Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הליך אריזת העמודות הנימיות של FlashPack הממוטב. יישום פרוטוקול ממוטב להתקנת פצצת לחץ נפוצה של 100 ברים מאפשר אריזה וייצור מהירים פי 10 של עמודות נימיות ארוכות בעלות ביצועים גבוהים במיוחד.
Abstract
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים נימיים אולטרה-גבוהים (UHPLC) היא כיום שיטה לבחירה עבור שלב הפרדת הדגימה בפרוטומיקה מבוססת LC-MS. עם זאת, עמודות נימיות הרבה פחות חזקות בהשוואה לאסיפים הנגדיים של הזרימה הגבוהה יותר שלהן. בגלל זיהום קל וחסימה, לעתים קרובות הם זקוקים להחלפה. זה הופך אותם לחלק יקר במידה ניכרת מעלות הניתוח הכוללת של LC-MS. אריזה פנימית של עמודות נימי UHPLC חוסכת הרבה כסף ומאפשרת התאמה אישית. עם זאת, הליך האריזה הסטנדרטי בפצצת הלחץ של 100 עמודות פועל היטב רק עבור עמודות HPLC אך הוא איטי מדי עבור סורבנטים UHPLC. כאן אנו מספקים תיאור של פרוטוקול FlashPack ממוטב החל על אותה הגדרת פצצת לחץ של 100 ברים. השיטה מבוססת על אריזה מצפיפות ריכוז סורבטים גבוהה במיוחד והיא מפותחת לייצור פנימי של עמודות נימיות UHPLC באורך בלתי מוגבל בזמן סביר.
Introduction
פרוטאומיה מודרנית מבוססת על ספקטרומטר מסה משולב כרומטוגרפיה נוזלית עם כרומטוגרפיה ננו-זרימה בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (הפרדת קוטר פנימי (ID) של 50-150 מיקרומטר ( ID)) המספקת את מהירות הניתוח והרגישות הטובות ביותר1. בעוד עמודות נימי UHPLC מסחריות רבות זמינות, המחיר שלהם מהווה חלק מרכזי של עלות מתכלים, במיוחד כאשר פרויקטים מגוונים מרובים מנוהלים במעבדה וזיהום טורים ספציפי לפרויקט הוא בעיה תכופה. חוץ מזה, אריזת עמודות בתוך הבית מאפשרת שימוש בסורבטים ספציפיים לניסוי מותאם אישית (כגון, למשל, פוליקט-Asorbent 2) ומאפייני עמודה שאינם זמינים לקנייה כעמודה מוכנה מראש.
כדי להתמודד עם זה, מעבדות רבות אורזות עמודים נימים בתוך הבית. עם זאת, הליך האריזה הנפוץ עם פצצת לחץ של 100 בר (תא הזרקת לחץ) 3 אינומתאים לאריזת העמודים UHPLC עקב לחץ גב גבוה של סורבנטים UHPLC מתחת ל-2 מיקרומטר וכתוצאה מכך ירידה דרמטית בשיעור האריזה בהשוואה לסורבנטים גדולים יותר של HPLC. בעוד עמודות UHPLC קצרות עדיין יכול להיות ארוז לאט מאוד, ייצור של עמודות UHPLC ארוכות הוא בלתי אפשרי פיזית4.
אריזת טור נימי סטנדרטית נעשית בלחצים נמוכים יחסית עד 100 ברים, ועם ריכוז דל מאוד של סורבטים. לפיכך, שני כיוונים אפשריים של האצת התהליך זמינים. ניתן להגדיל את לחץ האריזה5. עם זאת, זה דורש ציוד מיוחד, ולמעשה, התקנה של שיטה חדשה במעבדה. דרך נוספת היא להגדיל את ריכוז slurryסורבט 6. אריזת ריכוז סורבט גבוהה מתוארת בשילוב עם לחץ אריזה גבוה במיוחד בפרסום הקודם7. עם זאת, בלחץ 100 בר, אשר משמש ברוב פצצות האריזה הקיימות, ריכוז sorbent גבוה יותר תוצאות או קצב האריזה האטה או הפסקת אריזה על הסף. ההשפעה הוכחה לאחרונה בשל קיבוץ סורבטים בכניסה לעמוד, וטריק פשוט של חוסר היציבות של כיפה סורבט על ידי פטיש הכניסה לעמוד עם מוט מגנט בתוך מטען סורבט הוצע4. השיטה המתקבלת, הנקראת FlashPack, משתמשת באותה הגדרת אריזת פצצת לחץ של 100 ברים. יחד עם זאת, שינויים קלים אך קריטיים בהליך האריזה מאפשרים אריזה מריכוז וריכוז סורבט גבוה מאוד וייצור של עמודות UHPLC ארוכות מאוד (50 עד 70 ס"מ, וארוכ יותר) בפחות משעה, בעוד עמודה קצרה יכולה להיות מיוצרת תוך דקות עם איכות ההפרדה השווה לעמודות מסחריות של אותםפרמטרים 4. גישת FlashPack כבר שימשה בהצלחה בפרויקטים מרובים פרוטאומיים להכנת שני שלב הפוך (RP)8,9,10,11,12,13,14 ואינטראקציה הידרופילית (HILIC)2 עמודות נימיות.
