Summary
Здесь мы представляем протокол для оптимизированной процедуры упаковки капиллярных столбцов FlashPack. Применение оптимизированного протокола к общей установке бомбы давления 100 бар позволяет в 10 раз ускорить упаковку и изготовление длинных сверхвысокопроизводительных капиллярных колонн.
Abstract
Капиллярная сверхвысокопроизводительная жидкостная хроматография (UHPLC) в настоящее время является очным методом для стадии разделения образцов в протеомике на основе LC-MS. Однако капиллярные колонны гораздо менее надежны по сравнению с их более высокими контртипами потока. Из-за легкого загрязнения и блокировки они часто нуждаются в замене. Это делает их заметно дорогостоящей частью общей стоимости анализа LC-MS. Фирменные упаковки капиллярных колонн UHPLC экономят много денег и позволяют настраивать их. Однако стандартная процедура упаковки в бомбе под давлением 100 бар хорошо работает только для колонок ВЭЖХ, но слишком медленна для сорбентов UHPLC. Здесь мы предоставляем описание оптимизированного протокола FlashPack, применяемого к той же установке бомбы давления 100 бар. Метод основан на упаковке из суспензии сверхвысокой концентрации сорбента и разработан для самостоятельного изготовления капиллярных колонн UHPLC неограниченной длины в разумные сроки.
Introduction
Современная протеомика основана на жидкостной масс-спектрометрии с жидкостной хроматографией со сверхвысокой производительностью нанопоточной хроматографии (внутренний диаметр колонки 50-150 мкм (ID)), обеспечивающей наилучшую скорость анализа ичувствительность 1. В то время как многочисленные коммерческие капиллярные колонны UHPLC доступны, их цена составляет основную часть стоимости расходных материалов, особенно когда в лаборатории выполняется несколько разнообразных проектов, и загрязнение колонн для конкретных проектов является частой проблемой. Кроме того, упаковка колонн на месте позволяет использовать пользовательские экспериментальные сорбенты (такие как, например, сорбент polyCAT-A2)и характеристики колонн, недоступные для покупки в качестве готовой колонны.
Чтобы справиться с этим, многие лаборатории упаковывают капиллярные колонны в свои дома. Однако обычная процедура упаковки с бомбой давления 100 бар (инжекционная ячейка давления)3 плохо подходит для упаковки колонны UHPLC из-за высокого обратного давления сорбентов UHPLC менее 2 мкм, что приводит к резкому снижению скорости упаковки по сравнению с сорбентами ВЭЖХ большего размера. В то время как короткие колонны UHPLC все еще могут быть очень медленно упакованы, производство длинных колонн UHPLC физически невозможно4.
Стандартная капиллярная колонковая упаковка производится при относительно низких давлениях – до 100 бар, и с очень низкой концентрацией сорбента в суспензии. Таким образом, можно найти два возможных направления ускорения процесса. Возможно увеличение давления упаковки на5. Однако для этого требуется специальное оборудование и, практически, установка нового метода в лаборатории. Другим способом является повышение концентрации сорбента в суспензии6. Упаковка с высокой концентрацией сорбента в суспензии описана в сочетании со сверхвысоким давлением упаковки в предыдущей публикации7. Однако при давлении 100 бар, которое используется в большинстве существующих упаковочных бомб, более высокая концентрация сорбента приводит либо к замедлению скорости упаковки, либо к полному прекращению упаковки. Недавно было продемонстрировано, что эффект обусловлен кластеризацией сорбентов на входе в колонну, и был предложен простой трюк дестабилизации купола сорбента путем забивания входа в колонну магнитным стержнем внутри флакона сорбента4. Полученный метод, названный FlashPack, использует ту же установку упаковки бомбы давления 100 бар. В то же время незначительные, но критические изменения в процедуре упаковки позволяют упаковывать из очень высокой концентрации сорбентного шлама и производить очень длинные колонны UHPLC (от 50 до 70 см и длиннее) менее чем за час, в то время как короткая колонна может быть изготовлена за минуты с качеством разделения, равным коммерческим колонкам с теми же параметрами4. Подход FlashPack уже успешно использовался в нескольких проектах протеомики для получения как обратных фаз (RP)8,9,10,11,12,13,14, так и гидрофильного взаимодействия (HILIC)2 капиллярных колонн.
