontrolknappen med uret, indtil bio blæk er ekstruderet i en kontinuerlig glødetråd og registrere den nye trykindstilling.

Vælg slå PH1 fra for at stoppe ekstrudering af bioblæk. Fjern silkepapir eller film, der indeholder det ekstruderede bioblæk, fra printsengen, og luk bioprinterdøren. For at udføre 3D bioprinting af retlinede hydrogelsubstrater i et 24-brønds pladeformat skal du vælge hjælpeprogrammerne i hovedkontrolmenuen og derefter vælge deaktivere SD-print, som gør det muligt for bioprintersoftwaren at overføre G-kodefiler til 3D-bioprinteren til udskrivning.

Klik på belastningsknappen i bioprintersoftwaren, og vælg den opdaterede G-kodefil med 24 brønde. I højre kontrolpanel i softwaren skal du vælge fanen Vis udskrift og klikke på trykknappen for at begynde at bioprinte i brønd D1. Når bioprinting af de retlinede konstruktioner er afsluttet, skal den 24-brønds plade med låget dækkes og flyttes til et klasse II biosikkerhedskab. Fordyb hver retlinet konstruktion i to dråber steril 50 millimolar calciumchloridopløsning og inkuber ved stuetemperatur i fem minutter.

Ansugning af calciumchloridopløsningen forsigtigt fra hver brøndkonstruktion og skyl en gang i en milliliter på 1X PBS for at fjerne overskydende calciumchlorid. For at forhindre dehydrering af de bioprintede hydrogelkonstruktioner skal de 3D bioprintede retlinede konstruktioner opbevares i frisk 1X PBS, indtil de knoglemarvsbaserede mastceller er klar til at blive sået på konstruktionerne. Baseret på de frem- og side scatterparametre for BMMCs analyseret af flowcytometri blev det observeret, at hydrogelsubstratet med den højeste CNC-koncentration ikke ændrede BMMCs oprindelige størrelse eller granularitet sammenlignet med de BMMCs, der blev kultiveret i mangel af CNC-agarose D-mannitol hydrogel substrater.

Flowcytometrisk analyse af BMMCs’s permeabilitet over for propidiumiodid viste, at ingen af de testede CNC-koncentrationer fremkaldte nogen negativ indvirkning på BMMC’s levedygtighed. CNC-agarosesubstratet øgede ekspressionen af mastcellebiomarkørerne ved CNC-koncentrationer, der var større end eller lig med 2,5%Men ekspressionsniveauet for disse receptorer forblev relativt konsistent mellem 2,5% og 12,5%CNC, hvilket tyder på en effekt, der er uafhængig af koncentrationen af CNC. XTT-analysen viste, at BMMCs metaboliske aktivitet, der dyrkes på 3D-bioprintede hydrogel stilladser, forblev relativt konsistente på omkring 100% på tværs af alle testede tidpunkter.

På samme måde afslørede analyserne af LDH-frigivelsen og pi-farvestofekskluderingen ingen væsentlige ændringer i BMCCs’ levedygtighed. Den lethed, hvormed mastcellerne kan hentes, gør det muligt for dem at blive undersøgt af en bred vifte af biologiske analyser for yderligere at studere ethvert aspekt af deres cellulære funktioner.