כאן אנו מתארים בפירוט, את השינויים הדרושים להתאמה של גישת FlashPack להליך אריזת פצצת הלחץ הסטנדרטי של 100 בר.
Protocol
פרוטוקול האריזה מורכב מחמישה שלבים(איור 1):1) הכנת תחנת אריזה, 2) הכנה נימית, 3) הכנת רפת סורבט, 4) אריזה נימית בפצצת הלחץ, ו-5) אריזת עמודות במערכת HPLC, חיתוך עד לגודל והתקנת חיבור UHPLC. אופטימיזציית FlashPack דורשת לבצע התאמות בסעיפים 3 ו -4 בהשוואה לפרוטוקול המשותף.
1. הרכבת תחנת אריזה
- הכן מיכל דלק מלא בחנקן, הליום או ארגון מרוהט עם וסת גז שלב אחד עם לחץ השקע > 50 ברים. הלחץ המרבי מוגבל על ידי תאימות פצצת הלחץ.
- חבר את הווסת לשסתום האוורור של פצצת הלחץ.
- אם פצצת הלחץ אינה מצוידת במפזר מגנטי משולב, מניחים את הפצצה על מערבב מגנטי.
- חבר צינורות פלסטיק מזהה צר (למשל, 0.13 מ"מ) לשקע האוורור של פצצת הלחץ והכניס אותו לכלי עם מים.
2. הכנה נימית
- הכינו נימי מגולגל עם פריט זכוכית משולב שנוצר מקאסיל ו-formamide15 או נימי פולט משוך שהוכן על ידי מושך לייזר16. הנימי עשוי 10-15 ס"מ יותר מאורך העמודה המיועד.
הערה: ראה טבלה 1 לדיון בנושאים אפשריים המשויכים לגדלים נימיים וסוגי פריט שונים. טבלה 2 מכילה דוגמה לתוכנית משיכת לייזר P2000 להכנת נימים פולט משך. - הגן על קצה פולט משוך עם קצה פיפטה חתוך לטעינת ג'ל.
- חותכים את הקצה כך שהוא מתאים בחוזקה סביב נימי OD 360 מיקרומטר (זה יכול להיות מועבר לאורך נימי אבל דורש קצת מאמץ לעשות את זה).
- החלק את קצה הפיפטה החתוך על נימי מכיוון הקצה הקדמי הנימי והעביר אותו לקצה הפולט.
- החלק/י אחורה את קצה ההגנה בעת ריסוס העמוד. החלק את הקצה קדימה כדי שקצה המקרן יהיה בתוך הקצה כאשר העמודה אינה מרוססת (גם כאשר העמודה נמצאת מתחת לזרימה, אך עדיין לא מרססת).
3. הכנת סורבט
- הכן מקטורן סורבט מלאי: מניחים ~ 50 מ"ג של סורבנט יבש לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. כאן, Reprosil Pur C18 משמש כדוגמה.
- הוסף 1 מ"ל של מתנול לצינור סורבט.
- כדי לערבב אותו לחלוטין, מערבולת הצינור עבור 10 s באמצעות מערבל מערבולת.
- סוניקאט באמבט sonication במשך 10s.
- תן לסורבט להירטב ביסודיות במשך 20-30 דקות. ואז, מערבולת ו sonicate זה שוב.
- הכן מקטורן סורבט עובד. השתמש בחתול תחתון חרוט שמתאים לפצצה.
הערה: זה יכול להיות עוד צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל או כל מקטורן אחר בהתאם לעיצוב פצצת הלחץ המסוים. לניסוי זה, צינור כובע בורג תחתון חרוט לחתוך לגובה של פצצת הלחץ משמש. - Resuspend sorbent ב בבקריאל sorbent מלאי ולהעביר 500 μL לתוך בוחן סורבט עובד עם מוט מגנט של 2 x 3 מ"מ גודל.
- הוסף מתנול עד ~ 1 מ"ל ללווייתן העובד.
- תן לנקריאל העובד לעמוד על השולחן במשך 10 דקות כדי שהסורבנט יתיישב בכוח המשיכה.