Здесь мы подробно опишем модификации, необходимые для адаптации подхода FlashPack к стандартной процедуре упаковки бомбы под давлением 100 бар.
Protocol
Протокол упаковки состоит из пяти этапов(Рисунок 1):1) Подготовка упаковочной станции, 2) капиллярная подготовка, 3) подготовка сорбента, 4) капиллярная упаковка в бомбу под давлением и 5) упаковка колонны в системе ВЭЖХ, разрезание до размера и установка соединения UHPLC. Оптимизация FlashPack требует внесения корректировок в разделах 3 и 4 по сравнению с общим протоколом.
1. Сборка упаковочной станции
- Подготовьте бензобак, заполненный азотом, гелием или аргоном, снабженный одноступенчатым газовым регулятором с давлением на выходе > 50 бар. Максимальное давление ограничено совместимостью бомбы давления.
- Подключите регулятор к вентиляционному клапану бомбы давления.
- Если бомба под давлением не оснащена встроенной магнитной мешалкой, поместите бомбу на магнитную мешалку.
- Подключите узкую пластиковую трубку ID (например, 0,13 мм) к вентиляционному отверстию бомбы под давлением и поместите ее в сосуд с водой.
2. Капиллярная подготовка
- Готовят фритированный капилляр со встроенным стеклянным фритом, образованным из Касила и формамида15, или капилляром вытянутого излучателя, приготовленным лазерным съемщиком16. Капилляр делается на 10-15 см длиннее предполагаемой длины колонны.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. таблицу 1 для обсуждения возможных проблем, связанных с различными размерами капилляров и типами фритов. В таблице 2 приведен пример программы лазерного съемника P2000 для изготовления капилляров вытягивающих излучателей. - Защитите вытянутый конец излучателя с помощью вырезанного наконечника пипетки с гелевой загрузкой.
- Отрежьте наконечник так, чтобы он плотно прилег к капилляру OD 360 мкм (его можно перемещать вдоль капилляра, но для этого требуются некоторые усилия).
- Сдвиньте наконечник вырезанной пипетки на капилляр со стороны передней части капилляра и переместите его вверх к концу излучателя.
- Отодвиньте назад защитный наконечник, когда колонна распыляется. Сдвиньте наконечник вперед, чтобы конец излучателя находился внутри наконечника, когда колонна не распыляется (даже когда колонна находится под потоком, но все еще не распыляется).
3. Подготовка сорбента
- Подготовьте флакон с сорбентом: Поместите ~ 50 мг сухого сорбента в трубку центрифуги 1,5 мл. Здесь в качестве примера используется Reprosil Pur C18.
- Добавьте 1 мл метанола в трубку сорбента.
- Чтобы перемешать его полностью, вихрев трубку в течение 10 с помощью вихревого смесителя.
- Соник в ванне для ультразвука в течение 10 с.
- Дайте сорбенту тщательно пропитаться в течение 20-30 мин. Затем вихрь и снова обжаряйте его.
- Приготовьте рабочий флакон с сорбентом. Используйте конический нижний флакон, который помещается в бомбу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть либо еще одна центрифужная трубка 1,5 мл, либо любой другой флакон в зависимости от конкретной конструкции бомбы давления. Для этого эксперимента используется коническая нижняя винтовая колпачка трубки, вырезанная на высоту бомбы давления. - Повторно суспендировали сорбент в запасном флаконе сорбента и переложили 500 мкл в рабочий флакон сорбента с помощью магнитного стержня размером 2 х 3 мм.