- אם, לאחר ההתיישבות, שכבת sorbent הוא מתחת 4 מ"מ, להוסיף עוד של סורבט מניות ולחכות sorbent להסתפק עוד 10 דקות.
הערה: מקטורון העבודה המוכן מיועד להכנת עמודות מרובות לאורך חודשים. אם סורבט בינתול עובד נשאר מבלי לערבב במשך יותר מ 2 שעות, זה חייב להיות מערבולת עבור 10 s, sonicated עבור 10 s מיושב על ידי כוח המשיכה. באופן שגרתי, הסורבט נטען מחדש בבוקר לפני האריזה. לאחר מכן, זה טוב לאריזה במשך כל היום אם אין הפסקות ארוכות בין אריזת טור רציף. אם sorbent בלווייתן עובד מתייבש, להוסיף מתנול, ולהפעיל את הליך הכנת sorbent המלא כמו עבור מקטורן סורבנט מלאי (שלבים 3.2-3.5).
4. אריזת נימי בפצצת לחץ
אזהרה: תמיד להרכיב משקפי מגן בעת עבודה עם פצצת הלחץ. אל תלבש כפפות. אלה מפחיתים מאוד את תחושת המגע הנדרשת לטיפול נכון בנימים בקוטר קטן ומובילים לטעויות.
- מניחים את סורבט בפח לתוך פצצת הלחץ ולתקן את כל האגוזים בחוזקה.
- התחל את הסיבוב ב 60-100 סל"ד.
- הכנס את נימי המפלט fritted או משך לתוך הפצצה: לדחוף אותו לתחתית ממש של המשחקון, ולאחר מכן להרים אותו 2-3 מ"מ ולתקן את האגוז.
הערה: החל כוח נדרש מינימלי כדי לתקן את נימי כדי למנוע נזק נימי ferrule. הטוב ביותר הוא הידוק ידני. אם נעשה שימוש במפתח ברגים, יש למרוח מאמץ מספיק מינימלי להידוק. - בדוק אם נימי הוא קבוע כראוי - זה חייב להיות בלתי אפשרי להזיז את נימי על ידי משיכת אותו ביד.
- לאט מאוד לפתוח את שסתום פצצת הלחץ תוך שמירה על הקצה הפתוח של נימי הצביע הרחק מהפנים שלך.
- צפה בשלבים הראשוניים של תהליך האריזה.
הערה: מיד עם לחץ, sorbent ממלא את נימי וזה הופך להיות לא שקוף לכל אורך. ברגע שהסורבט מתחיל להיארז בתוך הקצה הדיסטלי, הדחקה האחורית גדלה, הזרימה מאטה וההתרפקות הסורבת אפילו בתוך הרפורמות הנימיות למספר מנות סורבט המופרדות על ידי פערים נטולי סורבן. סורבט שכבר ארוז נראה כאזור בצפיפות הגדל ברציפות. - שמור על האזורים המלאים sorbent להיות לפחות 70% של אורך נימי עם פערים קטנים ללא סורבט לכל משך תהליך האריזה.
- ישנן מספר בעיות נפוצות לצפייה במהלך תהליך האריזה, הדורשות כוונון התקנה בטיסה כדי לשמור על מסירת סורבט יעילה לתוך נימי.
הערה: פרטים נוספים על התאמת יעילות מסירת סורבנט מתוארים בטבלה 3.- בעיה 1: כאשר סורבנט חדש מפסיק להיכנס נימי בעוד sorbent כבר בפנים ממשיך לנוע, בצע את השלבים הבאים.
הערה: זוהי הבעיה השכיחה ביותר. ברוב המקרים הכניסה הנימית נחסמת על ידי צבירי סורבטים צוברים את עצמם. החל את השלבים הבאים בזה אחר זה עד לשחזור זרימת הסורבט ולאחר מכן דלג על שאר השלבים הקשורים לבעיה.- הגדל את מהירות הסיבוב ל-500 סל"ד והפחת אותה מיד בחזרה ל-60-100 סל"ד. בדרך כלל, הוא משחזר את זרימת הסורבט. בדוק את מהירות הסיבוב להיות לפחות 60 סל"ד למשך שאר תהליך האריזה.
- אם זה לא עוזר, לפרוק בקצרה את פצצת האריזה ומיד ללחוץ עליו בחזרה.
- אם זה לא עוזר או החסימה קורה שוב, למקם מחדש את נימי בתוך שכבת sorbent. היעדר הסורבט יכול להיות בגלל הקצה הפתוח נימי להיות גבוה מדי מעל סרגל המגנט, כך קצה העמודה לא נוגע בו, או נימי דבק לתוך התחתון של הוויאלי. ראשית, לפרוק את הפצצה לחלוטין, לשחרר את האגוז, לדחוף את נימי לתחתית, ולאחר מכן למשוך אותו 2 מ"מ אחורה. תקן את האגוז.
- אם החסימה נמשכת, לפרוק את המערכת, להוציא את סורבט בוחן המערבולת ו sonicate אותו שוב. בדוק את הקצה הקדמי נימי עבור נזק מתחת למיקרוסקופ לחתוך ~ 5 מ"מ של הקצה הקדמי במידת הצורך.
- בעיה 2: כאשר הסורבט ממלא רק חלק קטן מהניב באזורים ריקים ארוכים, בצע את השלבים שלהלן.
- בדוק את מהירות הסיבוב. אם הסיבוב איטי מדי, שבירת הכיפה אינה יעילה מספיק. הגדל את מהירות הסיבוב ל- ~ 150 סל"ד.
- אם הסיבוב מהיר מדי, הסורבט מקבל resuspended לתוך נפח בקבוקון גדול יותר ואת ריכוז sorbent המקומי סביב הכניסה לעמוד נמוך. האט את מהירות הסיבוב ל- 60-100 סל"ד.
- בדוק את רמת הסורבט. אותה בעיה עם סורבט קטן בתוך נימי הוא ציין כאשר אין מספיק סורבט בלוויה. כאשר סורבט מתרגל, למלא את הקרבון עם sorbent החדש כדי לשמור על שכבת סורבט לא פחות מ 4 מ"מ גבוה לאחר שקיעה המושרה כוח המשיכה.
- בעיה 1: כאשר סורבנט חדש מפסיק להיכנס נימי בעוד sorbent כבר בפנים ממשיך לנוע, בצע את השלבים הבאים.
- המשך לארוז את העמודה עד להשגת אורך עמודת היעד בתוספת 5-7 ס"מ.
- עצור את הסיבוב ולאט לאט להוריד את הפצצה.
- פתחו מעט את שסתום הפצצה וחכו לפיצוץ הבועה בתוך בקבוק המים כדי להתפוגג. לאחר מכן, לפתוח את השסתום קצת יותר רחב ושוב לחכות פרץ הבועה להאט.
- שחרר את הלחץ במרווחים עד שלא יצא גז מהסתום.
הערה: לא לפתוח את השסתום כל הדרך בבת אחת - זה יוביל מבעבע בתוך נימי ואת sorbent חוזר לתוך המשחקון. אם זה יקרה, לחץ על הפצצה בחזרה וחכה שהטור ייארז שוב.
- כשהגז יפסיק לצאת מ שסתום האוורור, תוציא את הנימי הארוז מפצצת הלחץ.
הערה: אל תיתן לעמוד להתייבש. אם אינך מחובר למערכת HPLC באופן מיידי להמשך האריזה, הכנס את הנימי הארוז לאחסון על-ידי שקיעתה בשלמותה לפתרון EtOH של 10%. מיכל אחסון מזון פוליפרופילן הדוק נוזל יכול לשמש לאחסון נימי. עמודות HPLC מנותקות מאוחסנות באותו אופן. - אם לא מתוכננת אריזה נוספת, הוציאו את ביון הסורבט מהפצצה וסגרו אותו בחוזקה. שמור אותו לאריזת טורים נוספת.
5. אריזה בעמודה HPLC
- חבר את הנימי הארוז למערכת HPLC באמצעות חיבור HPLC.
- התחל את הזרימה ב 95% ממס B (80 או 100% acetonitrile, 0.1% חומצה פורמית (FA)) מיקוד 250-300 לחץ בר. עבור נימי ארוז 40 ס"מ, להשתמש בקצב הזרימה של 200-300 nL / min.
הערה: קצב זרימת האריזה הוא 200 nL / min עבור עמודה 40-50 ס"מ עם מזהה 100 מיקרומטר ארוז עם 2 μm sorbent. גדלי עמודות אחרים מפורטים בטבלה 4. קצבי זרימה עבור אורכי עמודות ומתעדים אחרים מוערכים מהמידתיות הישירה בין הלחץ האחורי לבין אורך העמודה והחתך. קצב הזרימה המדויק מותאם לאורך האריזה בפועל, שהוא כברירת מחדל ארוך יותר מאורך העמודה המיועד. כמו כן, שים לב שלחץ 300 הברים מכוון למגבלת הלחץ הפיזי של חיבור HPLC. עבור חיבורים בלחץ גבוה יותר, יש להשתמש בקצבי זרימה גבוהים יותר עד למגבלת לחץ החיבור לאריזה מהירה יותר. - שימו לב לסורבט הרופף בתוך הנימי שנארז ומתווסף לכל אורכו הארוז.