- Добавьте метанол до ~1 мл в рабочий флакон.
- Дайте рабочему флакону постоять на столе в течение 10 минут, чтобы сорбент оседал под действием силы тяжести.
- Если после оседания слой сорбента ниже 4 мм, добавьте еще запас сорбентной суспензии и дождитесь, пока сорбент осядет еще 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленный рабочий флакон предназначен для подготовки нескольких колонок в течение нескольких месяцев. Если рабочий флакон сорбента остается без перемешивания более 2 ч, его необходимо вихрять в течение 10 с, обрабатывать ультразвуком в течение 10 с и осевать под действием силы тяжести. Обычно сорбент повторно суспендируется утром перед упаковкой. Затем, это хорошо для упаковки на весь день, если нет длинных пауз между последовательной упаковкой колонны. Если сорбент в рабочем флаконе высохнет, добавляют метанол и запускают полную процедуру приготовления сорбента, как для запаса флакона сорбента (этапы 3.2-3.5).
4. Капиллярная упаковка в бомбу давления
ВНИМАНИЕ: Всегда надевайте защитные очки при работе с бомбой давления. Не надевайте перчатки. Это сильно снижает чувство осязания, необходимое для правильной обработки капилляров малого диаметра, и приводит к ошибкам.
- Поместите флакон сорбента в бомбу под давлением и плотно зафиксируйте все орехи.
- Запустите вращение со скоростью 60-100 об/мин.
- Вставьте в бомбу капилляр фритированного или вытянутого излучателя: протолкните его на самое дно флакона, а затем поднимите его вверх на 2-3 мм и закрепите гайку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приложите минимально необходимое усилие для фиксации капилляра, чтобы избежать повреждения капилляров и наконечников. Лучшим является затягивание рук. Если используется шестигранный ключ, приложите минимальные усилия, достаточные для затягивания. - Проверьте, правильно ли закреплен капилляр – необходимо, чтобы было невозможно сдвинуть капилляр, вытащив его вручную.
- Очень медленно откройте клапан бомбы давления, сохраняя открытый конец капилляра направленным в сторону от вашего лица.
- Следите за начальными этапами процесса упаковки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после надавливания сорбент заполняет капилляр и он становится непрозрачным по всей длине. Как только сорбент начинает упаковываться внутри дистального конца, противодавленное давление увеличивается, поток замедляется, и ровная сорбентная суспензия внутри капилляра превращается в несколько пакетов сорбента, разделенных безсорбентными промежутками. Уже упакованный сорбент виден как густо окрашенный непрерывно растущий регион. - Держите заполненные сорбентом области не менее 70% длины капилляров с небольшими свободными от сорбента промежутками в течение всего процесса упаковки.
- Есть несколько распространенных проблем, на которые следует обратить внимание в процессе упаковки, которые требуют корректировки настройки в полете, чтобы сохранить эффективную доставку сорбента в капилляр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация о корректировке эффективности доставки сорбентов приведена в таблице 3.- Проблема 1: Когда новый сорбент перестает поступать в капилляр, в то время как сорбент, уже находящийся внутри, продолжает двигаться, выполните следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это наиболее частая проблема. В большинстве случаев капиллярный вход блокируется самоагрегирующими кластерами сорбентов. Выполните следующие действия один за другом, пока поток сорбента не будет восстановлен, а затем пропустите остальные шаги, связанные с проблемой.- Увеличьте скорость вращения до 500 об/мин и сразу же уменьшите ее до 60-100 об/мин. Обычно он восстанавливает течение сорбента. Убедитесь, что скорость вращения не менее 60 об/мин для остальной части процесса упаковки.
- Если это не помогает, ненадолго выхватил упаковочную бомбу и немедленно надавите на нее обратно.