- מבלי לעצור את הזרימה, טובלים את גוף העמוד פעמיים באמבט sonication.
הערה: אל תטבול קצות עמודה וחיבורים נימים - רק חלק מגוף העמודה. שלב Sonication מסייע בשיפור שחזור העמודות, במיוחד עבור עמודות ארוכות במיוחד באורך >50 ס"מ (נתונים שלא פורסמו); עם זאת, הוא מוסיף סיכוי אקראי לשבור את פריט סורבט הרכבה עצמית בתוך קצה הפולט של נימי פולט משך וחסימת העמודה לחלוטין. בעוד sonication יכול להיות מיושם באופן אוניברסלי על כל עמודות זכוכית fritted, אנו מציעים sonicating עמודות פולט משך רק עבור אורך העמודה > 50 ס"מ. - כאשר מיטת הסורבט מפסיקה להתכווץ, טובלים את גוף העמוד באמבט sonication פעמיים יותר מבלי לעצור את הזרימה.
- הפעל את העמודה למשך 10 דקות נוספות ב- 300 עמודות.
- עצור את הזרימה, המתן עד שהלחץ יירד אל מתחת לשלוש עמודות ונתק את העמודה.
- בדוק חזותית את העמודה עבור היעדר פערים ושינויי צבע. אם יימצאו כאלה, ניתן לחזור על sonication מתחת לזרימה. לניסויים קריטיים, שקול ליצור טור חדש.
- גזור את העמודה לאורך הרצוי.
הערה: חיתוך שנעשה כראוי הוא תנאי מוקדם ליעילות העמודות. לעשות חריץ בציפוי פולימיד עם הסופר, לפצח חלקית את נימי ולמשוך שני חלקים זה מזה. - ללטש את הקצה הקדמי של העמודה על רקיק קרמיקה או עם סרט מלטפים.
- חבר מחדש את העמודה למערכת LC באמצעות חיבור UHPLC.
- התחל את קצב זרימת העבודה ב- 2% B בהתאם למזהה העמודה בהתאם לטבלה 4. המתן ללחץ שישוו אתוותו ובדוק את הדחיסה האחורית של העמודה.
הערה: קצב זרימת העבודה מותאם בהתאם לפרמטרים של עמודה. לדוגמה, עמודת מזהה באורך 30 ס"מ של 100 מיקרומטר מופעלת במהירות של 500 nL/min. - ודא שההיערכה האחורית נמצאת בטווח של 5% מהערך הצפוי (ראה טבלה 5), פעולה זו מאשרת שהעמודה ארוזה כראוי ומוכנה לשימוש.
הערה: הלחצים האחוריים בעמודה הם הלחץ הכולל בערוץ ההדרגתי של מערכת HPLC כאשר העמודה מחוברת פחות הלחצים האחוריים של הנימים לפני העמודה. יחד עם זאת, הערכים בטבלה 5 הם שרירותיים (הם נותנים קנה מידה שרירותי של למה לצפות). הדמיון הפנים-מעבדתי של הדחיסה האחורית מעמודה לעמודה הוא אינדיקטור חשוב יותר שהכל עובד כראוי. הדחקה האחורית המוחלטת בפועל תלויה בפרמטרים רבים, כגון גודל ומאפיינים סורבטים, מזהה נימי, יצרן ואצווה, צורת קצה הפולט המשוך או הצפיפות והאורך של פריט הזכוכית, מאפייני הממס וטמפרטורת הסביבה בחדר וכו '. אם הלחץ האחורי גבוה מדי, ראה טבלה 1 לקבלת בעיות אפשריות.
Representative Results
גישת FlashPack מבוססת על הגדרת האריזה הסטנדרטית ועוקבת אחר אותו צינור אריזה. האריזה נעשית לתוך נימים רגילים fritted או משך פולט. האופטימיזציה העיקרית טמונה בריכוז ההסתה הסורבט: השיטה הסטנדרטית אינה עולה בקנה אחד עם השעיית סורבט מרוכזת גבוהה המשמשת ב- FlashPack. התוצאה היא שיטת ייצור מהירה לעמודות UHPLC ארוכות, לדוגמה, עמודה ארוזה לאורך 50 ס"מ עם סורבט של 1.9 מיקרומטר בפחות מ- 1 שעות(איור 2).
כדי להדגים את היישום של גישת FlashPack, 30 ס"מ 100 מיקרומטר זהה עמוד נימי הוכן (טבלה 6). אריזה של ReprosilPur C18 1.9 מיקרומטר סורבנט נעשה ב 60 ברים לתוך 50 ס"מ ארוך 100 מיקרומטר מזהה משך נימי פולט, מוכן על ידי מושך לייזר P2000. הנימי היה ארוז ~ 40 ס"מ ב 40 דקות עם קצת יותר סורבט רופף עזב בתוך נימי. הנימי הארוז חובר למערכת HPLC ופעל במהירות של 300 נ"ל/דקה עם ממס B (80% אצטוניטריל, 0.1% FA). לאחר שני סיבובים של sonication 5, האורך הארוז הסופי היה 43 ס"מ. העמודה נותקה, נחתכה ל- 30 ס"מ והתחברה למערכת HPLC באמצעות חיבור UHPLC. אנו משתמשים באופן שגרתי 360 מיקרומטר ללא שרוולים PEEK אגוז-ferrule ו 360 מיקרומטר נירוסטה איחוד. שילוב זה מכיל לפחות עד 700 ברים אם הידוק חזק. העמודה המיוצרת כוללת לחץ אחורי של 520 פסים ב- 2% ממס B ב- 500 nL / min, אשר עולה בקנה אחד עם טווח הערך הצפוי (טבלה 5).
כהדגמה של יעילות העמוד, השתמשנו בעמודה המיוצרת של 30 ס"מ כדי להפריד 50 fmol של תקציר טריפטי של חלבון ציטוכרום C בשיפוע של 15 דקות מ 2% ל 50% B. כרומטוגמות יון שחולצו הראו את הפסגות להיות סימטרי מאוד עם מעקב מינימלי. ממוצע FWHM היה בסביבות 3 s(איור 3).
טבלה 1: פתרון בעיות ללחץ גבוה על הגב של העמודה. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: P2000 / F לייזר מושך תוכנית. P2000/F לייזר מושך תוכנית להכנת נימים פולט משך מ 360 μm OD 100 מיקרומטר מזהה מותך-סיליקה פולימיד נימים מצופים ללא ציפוי פנימי בטמפרטורות החדר 23-25 °C (25 °F). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: בעיות אריזה ונקודות ביקורת ספציפיות ל- FlashPack שיש לשלוט בהן במהלך תהליך האריזה. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: שיעורי אריזה וזרימת עבודה למופת עבור מזהי עמודות ואורך שונים. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: לחיצה אחורית צפויה עבור עמודה עמוסה ב- 2 μסורבטים כדוריים ופעל בקצב זרימת העבודה (בהתאם למזהה העמודה) במערכת ממס RP ב- RT. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 6: אריזה למופת של עמוד UHPLC 30 ס"מ. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 1: ערכת אריזת עמודות נימיות. שלבים 1 עד 3 הם הכנה, ואחריו אריזת פצצת לחץ וסיים על ידי אריזת HPLC. שלבים 3 ו-4 משתנים עבור פרוטוקול FlashPack היעיל במיוחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קצב אריזה עבור מזהה נימי 100 מיקרומטר עם ReprosilPur C18 AQ 1.9 מיקרומטר ב-100 עמודות במתנול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כרום יוגורטים יונים שחולצו של פפטידים טריפטיים של ציטוכרום C. יון כרומטוגרמה של פפטידים טריפטיים של ציטוכרום C לאחר הפרדה של 50 fmol באורך 30 ס"מ 100 מ"מ מזהה משך פולט עמוד נימי ארוז עם ReprosilPur C18 AQ 1.9 מיקרומטר בשיפוע של חוצץ B (80% acetonitrile, 0.1% FA) ובחיץ A (2% אצטוניטריל, 0.1% FA) מ-2% ל-40% B ב-15 דקות ב-500 nL/min ב-RT. הזיהוי בוצע באמצעות ספקטרומטר מסה. עוצמות מוחלטות וטווחי m/z שחולצו עבור כל פפטיד מוצגים מימין לספקטרום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
אריזת טור נימי בתוך הבית פופולרית מאוד במעבדות גדולות העובדות על פרויקטים עצמאיים מרובים. עם זאת, שיטת אריזה נפוצה מהשעיית סורבנט בריכוז נמוך יש מגבלות עיקריות במהירות והוא אינו מסוגל לייצר עמודות UHPLC ארוכות.
FlashPack הוא שינוי של הליך האריזה הסטנדרטי מה שהופך את האריזה מריכוז סורבנט גבוה מאוד לאפשרי. הבסיס התיאורטי של השיטה טמון בחוסר היציבות השוטף של כיפה בכניסה לעמוד למשך כל תקופת האריזה. זה האחרון מושגת מבחינה טכנית על ידי כניסה לעמוד להיות מכה ברציפות עם מוט מגנט. השיטה של חוסר היציבות של כיפה מפותחת בכוונה כדי לקבל את הגדרת האריזה דומה לחלוטין לתהליך האריזה המשותף, אבל הטריק של FlashPack טמון בפרטי הכנת רפש סורבט, מיקום נימי, ושימוש בר מגנט במהלך תהליך האריזה.