- Если это не помогает или блокировка происходит снова, перепозиционирует капилляр внутри слоя сорбента. Отсутствие сорбента может быть связано с тем, что открытый конец капилляра либо находится слишком высоко над магнитным стержнем, поэтому конец колонны не касается его, либо капилляр втыкается в дно флакона. Сначала полностью выпустили бомбу, ослабили гайку, протолкнули капилляр на дно, а затем потянули его на 2 мм назад. Зафиксируйте гайку.
- Если блокировка сохраняется, вытрите систему, выньте флакон и вихрь сорбента и снова обжайте его ультразвуком. Проверьте капиллярный фронтальный конец на наличие повреждений под микроскопом и при необходимости вырежьте ~ 5 мм передней части.
- Проблема 2: Когда сорбент заполняет только небольшую часть капилляра длинными пустыми областями, выполните следующие действия.
- Проверьте скорость вращения. Если вращение слишком медленное, разрыв купола недостаточно эффективен. Увеличьте скорость вращения до ~150 об/мин.
- Если вращение слишком быстрое, сорбент повторно суспендируется в больший объем флакона, а концентрация местного сорбента вокруг входа в колонну низкая. Замедлите скорость вращения до 60-100 об/мин.
- Проверьте уровень сорбента. Та же проблема с небольшим количеством сорбента внутри капилляра наблюдается, когда во флаконе недостаточно сорбента. Когда сорбент износится, наполните флакон новым сорбентом, чтобы сохранить слой сорбента на высоте не менее 4 мм после гравитационного осаждения.
- Проблема 1: Когда новый сорбент перестает поступать в капилляр, в то время как сорбент, уже находящийся внутри, продолжает двигаться, выполните следующие действия.
- Продолжайте упаковывать колонну до тех пор, пока не будет достигнута целевая длина колонки плюс 5-7 см.
- Остановите вращение и очень медленно разгерметизируйте бомбу.
- Немного откройте клапан бомбы и подождите, пока пузырь лопнет внутри бутылки с водой, чтобы утихнуть. Затем откройте клапан немного шире и снова подождите, пока пузырь лопнет, чтобы замедлиться.
- Сращайте давление с шагом до тех пор, пока из клапана не выйдет газ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте клапан сразу - это приведет к пузырьку внутри капилляра и возвращению сорбента во флакон. Если это произойдет, надавите на бомбу и подождите, пока колонна снова будет заполнена.
- Когда газ перестанет выходить из вентиляционного клапана, выньте упакованный капилляр из бомбы давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не дайте колонке высохнуть. Если система ВЭЖХ не подключена немедленно для дальнейшей упаковки, поместите упакованный капилляр в хранилище, погрузив его целиком в 10% раствор EtOH. Для капиллярного хранения может использоваться жидко-герметичный полипропиленовый контейнер для хранения пищевых продуктов. Отключенные столбцы ВЭЖХ хранятся таким же образом. - Если дальнейшая упаковка не планируется, доньте флакон с сорбентом из бомбы и плотно закройте его. Сохраните его для дальнейшей упаковки колонны.
5. Упаковка в колонку ВЭЖХ
- Подключите упакованный капилляр к системе ВЭЖХ через соединение ВЭЖХ.
- Начните поток с 95% растворителя B (80 или 100% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты (FA)) с давлением 250-300 бар. Для 40 см упакованного капилляра используйте скорость потока 200-300 нл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расход упаковки составляет 200 нл/мин для колонны 40-50 см с идентификатором 100 мкм, упакованной сорбентом 2 мкм. Некоторые другие размеры столбцов перечислены в таблице 4. Расход для других длин колонн и идентификаторов оценивается по прямой пропорциональности между обратным давлением и длиной колонны и поперечным сечением. Точный расход корректируется в соответствии с фактической упакованной длиной, которая по умолчанию больше целевой длины столбца. Также обратите внимание, что давление 300 бар нацелено на предел физического давления соединения ВЭЖХ. Для соединений с более высоким давлением для более быстрой упаковки должны использоваться более высокие скорости потока до предела давления соединения. - Следите за тем, чтобы рыхлый сорбент внутри капилляра упаковывался и добавлялся к общей упакованной длине.
- Не останавливая потока, дважды окуните корпус колонны в ванну для обработки ультразвуком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не погружайте концы колонны и капиллярные соединения - только часть тела колонны. Шаг обработки ультразвуком помогает улучшить воспроизводимость столбцов, особенно для чрезвычайно длинных столбцов длиной >50 см (неопубликованные данные); однако это добавляет случайный шанс сломать самособирающийся фрит сорбента внутри конца излучателя вытянутого капилляра излучателя и полностью заблокировать колонну. В то время как обработка ультразвуком может быть универсально применена к любым стеклянным колоннам, мы предлагаем использовать ультразвуковые вытащенные излучающие колонны только для длины колонны > 50 см. - Когда сорбентный ложе перестанет сжиматься, опустите корпус колонны в ванну для обработки ультразвуком еще в два раза, не останавливая поток.
- Запускаем колонну еще 10 минут при 300 барах.
- Остановите поток, подождите, пока давление упадет ниже трех баров, и отсоедините колонну.
- Визуально осмотрите колонну на отсутствие зазоров и обесцвечивания. Если таковые обнаружены, обработку ультразвуком под потоком можно повторить. Для критических экспериментов рассмотрите возможность создания нового столбца.
- Обрежьте колонну до нужной длины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно выполненная резка является обязательным условием эффективности колонны. Сделайте выемку в полиимидном покрытии с помощью писца, частично расколойте капилляр и раздвините две части. - Отполировать переднюю часть колонны на керамической пластине или притиркой пленкой.
- Повторно подключите столбец к системе LC с помощью соединения UHPLC.
- Начинайте рабочий расход при 2% В в зависимости от идентификатора столбца согласно таблице 4. Подождите, пока давление уравновешивается, и проверьте обратное давление в колонке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий расход регулируется в соответствии с параметрами столбца. Например, идентификационный столбец длиной 30 см 100 мкм запускается со скоростью 500 нл/мин. - Убедитесь, что обратное давление находится в пределах 5% от ожидаемого значения (см. таблицу 5),это подтверждает, что столбец упакован правильно и готов к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратное давление в колонке представляет собой общее давление в градиентном канале системы ВЭЖХ с колонной, соединенной за вычетом обратного давления капилляров перед колонной. При этом значения в таблице 5 произвольны (они дают произвольную шкалу того, чего ожидать). Внутриабораторное сходство обратного давления от колонки к колонке является более важным показателем того, что все работает правильно. Фактическое абсолютное обратное давление зависит от многих параметров, таких как размер и характеристики сорбента, идентификатор капилляра, производитель и партия, форма конца вытягиваемого излучателя или плотность и длина стеклянного фрита, характеристики растворителя и температура окружающей среды в помещении и т. Д. Если обратное давление слишком высокое, см. Таблицу 1 для возможных проблем.
Representative Results
Подход FlashPack основан на стандартной настройке упаковки и следует тому же конвейеру упаковки. Упаковка производится в стандартные фритированные или вытянутые излучающие капилляры. Принципиальная оптимизация заключается в концентрации сорбентной суспензии: стандартный метод несовместим с высококонцентрированной суспензией сорбента, используемой во FlashPack. Результатом является быстрый метод производства длинных колонн UHPLC, например, колонны, упакованной на длину 50 см с сорбентом 1,9 мкм менее чем за 1 ч(рисунок 2).