סורבט srbent מוכן כמו שכבת סורבט משקעים בנפח ממס גדול. מעניין שהאריזה מבוססת פצצת הלחץ אינה דורשת את אותם תנאי אריזה עבור עמודה לעמודה. בפלאש-פייק, אנחנו אף פעם לא יודעים את הריכוז המדויק של סורבטים סביב הכניסה לעמוד. אי אפשר למדוד ולשלוט בדיוק, כפי שהוא גם משתנה במהלך תהליך האריזה. עם זאת, העמודות הסופיות עדיין ניתנות לשחזור4 ללא קשר לאופן שבו הושגה האריזה.
הבסיס לאריזה המהירה טמון בחוסר היציבות היעיל של כיפה סורבט. מסיבה זו, חשוב לשלוט sorbent נכנס נימי ולשמור על תנאי אי היציבות כיפה אופטימלית לאורך כל משך האריזה. קיימות מספר בעיות אפשריות שעשויות למנוע מסירת סורבט יעילה. כמה דוגמאות לכך הן resuspension שכבה סורבת על ידי סיבוב מוט מגנטי מהיר, חוסר יציבות כיפה לא יעילה עקב נימי יחסית שגויה למיקום מוט המגנט או סיבוב מוט מגנט איטי מדי. הנושאים עצמם וכיצד יש לטפל בהם נדונים בפירוט בסעיף הפרוטוקול.
לאחר אריזת העמודה, פרמטר העמודה העיקרי שיש לבדוק הוא הדחיסה האחורית של העמודה. ערכי הלחץ המפורטים בטבלה 5 מספק נקודת התייחסות למה שצפוי לאחד הפופולריים תת 2 מיקרומטר גודל חרוזים sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1.9 מיקרומטר). יחד עם זאת, לחץ אחורי נוסף עשוי להתווסף על ידי פריט או פולט משוך יותר מדי ויש לפקח כל הזמן על כך. אם האריזה נעשית לתוך פולט משוך, אנו עדיין מציעים למדוד את הדחיסה האחורית העמודה הצפויה עבור sorbent מסוים בשימוש על ידי אריזת נימים fritted הראשון, ולאחר מכן כדי לראות אם פריט הרכבה עצמית מוסיף יותר מדי. עבור בעיות בלחץ גבוה, השתמש בקווים המנחים המופיעים בטבלה 1 כדי להצביע על הבעיה.
מניסיוננו, טור ארוז ללא שינויי צבע, פערים, ועם הדחיסה האחורית הנכונה עובד ב -100% מהמקרים ונותן את איכות ההפרדה קרוב למה שניתן לצפות מאורך העמודה ומאפייני הסורבט. עמודה עם שינויי צבע אינה מובטחת לפעול כראוי, אך עדיין יכולה לתת תוצאות משביעות רצון.
רוב הזמן, אם יש בעיות עם איכות ההפרדה, הם לא באים מהטור עצמו, אלא מחלקים אחרים של מערכת ההפרדה, כלומר, משאבות, ממסים, או חיבורים. מזיק במיוחד הוא כל חיבורים לאחר עמודה. חיבור רע עם נפח מת בין המקרן לעמודה המקודשת מוביל להתרחבות שיא גדולה וזנב עקב שיעורי זרימה נמוכים מאוד בכרומטוגרפיה נימית.
נושא חשוב נוסף ספציפי לגישת FlashPack הוא שהיא משתמשת בהרבה סורבטים יקרים ב בקבוקון סורבט עובד. אנא זכור, כי סורבט srbent ב FlashPack מיועד לשימוש מרובה. תשמור על הסורבט. הימנעו ממגנט מיותר תוך ערבוב כדי להפחית את השחזה הסורבת- זכרו לעצור את הסיבוב ברגע שהאריזה מסתיימת. ואל תשאירו את מקטורן הסורבט הפתוח בפצצת הלחץ כדי למנוע ייבוש סורבט. למרות שעדיין ניתן להשתמש בסורבט לאחר מכן, לוקח זמן ליצור מחדש את ההסתה הסורבת.