Для демонстрации применения подхода FlashPack была подготовлена капиллярная колонка ID 30 см 100 мкм(таблица 6). Упаковка сорбента ReprosilPur C18 1,9 мкм была выполнена при 60 барах в капилляр излучателя длиной 50 см длиной 100 мкм ID, подготовленный лазерным съемщиком P2000. Капилляр упаковывали до ~40 см за 40 мин с еще одним рыхлым сорбентом, оставленным внутри капилляра. Упакованный капилляр был подключен к системе ВЭЖХ и работал со скоростью 300 нл/мин с растворителем B (80% ацетонитрила, 0,1% FA). После двух раундов по 5 с ультразвуком окончательная упакованная длина составила 43 см. Колонна была отсоединена, разрезана до 30 см и подключена к системе ВЭЖХ с помощью соединения UHPLC. Мы регулярно используем 360 мкм без рукавов с ореховым наконечником PEEK и 360 мкм из нержавеющей стали. Эта комбинация вмещает не менее 700 стержней, если сильно затянута. Изготовленная колонна имеет обратное давление 520 бар при 2% растворителе В при 500 нЛ/мин, что соответствует ожидаемому диапазону значений(таблица 5).
В качестве демонстрации эффективности колонны мы использовали изготовленную колонку 30 см для отделения 50 фмоль триптического дайджеста белка цитохрома С в 15-минутном градиенте от 2% до 50% В. Извлеченные ионные хроматограммы показали, что пики очень симметричны с минимальным хвостом. Средний FWHM составлял около 3 с(рисунок 3).
Таблица 1: Устранение неполадок при высоком рабочем обратном надавлии колонны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Программа лазерного съемника P2000/F. Программа лазерного съемника P2000/F для получения капилляров вытягиваемого излучателя от 360 мкм OD 100 мкм ID расплавленных капилляров с полиимидным покрытием кремнезема без внутреннего покрытия при комнатной температуре 23-25 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Специфические для FlashPack вопросы упаковки и контрольные точки для контроля в процессе упаковки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Примерные скорости упаковки и рабочего потока для различных идентификаторов колонок и длины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Ожидаемое обратное давление для колонки, заполненной сферическими сорбентами 2 μм и работающей со скоростью рабочего потока (согласно идентификатору столбца) в системе растворителей RP на RT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 6: Примерная упаковка 30 см колонки UHPLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1:Схема упаковки капиллярной колонны. Этапы с 1 по 3 являются подготовительными, за которыми следует упаковка бомбы под давлением и завершается упаковкой ВЭЖХ. Этапы 3 и 4 модифицированы для сверхэффективного протокола FlashPack. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Скорость упаковки для фритированного капилляра 100 мкм ID с ReprosilPur C18 AQ 1,9 мкм при 100 барах метанола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Экстрагированные ионные хроматограммы триптических пептидов цитохрома С. Экстрагированные ионные хроматограммы триптических пептидов цитохрома С после разделения 50 фмоль в 30 см длиной 100 мм ID вытягиваемой излучательной капиллярной колонкой, упакованной ReprosilPur C18 AQ 1,9 мкм в градиенте буфера B (80% ацетонитрила, 0,1% FA) и в буфере A (2% ацетонитрила, 0,1% FA) от 2% до 40% B через 15 мин при 500 нл/мин при RT. Обнаружение проводили с помощью масс-спектрометра. Абсолютные интенсивности и извлеченные диапазоны m/z для каждого пептида показаны справа от спектров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Упаковка капиллярных колонн на дому очень популярна в крупных лабораториях, работающих над несколькими независимыми проектами. Однако распространенный метод упаковки из суспензии сорбента низкой концентрации имеет серьезные ограничения в скорости и не может производить длинные колонны UHPLC.
FlashPack является модификацией стандартной процедуры упаковки, которая делает возможной упаковку с очень высокой концентрацией сорбента. Теоретическая основа метода заключается в непрерывной дестабилизации купола сорбента на входе в колонну на протяжении всего срока упаковки. Последнее технически достигается за счет непрерывного удара по входу в колонну магнитным стержнем. Метод дестабилизации купола намеренно разработан, чтобы иметь настройку упаковки, полностью похожую на обычный процесс упаковки, но хитрость FlashPack заключается в деталях приготовления сорбентной суспензии, капиллярного позиционирования и использования магнитного стержня в процессе упаковки.
Сорбентная суспензия получают в виде слоя сорбента осадка в большом объеме растворителя. Интересно, что упаковка на основе бомбы под давлением не требует одинаковых условий упаковки для колонки к колонке. В FlashPack мы никогда не знаем точную концентрацию сорбентной суспензии вокруг входа в колонну. Его невозможно точно измерить и контролировать, так как он также изменяется в процессе упаковки. Тем не менее, конечные колонки по-прежнему очень воспроизводимы4 независимо от того, как была достигнута упаковка.
Основа быстрой упаковки лежит в эффективной дестабилизации купола сорбента. По этой причине важно контролировать поступление сорбента в капилляр и поддерживать оптимальные условия дестабилизации купола на протяжении всего срока упаковки. Существует несколько возможных проблем, которые могут помешать эффективной доставке сорбента. Некоторыми примерами этого являются успендирование слоя сорбента быстрым вращением магнитного стержня, неэффективная дестабилизация купола из-за неправильного относительного капилляра к позиционированию магнитного стержня или слишком медленного вращения магнитного стержня. Сами вопросы и способы их решения подробно обсуждаются в разделе протокола.
После упаковки столбца основным параметром столбца, который необходимо проверить, является обратное давление столбца. Значения давления, перечисленные в таблице 5, обеспечивают ориентир на то, что ожидается для одного из популярных сорбентов размером шарика 2 мкм - ReproSil PUR C18 AQ (1,9 мкм). В то же время дополнительное обратное давление может быть добавлено фритом или слишком узкотянутым излучателем, и за этим следует постоянно следить. Если упаковка производится в вытащенный излучатель, мы все равно предлагаем измерить ожидаемое давление в колонке для конкретного сорбента, сначала упаковав фритированные капилляры, а затем посмотреть, добавляет ли самособирающийся фрит слишком много. Для любых проблем с высоким давлением используйте руководящие принципы, приведенные в таблице 1, чтобы точно определить проблему.
По нашему опыту, упакованная колонна без обесцвечивания, зазоров и с надлежащим обратным давлением работает в 100% случаев и дает качество разделения, близкое к тому, что можно ожидать от длины колонны и характеристик сорбента. Колонка с обесцвечиванием не гарантирует правильной работы, но все же может дать удовлетворительные результаты.
В большинстве случаев, если есть какие-либо проблемы с качеством сепарации, они исходят не из самой колонны, а скорее из других частей системы разделения, а именно насосов, растворителей или соединений. Особенно потенциально вредны любые соединения после столбца. Плохая связь с мертвым объемом между излучателем и фритированной колонной приводит к значительному пиковой расширяющейся и хвостохранилищу из-за очень низких скоростей потока в капиллярной хроматографии.
Еще одна важная проблема, характерная для подхода FlashPack, заключается в том, что он использует много дорогих сорбентов в рабочем флаконе сорбента. Пожалуйста, помните, что сорбентная суспензия в FlashPack предназначена для многократного использования. Позаботьтесь о сорбенте. Избегайте ненужного перемешивания магнитного стержня, чтобы уменьшить измельчение сорбента - не забудьте остановить вращение, как только упаковка будет закончена. И не оставляйте открытый флакон сорбента в бомбе давления, чтобы избежать высыхания сорбента. Хотя сорбент все еще можно использовать после этого, требуется время, чтобы переделать сорбентную суспензию.