השיטה עובדת באותה מידה עבור נימים fritted ונימים פולט משך. עיקרון FlashPack מגדיל את קצב האריזה של תעודות זהות נימיות מ-20 ל-250 מיקרומטר (קטנות וגדולות יותר לא נבדקו). זה חל גם על כל sorbents, הן נקבובי באופן מלא ושטחי, אנחנו יכולים לבדוק (המשקף כי היווצרות כיפה סורבט בריכוז srbent גבוה srbent אינו מוגבל במיוחד RP סורבטים). חוץ מזה, פרמטרים ממס משפיעים בבירור על האריזה על פי המאפיינים הפיזיים והכימיים שלהם. לדוגמה, פחות אצטון צמיג נותן שיעור אריזה גבוה עוד יותר מאשר מתנול באותו לחץ אריזה. עם זאת, הוא גם פחות קוטבי מאשר מתנול ומפחית חלקיקי סורבט דבק אחד לשני. ההשפעה כשלעצמה מונעת היווצרות כיפה סורבט בתחילת האריזה כאשר קצב הזרימה עדיין גבוה. עם זאת, הפחתת אינטראקציית חלקיקים סורבט מובילה גם להיווצרות פריט פחות אמין להרכיב עצמית וחסימה תכופה יותר משוך-סוף במהלך האריזה. אז, בעוד אצטון עדיף על אריזה של נימים fritted, זה פחות מתאים נימים פולט משך, עם מתנול כמו ממס ריר להיות איטי יותר אבל מתאים לשני סוגי הסוף. אריזה מהקסאן או דיכלורומתאן (DCM) הם מקרים קיצוניים של מעבר לאצטון ממתנול: הם אפילו פחות קוטביים, ולכן הם מונעים היווצרות כיפה סורבט לחלוטין, אולם הם אינם מתאימים לאריזת פולט משך בכלל. חוץ מזה, צוין כי קוטביות DCM נמוכה מאוד מוביל חלקיקי סורבט דבק בקיר נימי הפנימי ועושה שכבה עבה על זה. עובי השכבה גדל בהדרגה ובלוקים מקומיים אקראיים נוצרים וכתוצאה מכך העמודה ארוזה במספר חלקים המופרדים על-ידי אזורים ללא סורבט. השפעה כזו נצפתה C18 פפטיד אריס סורבט.
נושא נוסף שנצפה היה YMC Triart C18 סורבט לא מושעה במתנול כראוי, אלא כדי ליצור איזה פתיתים. עם זאת, זה לא מונע ממנו לקבל ארוז עם FlashPack ולתת יעילות הפרדה הגונה מאוד (נתונים שלא פורסמו). לכן, בעוד לא להיות אופטימלי עבור מקרים מסוימים, מתנול היה הממס האוניברסלי ביותר לעבוד עבור כל sorbents שנבדקו ועמודות. יש להזכיר כי עדיין לא לנתח איך ממיסים slurry שונים להשפיע על יעילות הפרדת העמוד. יחד עם זאת, היעילות של עמודות ארוזות מתנול כבר שווה לחלוטין לעמודות מסחריות עבור אותם סורבטים4.
FlashPack אינה הגישה הקיימת היחידה לשיפור קצב האריזה של עמודות UHPLC. אריזה מהירה מריכוז סורבט גבוה אפשרית גם עם שימוש באריזה בלחץ גבוה במיוחד7. היתרון של FlashPack הוא שזה הרבה יותר פשוט כפי שהוא אינו דורש משאבות לחץ אולטרה גבוה מיוחד ופצצות לחץ עבור משלוח סורבנט וחיבורים נימיים. יחד עם זאת, הוכח כי העמודים הארוזים בלחצים קיצוניים יכולים להיות יעילות הפרדה גבוהה יותר מאשר עמודות ארוזות בלחץ נמוך17. ובעוד FlashPack מייצר עמודות זהות לאלה מסחריים המשמשים בהשוואה4, אשר איננו יודעים את שיטת האריזה, זה עדיין לא נבדק איך עמודות FlashPack לעמוד נגד עמודות ארוזות בלחץ גבוה במיוחד.
לסיכום, ניתן להתאים בקלות את שיטת FlashPack המתוארת לפרוטוקול האריזה הקיים במעבדה עם כמה התאמות שבוצעו לפרוטוקול, בעוד ההתקנה נשארת זהה לחלוטין. הוא מאיץ את אריזת העמודות הנימיות של HPLC לזמן של דקות ומאפשר ייצור של עמודות נימיות ארוכות של UHP, דבר שהוא בלתי אפשרי בעליל עם הליך האריזה הסטנדרטי. ניתן לספור את הכלכלה הכוללת בזמן ובכסף למעבדה על ידי יישום גישת FlashPack בעשרות אלפי יורו בשנה. בנוסף, היכולת לייצר עמודות נימי UHP באופן מקומי פותחת את האפשרויות להתאמה אישית של ניסויים בלתי אפשרית עם המוצרים המסחריים הזמינים.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי מענק RSF 20-14-00121. המחברים מודים ל- P. V. Shliaha (מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג) על דיונים פוריים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021).
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