Метод одинаково хорошо работает как для фритированных капилляров, так и для капилляров с вытягиваемым излучителем. Принцип FlashPack увеличивает скорость упаковки капиллярных идентификаторов с 20 до 250 мкм (все меньше и больше не тестировались). Он также применим ко всем сорбентам, как полностью, так и поверхностно пористым, которые мы могли бы проверить (отражая, что образование купола сорбента в высокой концентрации сорбентной суспензии не ограничивается конкретно сорбентами RP). Кроме того, параметры растворителей явно влияют на упаковку в соответствии с их физико-химическими характеристиками. Например, менее вязкий ацетон дает еще более высокую скорость упаковки, чем метанол при том же давлении упаковки. Однако он также менее полярный, чем метанол, и уменьшает частицы сорбента, прилипающие друг к другу. Эффект сам по себе предотвращает образование купола сорбента в начале упаковки, когда расход еще высок. Однако снижение взаимодействия частиц сорбента также приводит к менее надежному самособирательной образованию фрита и более частой блокировке вытягиваемого конца во время упаковки. Таким образом, в то время как ацетон лучше подходит для упаковки фритированных капилляров, он менее подходит для капилляров с вытягиваемым излучателем, причем метанол в качестве растворителя суспензии медленнее, но подходит для обоих типов окончаний. Упаковка из гексана или дихлорметана (DCM) является крайним случаем перехода на ацетон из метанола: они еще менее полярны, поэтому полностью предотвращают образование купола сорбента, однако они вообще не пригодны для упаковки вытягивающим излучателем. Кроме того, было отмечено, что крайне низкая полярность DCM приводит к тому, что частицы сорбента прилипают к внутренней стенке капилляра и делают на ней толстый слой. Толщина слоя постепенно увеличивается и образуются случайные локальные блоки, в результате чего колонна упаковывается в несколько частей, разделенных областями без сорбента. Такой эффект наблюдался для сорбента C18 Peptide Aeris.
Еще одна наблюдаемая проблема заключалась в том, что сорбент YMC Triart C18 не суспендировался в метаноле должным образом, а образовывал какие-то хлопья. Тем не менее, это не мешает ему быть упакованным с FlashPack и давать очень приличную эффективность разделения (неопубликованные данные). Таким образом, не будучи оптимальным для некоторых случаев, метанол был наиболее универсальным растворителем для работы для всех испытанных сорбентов и колонок. Необходимо отметить, что мы еще не анализировали, как различные растворители суспензии влияют на эффективность разделения колонн. При этом эффективность колонок, упакованных из метанола, уже полностью равна коммерческим колонкам для тех же сорбентов4.
FlashPack - не единственный существующий подход к улучшению скорости упаковки колонок UHPLC. Быстрая упаковка из высокой концентрации сорбента также возможна при использовании упаковки сверхвысокого давления7. Преимущество FlashPack в том, что он намного проще, так как не требует специальных насосов сверхвысокого давления и бомб давления для подачи сорбента и капиллярных соединений. В то же время было продемонстрировано, что колонны, упакованные при экстремальных давлениях, могут иметь эффективность разделения выше, чем более низкие давления упакованные колонны17. И хотя FlashPack производит колонки, идентичные коммерческим, используемым в сравнении4,для которых мы не знаем метод упаковки, он еще не был протестирован, как колонки FlashPack противостоят упаковочным колоннам сверхвысокого давления.
Таким образом, описанный метод FlashPack может быть легко адаптирован к существующему протоколу упаковки в лаборатории с некоторыми изменениями, внесенными в протокол, в то время как настройка остается полностью прежней. Это ускоряет упаковку капиллярной колонны ВЭЖХ до нескольких минут и позволяет производить длинные капиллярные колонны UHP, что явно невозможно при стандартной процедуре упаковки. Общая экономия времени и денег для лаборатории за счет применения подхода FlashPack может исчисляться десятками тысяч евро в год. Кроме того, возможность локального производства капиллярных колонн UHP открывает возможности для экспериментальной настройки, невозможной с доступными коммерческими продуктами.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантом РНФ 20-14-00121. Авторы благодарят. В. Шляху (Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга) за плодотворные дискуссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021).
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
